Extracto
P73, un miembro de la familia p53 supresor de tumores, las acciones estructurales y altamente similitud funcional de p53. Al igual que p53, la TAp73 transcripcionalmente activa puede mediar la respuesta celular a los agentes quimioterapéuticos en células cancerosas humanas por hasta la regulación de la expresión de sus genes diana pro-apoptóticos como PUMA, Bax, NOXA. Aquí, demostramos un nuevo mecanismo molecular de la apoptosis mediada por TAp73 en respuesta a cisplatino en las células de cáncer de ovario, y que era independientemente del estado de p53. Se encontró que TAp73 actuó como un activador de la quinasa c-Jun N-terminal (JNK) y la vía de señalización hasta la regulación de la expresión de su detención del crecimiento de destino y el daño de ADN-inducible GADD45 proteína alfa (GADD45α) y, posteriormente, la activación por mitógeno proteína quinasa activada quinasa-4 (MKK4). La inhibición de la actividad de JNK por un inhibidor específico o pequeños ARN de interferencia (siRNA) abrogadas significativamente la apoptosis mediada por TAp73 inducida por cisplatino. Además, la inhibición de GADD45α por siRNA inactivado actividades MKK4 /JNK y también bloqueó la inducción de apoptosis TAp73 mediada por cisplatino. Nuestro estudio ha demostrado que TAp73 activa la JNK vía de señalización apoptótica en respuesta a cisplatino en las células de cáncer de ovario
Visto:. Zhang P, Liu SS, Ngan HYS (2012) TAp73 mediada por la activación de c-Jun N -terminal quinasa celular mejora la quimiosensibilidad al cisplatino en células de cáncer de ovario. PLoS ONE 7 (8): e42985. doi: 10.1371 /journal.pone.0042985
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Febrero, 2012; Aceptado: July 16, 2012; Publicado: 10 Agosto 2012
Copyright: © Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado conjuntamente por el Wong Verificar Ella Fundación de Beneficencia y el fondo de investigación del Departamento de Obstetricia y Ginecología, de la Universidad de Hong Kong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
P73, un nuevo miembro de la familia p53 supresor de tumores, es similar a p53 tanto estructural como funcionalmente [1], [2]. El gen p73 codifica más de 20 isoformas de la proteína debido al uso de diferentes promotores y empalme alternativamente post-transcripcional. Las isoformas TAp73 transcripcionalmente activos, que contienen dominio de transactivación completo N-terminal, pueden unirse específicamente a elementos de respuesta a p53 y transactiva algunos de los genes diana de p53, y posteriormente inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis, mientras que las isoformas DNp73, con truncada de transactivación N-terminal dominio, actúa como un inhibidor dominante negativo tanto de TAp73 y p53 [1], [3], [4]. Curiosamente, TAp73 es también un mediador de la sensibilidad celular a los agentes quimioterapéuticos en células cancerosas humanas [1], [4] - [7]. Muchos de los genes pro-apoptóticos, tales como PUMA, Bax y NOXA, actúan como activadores de la vía mitocondrial de apoptosis, y tienen elementos de respuesta a p73 en su promotor y pueden ser hasta reguladas por p73 para inducir la apoptosis en respuesta a los fármacos quimioterapéuticos. Además, p73 mediada por la regulación de la CD95, receptor de muerte, un mediador de la apoptosis vía extrínseca, que también contribuye a la apoptosis mediada por p73-en las células cancerosas en virtud de estímulos de estrés [8]. Sin embargo, a diferencia de p53, los mecanismos moleculares que implican en la apoptosis celular p73 mediada aún no se comprenden con claridad. La comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes precisas será útil en la orientación de p73 como un buen gen candidato para la terapia del cáncer
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El JNK pertenece a una superfamilia de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAP). Las proteínas quinasas JNK contienen Jnk1, Jnk2 y Jnk3. Jnk1 y Jnk2 son ubicuamente detectable. El Jnk3 está restringido principalmente a cerebro, el corazón y los testículos [9]. La señalización de las respuestas de la vía a diversos estímulos de estrés JNK, a través de la transducción de la MAPKKK aguas arriba incluyendo MEKK, y posteriormente la activación de JNK por fosforilada en sitios Thr y Tyr por las JNK quinasas aguas arriba directos MKK4 /MKK7. La activación de JNK fosforila y activa el factor de transcripción aguas abajo c-Jun y otros factores de transcripción [9], [10]. La vía de señalización de JNK actúa como un modulador positivo clave de la respuesta apoptótica de células subrayar estímulos [9] - [11]. Además, la vía de señalización de JNK contribuye críticamente a la apoptosis dependiente de cisplatino en células de cáncer [12] - [15]
En este estudio, nos propusimos estudiar el efecto de TAp73 (TAp73α) en la respuesta celular a. cisplatino en células de cáncer de ovario y los mecanismos moleculares subyacentes. Estábamos interesados en saber si TAp73 tendría ningún papel regulador en otras vías de apoptosis, como la vía de señalización de JNK, tras el tratamiento con cisplatino.
Resultados
TAp73α aumenta la sensibilidad celular a cisplatino en las células de cáncer de ovario
para investigar el papel de TAp73 en células de cáncer de ovario en respuesta a cisplatino, líneas celulares de cáncer de ovario resistentes al cisplatino humanos SKOV3 (null-p53) y OVCA433 (p53 de tipo salvaje) se transfectaron de forma estable con el plásmido pEGFP -TAp73α (Figura 1A). El efecto de TAp73α en la respuesta celular al cisplatino se evaluó tanto por ensayo de viabilidad celular XTT y ensayo clonogénico. Como se muestra en la Figura 1B y 1C, TAp73α aumentó significativamente la sensibilidad celular a cisplatino en tanto null-p53 SKOV3 y células p53 OVCA433 de tipo salvaje, en comparación con los controles de vector. No se observó tal efecto, tanto a corto plazo (mediante el ensayo XTT) y largo plazo (mediante ensayo clonogénico) ensayos de cultivo. Además, la apoptosis celular inducida por cisplatino también se incrementó por la sobre expresión de TAp73α, como se evidencia por el ensayo de TUNEL y el análisis de la expresión de PARP escindida (Figura 2A y 2B). Estos resultados indicaron que TAp73 promovió la sensibilidad celular a cisplatino a través de la inducción de la apoptosis de las células, y dicha función TAp73 era independiente de p53, ya que los efectos fueron similares tanto en células p53 y null-p53 de tipo salvaje
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( A) La sobreexpresión de GFP-TAp73α clones estables en SKOV3 (C8, C24 y C28) y OVCA433 (C1, C7 y C12) las células se verificó mediante análisis de transferencia Western. (B y C) Tanto ensayo de viabilidad XTT y ensayo clonogénico mostraron una reducción significativamente la proliferación celular en las células sobreexpresados-TAp73α de SKOV3 y OVCA433 en comparación con los controles de vector vacío (V) en respuesta al tratamiento con cisplatino. El porcentaje de células /colonias supervivientes en cisplatino respecto a las células /colonias en el control de medio libre de fármaco se midió. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (*: p & lt; 0,05; **: p & lt; 0,01) guía empresas
células sobreexpresados-TAp73α (A) (SKOV3 C8, C24 y C28 y. OVCA433 C1, C7 y C12) y los controles de vector vacío (V) de SKOV3 y OVCA433 fueron tratados con 4 mg /ml de cisplatino durante 48 h. Las células apoptóticas se evaluaron mediante el ensayo de TUNEL. Se contaron más de 500 células para cada grupo, los resultados presentados eran la relativa de las células apoptóticas con las células totales y se realizaron al menos tres experimentos independientes (**: p & lt; 0,01). células sobreexpresados-TAp73α (B) y controles de vectores vacíos fueron tratados con diferentes dosis (indicadas) de cisplatino durante 24 h, y la división de PARP se detectó por Western blot.
TAp73α media la activación de vía de señalización de JNK
informes anteriores han demostrado que la activación de JNK contribuye críticamente a la apoptosis inducida por cisplatino celular [12] - [15]. por lo tanto la hipótesis de que la apoptosis celular mediada por TAp73α en respuesta a cisplatino podría actuar a través de la activación de la vía de señalización de JNK. El efecto de TAp73α en la activación de las señales de JNK se analizó en primer lugar mediante la medición del nivel de fosforilación de JNK (p-JNK) y su (p-c-Jun) sustrato junio c-en células sobreexpresados-TAp73α. Como se muestra en la Figura 3A, tanto p-JNK y p-c-Jun fueron obviamente elevados en células sobreexpresados-TAp73α, en comparación con las células de control. El aumento de p-JNK y p-c-Jun se aumenta aún más en estas células en respuesta a cisplatino, sólo un ligero aumento de p-JNK y p-c-Jun se observó en las células de control. El tiempo y dependientes de la dosis experimentos demostraron que la activación de JNK inducida por cisplatino se produjo en tan pronto como 6 h, y hasta 48 h después de que las células tratadas con 4 mg /ml de cisplatino, y la dosis de cisplatino eficaces para la activación de JNK estaba en un precio tan bajo como 2 g /ml para el tratamiento de 12 h en células sobreexpresados-TAp73α (SKOV3 C8; OVCA433 C1; Figura 3B). Además, la activación de JNK era dependiente de la actividad de transactivational TAp73α como el nivel de p-JNK no se ha modificado en las células de manera estable sobre-expresión de DNp73α (Figura 3C y 3D), una isoforma truncada de p73 sin actividad de transactivación. Para verificar si el efecto de la sobreexpresión TAp73α en la promoción de la sensibilidad celular era específico para el cisplatino, también se realizaron los experimentos similares con el tratamiento de Taxol, que es también un medicamento contra el cáncer de primera línea que se utiliza para el tratamiento de cáncer de ovario. Se encontró que el Taxol no fue capaz de activar la vía de JNK en TAp73 sobreexpresa células de cáncer de ovario, aunque podrían TAp73α mejorado la sensibilidad de las células en respuesta a Taxol (Figura S1).
(A) Aumento de p-JNK y pc -jun se detectó en las células sobreexpresados-TAp73α (SKOV3 C8, C24 y C28 y OVCA433 C1, C7 y C12) y aún más mejorada en el tratamiento con cisplatino (4 mg /ml para 24 h), en comparación con los controles (P: células parentales ; V: control de vector vacío). células sobreexpresados-TAp73α (B) (SKOV3 C8 y OVCA433 C1) se expusieron a 4 mg /ml de cisplatino durante diferentes periodos de tiempo, o a diferentes dosis de cisplatino para 12 h. El nivel de p-JNK se midió mediante análisis de transferencia Western. (C) DNp73α (GFP-DNp73α) era células sobreexpresados en SKOV3 (D2) y OVCA433 (D18). (D) No se observó la activación de JNK en células sobreexpresados-DNp73α (SKOV3 D2 y OVCA433 D18).
La inhibición de la actividad de JNK atenúa la apoptosis mediada por TAp73α en respuesta a cisplatino
Para explorar adicionalmente si TAp73α mediada por la activación de JNK contribuyó a la inducción de apoptosis en respuesta a cisplatino, un inhibidor específico de la actividad de la quinasa JNK, SP600125, se utilizó. Después del tratamiento de 20 SP600125 M durante 8 horas, el nivel de p-JNK se redujo hasta el 60% en las células sobreexpresados-TAp73α (SKOV3 C8 y OVCA433 C1, Figura 4A). Además, la inhibición de la activación de JNK por SP600125 reduce significativamente la apoptosis celular inducida por cisplatino en células sobreexpresados-TAp73α, como se evidencia por el ensayo TUNEL y se escindió análisis de la expresión de PARP (Figura 4B y 4C).
(A) TAp73α- células sobreexpresados (SKOV3 C8 y OVCA433 C1) fueron tratados con SP600125 20 M durante diferentes períodos de tiempo (indicado). Se midieron los niveles de fosforilación de JNK y c-jun. (B y C) células sobreexpresados-TAp73α (SKOV3 C8 y OVCA433 C1) y los controles de vector vacío (V) se trataron con SP600125 20 M o DMSO y luego con cisplatino. La apoptosis de las células se evaluó por el ensayo de TUNEL (barras de error indican media ± SD de tres experimentos independientes; *: p & lt; 0,05) y la escisión de análisis PARP. La inhibición de JNK atenúa la apoptosis mediada por TAp73α en respuesta a cisplatino. células sobreexpresados-TAp73α (D) (SKOV3 C8 y OVCA433 C1) fueron tratados con JNK siRNAs (Si-JNK) o el control mezclado siRNA (Control). Las activaciones de JNK y c-Jun estaban ausentes en el tratamiento con cisplatino, y asociados con marcada reducción de la apoptosis de células (E y F).
La activación de la vía de JNK por TAp73α implicado en la apoptosis inducida por cisplatino fue también se demuestra por la observación de que el silencio de JNK1 y -2 en células sobreexpresados-TAp73α bloquearon significativamente la muerte celular inducida por cisplatino. Como se muestra en la Figura 4D, el tratamiento de siRNAs contra JNK1 y -2 en las células cancerosas (SKOV3 C8; OVCA433 C1) obviamente regulado down-2 expresión /JNK1 en comparación con los controles siRNA revueltos, y el tratamiento posteriormente suprimió los niveles de fosforilación de JNK y su sustrato c-jun. Como se desprende de ensayo de TUNEL y el análisis de la expresión de PARP escindido, la apoptosis inducida por cisplatino en las células sobreexpresados-TAp73α (SKOV3 C8; OVCA433 C1) fue significativamente atenuada por JNK silenciamiento de tratamiento (Figura 4E y 4F). Estos resultados confirmaron además que la activación de JNK por vía TAp73α contribuyó a la apoptosis mediada por TAp73α en células de cáncer de ovario en respuesta a cisplatino.
TAp73α mediada sobre regulación de GADD45α es responsable de la activación de la vía de señalización de JNK
GADD45α ha sido identificado como una pareja de unión y el activador de la quinasa aguas arriba JNK MEKK4 /MTK1, y su unión a MEKK4 /MTK1 puede activar el MKK4 gen aguas abajo y JNK [17], [18]. Por otro lado, GADD45α es un gen bien definido objetivo de p73 [19], [20]. Por lo tanto, la hipótesis de que GADD45α podría desempeñar un papel en la activación de la vía de señalización de JNK mediada por TAp73. Se evaluó el efecto de la primera TAp73 sobre la expresión GADD45α. Como se muestra en la Figura 5A y 5B, la expresión de GADD45α fue hasta reguladas tanto en los niveles de proteína en las células ARNm y sobreexpresados-TAp73α. En respuesta a cisplatino, TAp73α mediada por la regulación de la proteína GADD45α se incrementó aún más (Figura 5B). Como GADD45α puede interactuar directamente con MEKK4 /MTK1 para activar su sustrato MKK4 quinasa [17], [18], que después se midió el nivel de fosforilación de MKK4 en las células sobreexpresados-TAp73α. Como se muestra en la Figura 5B, se observó aumento de MKK4 fosforilada en células sobreexpresados-TAp73α y mejora aún más en respuesta al tratamiento con cisplatino. Estos resultados sugieren que TAp73α medió la activación de la vía de señalización de JNK posiblemente a través de la regulación de su gen diana GADD45α y la posterior activación de MKK4, un componente de aguas arriba de la vía de señalización de JNK
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(A) Aumento de la expresión de mRNA GADD45α sobreexpresados en las células-TAp73α (SKOV3 C8, C24 y C28 y OVCA433 C1, C7 y C12). (B) Aumento de la expresión de la proteína GADD45α y el nivel de fosforilación en las células MKK4 sobreexpresados-TAp73α (SKOV3 C8, C24 y C28 y OVCA433 C1, C7 y C12). (C) GADD45α fue derribado en células sobreexpresados-TAp73α (SKOV3 C8 y OVCA433 C1) de siRNAs (Si1-GADD45α y Si2-GADD45α) de tratamiento. La activación de MKK4, JNK y c-Jun se disminuye, incluso bajo el tratamiento con cisplatino.
A fin de verificar estos hallazgos, un par de siRNAs contra GADD45α (Si1-GADD45α y Si2-GADD45α) era se utiliza para knockdown transitoriamente la expresión GADD45α. Los niveles de fosforilación de MKK4, JNK y c-Jun se redujeron en consecuencia de la baja regulación de GADD45α, incluso en respuesta al tratamiento con cisplatino (Figura 5C). Por lo tanto, se confirmó que TAp73α mediada sobre regulación de GADD45α fue responsable de la activación de la vía de señalización de JNK en células de cáncer de ovario.
GADD45α es responsable de la apoptosis mediada por TAp73α
Para determinar si el silencio de GADD45α tiene un efecto sobre la apoptosis inducida por cisplatino en células sobreexpresados-TAp73α, las células fueron tratadas con GADD45α siRNAs y se midió la apoptosis celular. Como se muestra en la Figura 6, la apoptosis inducida por cisplatino se redujo dramáticamente en las células sobreexpresados-TAp73α silenciados-GADD45α (SKOV3 C8; OVCA433 C1). Estos resultados sugirieron que TAp73α mediada por la regulación de GADD45α era responsable de la activación de la vía y la apoptosis celular en células de cáncer de ovario señalización de JNK.
apoptosis celular se redujo en las células sobreexpresados-TAp73α (C8 y SKOV3 OVCA433 C1) en respuesta a cisplatino después del tratamiento GADD45α siRNAs. La apoptosis de las células se midió por (A) ensayo de TUNEL (barras de error indican la media ± SD de tres experimentos independientes; *: p & lt; 0,05; **: p & lt; 0,01) y (B) la escisión de ensayo PARP
Discusión
en este estudio, hemos demostrado que, por primera vez, a nuestro conocimiento, TAp73 mediada parcialmente la apoptosis celular en respuesta a cisplatino a través de la activación de la vía de señalización de JNK en células de cáncer de ovario. Se encontró que, en respuesta a cisplatino, TAp73α activa la vía de señalización a través de la regulación de su gen aguas abajo GADD45α JNK, y la respuesta fue TAp73-dependiente y independiente de p53.
Establecido pruebas ha demostrado que la transcripcionalmente activo TAp73 mejorado la sensibilidad celular a cisplatino fármaco quimioterapéutico en células de cáncer humano [5] - [7], [21]. Además, un informe reciente ha demostrado que la expresión TAp73 en los cánceres de ovario fue mucho más alta en los cánceres de respuesta en comparación con los cánceres que no responden [22]. Nuestro estudio confirma que TAp73 hizo aumentar la sensibilidad celular a cisplatino en las células de cáncer de ovario. Aunque TAp73 es funcionalmente similar a p53, la expresión de p53 funcional se ha demostrado que es necesario para la apoptosis de las células TAp73 mediada bajo estimulación daño en el DNA [23]. Por otra parte, algunos estudios sugieren que la quimiosensibilidad p73 mediada es independiente de la expresión de p53 en algunas células cancerosas [5], [24]. En nuestro estudio, se observó la apoptosis mediada por TAp73α en las células SKOV3 p53 nula, lo que indica que la apoptosis TAp73 mediada era independiente de p53, por lo menos en nuestro modelo celular, haciendo hincapié además en el papel independiente de p73 entre sus miembros de la familia en el daño del ADN respuesta.
Las funciones vía de la muerte celular JNK como un importante regulador de la apoptosis celular en respuesta a diversos estímulos de estrés y realmente juega un papel central en las vías de apoptosis, incluyendo extrínseca (receptores de muerte) [11] y intrínseca (mitocondrial ) vías [11], [25]. Estudios anteriores han demostrado que la activación mediada por cisplatino de la vía en células de cáncer de señalización de JNK contribuido críticamente a cisplatino dependiente de la apoptosis [12] - [15]. Sobre regulación de la expresión de Fas L resultado de la activación de JNK y su sustrato c-Jun jugó un papel clave en la apoptosis inducida por cisplatino en las células de cáncer de ovario [15]. Nuestros resultados mostraron que JNK y su sustrato c-Jun fueron activados en TAp73α células sobre-expresó y, además, aumentada en respuesta al tratamiento con cisplatino. Supresión de la activación de JNK inhibidor de JNK o JNK siRNAs en estas células abrogó la apoptosis mediada por TAp73α. Estos resultados sugieren que la regulación de la actividad de JNK contribuyó a la inducción de apoptosis mediada por TAp73 en células de cáncer de ovario en respuesta a cisplatino. Esta fue la primera vez para demostrar que TAp73 funcionó como un activador aguas arriba de la vía de JNK para activar señales JNK para inducir la apoptosis de las células.
Para profundizar en los mecanismos subyacentes por los cuales TAp73 regulados hasta el nivel de fosforilación de JNK, un gen diana p73 GADD45α era consciente. GADD45α es un gen bien definido aguas abajo de TAp73 y p53 [19], [20] y puede ser inducida por agentes de daños del ADN, y juega un papel importante en la inducción de la apoptosis [26]. Curiosamente, los estudios anteriores han demostrado que la activación de la vía apoptótica JNK por GADD45α estaba estrechamente implicada en la inducción mediada por GADD45α apoptosis [27], [28]. GADD45α interactuaba directamente con MEKK4 /MTK1 para activar el sustrato MKK4 quinasa, y por lo tanto un máximo de regular la activación de JNK, un evento que está implicado en la inducción de la apoptosis [17], [18]. Nuestro estudio ha demostrado que las expresiones de ambos GADD45α y MKK4 activo fueron hasta reguladas en las células sobreexpresados-TAp73α, y este efecto se ve aumentado después de la exposición cisplatino. Por otro lado, cuando GADD45α fue silenciado, se suprimieron las activaciones de MKK4, JNK y c-Jun, incluso en el tratamiento de cisplatino y la apoptosis inducida por cisplatino mediada por TAp73α también se bloqueó de manera significativa. Estos resultados indicaron que TAp73 fue capaz de activar la JNK vía apoptótica por hasta la regulación de la expresión GADD45α en células de cáncer de ovario en respuesta a cisplatino.
Curiosamente, informe anterior ha propuesto una diafonía entre la vía de JNK y p73, y sugirió que JNK era un regulador importante de la apoptosis mediada por p73 en respuesta a cisplatino [13]. Ellos mostraron que p73 era un sustrato de JNK quinasa. JNK p73 fosforilada en ciertos sitios para mejorar la actividad de transcripción p73 y la apoptosis mediada por p73 en células de cáncer en presencia de cisplatino. En el presente estudio, hemos demostrado que la sobre-expresión de TAp73 activa la actividad de JNK en células de cáncer de ovario, en respuesta a cisplatino. TAp73 actuó como un activador corriente arriba de la vía apoptótica JNK a través de la regulación de GADD45α, y la posterior activación de MKK4 (Figura 7). Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una nueva perspectiva a la diafonía entre p73 y la vía de JNK en respuesta apoptosis de las células.
agente de daño en el ADN, el cisplatino induce la acumulación TAp73 y la posterior regulación de sus genes diana pro-apoptóticos para inducir la apoptosis de las células. Al mismo tiempo, la regulación del gen diana TAp73, GADD45α activa la apoptosis vía de JNK a través de su interacción con MEKK4 /MTK1 para inducir apoptosis.
En conjunto, nuestros resultados apoyan claramente una nueva vía de TAp73 mediada celular sensibilidad al cisplatino en las células de cáncer de ovario. Hemos demostrado que TAp73α indujo la respuesta apoptótica a través de la activación de la cascada de muerte celular GADD45α-MKK4-JNK y proporcionó un escenario novedoso para la diafonía entre p73 y JNK la vía apoptótica bajo tensiones. Esta respuesta celular TAp73-dependiente y independiente de p53 podría jugar un papel importante en la respuesta al daño de ADN en células de cáncer de ovario, como la función de p53 era defectuoso en la mayoría de las células cancerosas. Una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes en la respuesta apoptótica mediada TAp73 es valiosa en la orientación de p73 como un gen candidato terapéutico.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamiento de drogas
líneas celulares de cáncer de ovario humano SKOV3 (p53 null) y OVCA433 (p53 de tipo salvaje) eran el regalo del Prof. Tsao, Departamento de Anatomía de la Universidad de Hong Kong, donde SKOV3 se obtuvo de la ATCC, Manassas, VA [29], y OVCA433 se estableció y se describe anteriormente [30]. Se mantuvieron en medio esencial mínimo (MEM) (Invitrogen Corporation, Grand Island, YN), con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen), y se incubaron en un incubador humidificado 37 ° C que contiene 5% de CO
2.
Cis-Diamineplatinum (II) dicloruro (cisplatino, CDDP) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), y el inhibidor SP600215-JNK específico (Calbiochem, San Diego, CA) se disolvieron en milli- agua Q y sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma), respectivamente, y luego se almacenaron a -20 ° C. Estas soluciones se diluyeron adicionalmente en medio de cultivo antes del tratamiento celular. DMSO se diluyó en medio solo como control.
plásmidos, siRNA y transfección
Los plásmidos pEGFP-TAp73α y pEGFP-DNp73α se construyeron mediante amplificación por PCR de la región de longitud completa de la codificación y TAp73α DNp73α de ADNc de células de cáncer de ovario. Y los productos de la PCR fueron digeridos y luego se clonan en marco en el vector de expresión pEGFP (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Para los clones estables, los transfectantes pEGFP-TAp73α y pEGFP-DNp73α fueron seleccionados por G418 (Invitrogen) durante 14 días y luego se recogieron las colonias individuales y verificados por análisis de transferencia Western. Los siRNAs contra JNK y GADD45α y el siRNA revueltos (control negativo) (Applied Biosystems por Life Technologies, Foster City, CA) se transfectaron a las células a una concentración final de 20 nM. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) se utilizó para la transfección de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
RT-PCR
ARN total de las células se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen), y el ADNc fue sintetizado con alta Capacidad de RNA a cDNA Maestro kit Mix (Applied Biosystems). Los cebadores específicos (GGAGGAAGTGCTCAGCAAAG y TCCCGGCAAAAACA AATAAG) se utilizaron para amplificar GADD45α cDNA humano.
análisis de transferencia de Western
Se recogieron las células con 0,05% de tripsina /EDTA (Invitrogen) y las proteínas se extrajeron mediante convencional RIPA tampón de lisis [16]. Los anticuerpos contra la GFP, JNK y GADD45α se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra MKK4, PARP y c-Jun y las formas activas de JNK, c-Jun (Ser63) y MKK4 se obtuvieron de Tecnologías de Señalización Celular (Beverly, MA).
Análisis de la viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó mediante XTT (2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] 2H -tetrazolium-5-carboxanilida sal interna) kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos y se trataron con cisplatino (4 mg /ml) en el día siguiente. La viabilidad celular se midió después de un día de tratamiento durante cuatro días consecutivos.
ensayo clonogénico
La capacidad de formación de colonias de células se midió mediante ensayo clonogénico. Las células se sembraron por triplicado en medio que contenía cisplatino (0,15 g /ml) o medio libre de fármaco a una concentración de 500 células por pocillo en placa de 6 pocillos. Después de 48 h de incubación, todas estas células se dejaron crecer en medio libre de fármaco durante 10-12 días. Las colonias supervivientes se fijaron en 75% de etanol y luego teñidas en 1% de Giemsa (Merck, Damstadt, Alemania). se contaron las colonias que constan de más de 50 células.
Apoptosis ensayo
Las células apoptóticas fueron examinados mediante el ensayo de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron sembradas en cubreobjetos de un día antes de tratamiento con cisplatino 4 mg /ml durante 48 h. Después de la fijación y permeabilización, las células se tiñeron con TUNEL mezcla de reacción, y por contraste con DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenilindol) (Sigma).
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± SD de tres experimentos independientes. el software SPSS 16.0 (SPSS) se utilizó para el análisis de datos. se utilizó la prueba t de Student para evaluar la diferencia entre los grupos. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Apoyo a la Información
Figura S1..
TAp73α mejorado la sensibilidad celular a Taxol, pero no a través de la vía de JNK. (A) ensayo de XTT viabilidad mostró células sobreexpresados-TAp73α de SKOV3 y OVCA433 eran más sensibles al tratamiento con taxol, en comparación con los controles de vector vacío (V). (B) Después de cisplatino o tratamiento con taxol durante 24 h, el nivel de fosforilación de JNK no fue mayor en SKOV3 y OVCA433 células tratadas con Taxol, incluso con TAp73α células sobre-expresión (C: control; D: cisplatino: T50 y T500: 50 ng /ml y 500 ng /ml de Taxol)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0042985.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
agradecemos al Prof. SW Tsao , Departamento de Anatomía de la Universidad de Hong Kong para proporcionar las líneas celulares de cáncer de ovario y OVCA433 SKOV3.