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PLOS ONE: Targeted suministro de agentes quimioterápicos a través de un aptámero específico del cáncer de hígado-


Extracto

Antecedentes

El uso de conjugados de anticuerpo /aptámero con las drogas puede ser un método prometedor para disminuir la toxicidad, al tiempo que aumenta la eficacia de la quimioterapia.

Metodología /Principales conclusiones

En este estudio, el agente antitumoral doxorrubicina (DOX) fue incorporado en el ADN modificado aptámero TLS11a-GC, que se dirige específicamente a LH86, una línea celular de carcinoma hepatocelular humano. las pruebas de viabilidad celular demostraron que los conjugados TLS11a-GC-Dox exhiben tanto la potencia como objetivo especificidad. Es importante destacar que, intercalando Dox en el aptámero modificado inhibe la absorción no específica de Dox membrana permeable a la línea de células no objetivo. Dado que los conjugados son selectivos para las células que expresan mayores cantidades de proteínas diana, ambos criterios señalados anteriormente se cumplen, por lo que TLS11a-GC-Dox conjuga candidatos potenciales para la ejecución selectiva a las células de cáncer de hígado.

Conclusiones /Importancia

Teniendo en cuenta el gran número de aptámeros disponibles que tienen objetivos específicos para una amplia variedad de células cancerosas, este nuevo método de intercalación aptámero drogas tendrá implicaciones prometedoras para quimioterápicos en general

Visto:. Meng L, Yang L, Zhao X, Zhang L, Zhu H, Liu C, et al. (2012) Dirigida suministro de agentes quimioterápicos a través de un aptámero específico del cáncer de hígado-. PLoS ONE 7 (4): e33434. doi: 10.1371 /journal.pone.0033434

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América

Recibido: 24 Octubre, 2011; Aceptó 8 de febrero de 2012; Publicado: 25 Abril 2012

Derechos de Autor © 2012 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) GM066137, GM079359 y CA133086. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

es bien conocido que los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer tradicionales pueden causar efectos secundarios graves por su toxicidad no específica. anticuerpos Para superar este problema y conseguir la administración específica de drogas, nuestro grupo y otros investigadores han utilizado [1], [2] o aptámeros [3], [4], [5], [6], [7], [8] , [9], [10] para diseñar conjugados de fármaco ligando ligado para aplicaciones de administración dirigida.

Los aptámeros son oligonucleótidos monocatenarios que pueden unirse específicamente a moléculas pequeñas, [11] péptidos y proteínas. [12] Los aptámeros no sólo proporcionar las ventajas de anticuerpos, tales como una alta especificidad y afinidad, pero también tienen baja inmunogenicidad y alta estabilidad, con facilidad de su síntesis y modificación. Recientemente, un proceso llamado de células-SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) se ha desarrollado para generar aptámeros para el reconocimiento específico de las células cancerosas diana, incluyendo las células T leucemia linfoblástica aguda (LLA de células T), de células pequeñas de cáncer de pulmón , cánceres de hígado y células infectadas por virus. [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19] Estos aptámeros son altamente específicos para diferentes tipos de células tumorales y tienen excelentes afinidades de unión. Debido a que los aptámeros proporcionan especificidad a nivel molecular, se cree que los conjugados aptámero con las drogas pueden mejorar la eficiencia de la administración de fármacos, mientras que al mismo tiempo, disminuir la toxicidad sistémica.

carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los la mayoría de los cánceres más comunes y mortales que existen. Que causa aproximadamente 600.000 muertes cada año. En la actualidad, los tratamientos para el cáncer de hígado temprano se han basado en el trasplante de hígado y la resección quirúrgica. La quimioterapia convencional no ha sido eficaz en pacientes con cáncer de hígado, y puesto que los agentes quimioterapéuticos no son específicos de las células de cáncer de hígado, los efectos secundarios tóxicos como resultado. En una publicación anterior, se informó el desarrollo de una serie de aptámeros específicos basados ​​en un modelo de ratón. [14] Uno de estos aptámeros también puede reconocer específicamente las células de cáncer de hígado humano, y que presenta aquí un nuevo diseño para la administración dirigida de la doxorubicina (Dox) a las células de cáncer de hígado.

doxorrubicina se ha utilizado para el tratamiento de cáncer de hígado en la forma de la administración localizada, pero su eficacia se ve impedida por los efectos secundarios tóxicos. Para superar este problema, hemos intercalado Dox en una sonda de aptámero modificado. Dox se conoce a intercalarse en la cadena de ADN por la presencia de anillos aromáticos planos en la molécula Dox. La investigación reciente ha demostrado que la doxorrubicina puede intercalarse en aptámero A10 para proporcionar la eficiencia de destrucción específica de las células del cáncer de próstata. [6], [20].

aptámero TLS11a fue seleccionado previamente por células-SELEX contra la línea celular de hepatoma de ratón BNL 1ME A.7R.1 (MEAR). [14] Fue elegido para esta aplicación, ya que mostró una gran afinidad de unión para LH86, una línea celular de cáncer de hígado. [21] Con el fin de lograr una mayor eficiencia de intercalación, se añadió una cola larga de GC TLS11a para formar un aptámero modificado, TLS11a-GC. A través de la interacción, la relación entre doxorubicina y TLS11a-GC era 25:1. En consecuencia, la eficacia de administración de doxorrubicina fue mucho más alta en comparación con el original de TLS11a. Además,

e in vitro
in vivo
experimentos mostraron que los conjugados TLS11a-GC-Dox tienen mucho mejor eficiencia específica de matar a las células cancerosas diana en comparación con DOX libre y de control conjugados aptámero-Dox.

resultados

la afinidad de unión de aptámeros TLS11a

aptámero TLS11a (Fig. 1a), se ha generado en contra de la línea de BNL 1ME A.7R.1 (MEAR) celular de hepatoma de ratón [ ,,,0],14] y mostró una fuerte afinidad de unión (Kd = 4,51 ± 0,39 nM). [14] La línea celular LH86 se estableció a partir de un paciente con cáncer de hígado. [21] Cuando se utilizó TLS11a para probar células LH86, se observó una capacidad de unión evidente (Fig. 1b). Además, cuando las células normales del hígado humanos, Hu1082, se ensayaron usando TLS11a, no se observó unión significativa (Fig. 1c). En la Fig. 1b y c, el histograma verde muestra la unión de fondo (aptámero de control, TD05), y las intensidades de fluorescencia de color rojo muestra la unión de TLS11a con las células diana y de control. En comparación con el aptámero de control, existe una diferencia significativa entre la fuerza de unión de TLS11a a las células LH86 y Hu1082. No se informó anteriormente sonda diferencia entre las células de cáncer de hígado y las células hepáticas normales humanos. Además, la Kd de TLS11a a LH86 era 7,16 ± 0,59 nM (Fig. 1d), en comparación con 4,51 ± 0,39 nM a BNL 1ME A.7R.1. [14].

(a) La estructura secundaria de aptámero TLS11a y su capacidad de unión a (b) LH86 y (c) células normales del hígado humanos, Hu1082. El histograma verde muestra la unión de fondo (aptámero de control, TD05), y las intensidades de fluorescencia de color rojo muestra la unión de TLS11a con las células diana y de control. Todas las sondas se marcaron con ficoeritrina-Cy5.5. (D) la determinación de Kd

imágenes inmunohistológica y microscopía de fluorescencia han sido ampliamente utilizados en el estudio de tumores sólidos.; por lo tanto, también se evaluó si TLS11a se podría utilizar para obtener imágenes de tumor con LH86, la línea celular positiva. Figura S1 muestra las imágenes confocal de LH86 detectaron con TLS11a y una secuencia de control, TD05 (Texto S1). No fue significativa potencia de la señal de TLS11a en comparación con el control negativo, y el patrón de señal muestra que los aptámeros se unen a la superficie de las células.

Por lo general se supone que los aptámeros seleccionados contra líneas de células se unen a la célula proteínas de membrana . Esto se ha demostrado en la mayoría de los protocolos de SELEX que implican líneas de células tumorales. [22], [23] Con el fin de investigar la molécula diana de TLS11a, se realizó un ensayo de proteasa, en el que las células LH86 se trataron con tripsina durante 10 minutos a 37 ° C. Después del período de incubación, la actividad de la proteasa se detuvo con la adición de PBS enfriado en hielo que contiene 20% de FBS. Las células se lavaron rápidamente dos veces por centrifugación y después se incubaron con los aptámeros. Como se muestra en la Figura S2, TLS11a perdió reconocimiento significativamente en las células tratados con tripsina (Texto S1). Las señales de fluorescencia reducen al fondo, lo que indica que el tratamiento de las células con las proteasas causó la digestión de la proteína diana, a su vez mostrando que la molécula diana de TLS11a es una proteína de membrana.

Un ensayo de internalización fue entonces realizado para determinar si TLS11a podría ser internalizado tras la unión de destino. LH86 células fueron incubadas con biotina o TLS11a TD05 marcado y luego incubadas con estreptavidina conjugada con PE-Cy5.5. A continuación, se retiró el tampón, y se añadió medio de cultivo con LysoSensor ™ verde DND-189 a las células y se incubó a 37 ° C durante dos horas. LysoSensor sirve como un indicador de la ubicación lisosoma en las células. Como se muestra en la figura S3, no estaba claro internalización del aptámero (Texto S1). La señal TLS11a originó desde el interior de las células y no en los márgenes exteriores, y es co-localizada con LysoSensor. La secuencia de control no mostró ninguna señal ya sea en el 4 ° C o 37 ° C ensayos. Los resultados sugieren que puede haber TLS11a unida a una proteína que podrían ser internalizado.

Conjugación y Estudio Propiedad de aptámero-Dox Complex

Dox se conoce intercalar dentro de la cadena de ADN por la presencia de anillos aromáticos planos, y preferentemente se une a-3 5'-GC secuencias de doble cadena 'o 5'-CG-3'. [24], [25]. La estructura secundaria de TLS11a, como se predijo por software NUPACK (http://www.nupack.org/), se muestra en la Figura 1a. De acuerdo con la estructura, hay dos-3 5'-GC 'o 5'-CG-3' secuencias en la secuencia de TLS11a de tal manera que una secuencia TLS11a puede intercalar un máximo de dos moléculas de doxorrubicina. Con el fin de intercalar más moléculas de doxorrubicina, se añadió una cola de GC de largo en el extremo 5 'de TLS11a para generar un aptámero modificado, TLS11a-GC (Fig. 2a). Debido a la larga cola GC, GC-TLS11a forma una estructura de dímero. Nupack cálculo indica que un dímero TLS11a-GC podría intercalar hasta 56 moléculas de doxorrubicina para producir una relación TLS11a-GC-a-doxorrubicina de 1:28. Una secuencia de control de aptámero, TD05, también se modificó con una larga cola GC para dar el mismo aptámero a la proporción de la doxorrubicina (Fig. 2b). A pesar de que los dímeros TLS1a-GC y TD05-GC podrían intercalarse hasta 28 Dox por aptámero, la relación entre el aptámero y la doxorrubicina se mantuvo a 1:25 en estos experimentos.

La intercalación de Dox en GC modificados aptámeros formaron conjugados físicas. (A) TLS11a-GC-Dox. (B) TD05-GC-Dox. (C) La extinción de la fluorescencia después de la intercalación Dox. La afinidad de unión (d) TLS11a-GC o (e) TD05-GC a las células LH86 vigila por medio de citometría de flujo. La señal de fluorescencia es de ficoeritrina-Cy5.5. Internalización de (f) Dox, (g) TLS11a-gc-Dox, y (h) TD05-GC-Dox observaron por microscopía confocal.

Es bien sabido que Dox tiene propiedades de fluorescencia, pero la intercalación de Dox en aptámero de ADN apaga la fluorescencia de Dox a causa de la formación de complejos de transferencia de carga entre las bases de ADN y el anillo de antraciclina. [26], [27], [28] Para examinar si dicha interacción se produce con TLS11a-GC modificado y TD05-GC aptámeros, fluorescencia fue adquirida por Dox en ausencia y en presencia de uno de los aptámeros (Fig. 2c) . La solución de DOX libre tenía la señal de fluorescencia más alta en comparación con el grupo negro (tampón de unión). Cuando se añadió aptámero modificado (TLS11a-GC o TD05-GC) a la solución Dox a una relación de 01:28 y se mezclaron bien, la fluorescencia se redujo drásticamente casi al nivel de fondo, lo que indica que la intercalación de Dox en aptámero de ADN es factible y rápida . Incluso después de la solución de complejo de aptámero-Dox se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 h, la fluorescencia se mantuvo igual, lo que indica que el complejo de aptámero-Dox es muy estable.

La afinidad de unión de TLS11a-GC se determinó por un método de competencia. Después de incubar con marcado TLS11a-GC, los sitios de unión en las células LH86 estaban completamente ocupados. Luego todas las células se incubaron adicionalmente con TLS11a marcado con colorante. Debido a que todos los sitios de unión en la membrana celular sin marcar fueron ocupados por TLS11a-GC, marcado con colorante TLS11a no pudo unirse a las células LH86, y después de lavar ninguna señal de fluorescencia se detectó (Fig. 2d). Al mismo tiempo, un experimento de competición entre TD05-GC y de tinte marcado TLS11a se llevó a cabo. Debido TD05-GC no se unió a LH86, los sitios de unión estaban disponibles para la interacción con TLS11a marcado con colorante, lo que resulta en una señal de alta fluorescencia (Fig. 2e). Después de la modificación de la larga cola de GC, la citometría de flujo de datos mostró claramente que TLS11a-GC todavía podría unirse a las células LH86, mientras TD05-GC no podía.

liberación de doxorrubicina se investigó mediante microscopía confocal. Después de 1 h de incubación con doxorubicina o conjugados de aptámero-Dox, las células se incubaron adicionalmente durante 3 horas a 37 ° C antes de formación de imágenes. Figura 2f muestra que las células tratadas con doxorubicina libre tenían el más doxorubicina en sus núcleos, mientras que los núcleos de las células tratadas con conjugados TLS11a-GC-Dox (Fig. 2g) también contenían doxorrubicina. Sin embargo, los núcleos de las células tratadas con conjugados TD05-GC-Dox (Fig. 2h) contenía casi no doxorrubicina. Este experimento confirma que los conjugados TLS11a-GC-Dox tenían afinidad de unión específica a las células en comparación con LH86 TD05-GC-Dox conjugados. Por otra parte, Dox podría ser liberado de conjugados TLS11a-GC-Dox después de la internalización y podría entrar en el núcleo.

La toxicidad celular de aptámero-Dox conjugados

La viabilidad de las células tratadas con LH86 de TLS11a-GC -DOX, TD05-GC-Dox, doxorrubicina, TLS11a-GC, o TD05-GC se ensayó y se comparó con la de las células no tratadas (Fig. 3a). La concentración de doxorubicina en TLS11a-GC-Dox, TD05-GC-Dox, doxorrubicina y libre se mantuvo a 7,5 M, y la relación de doxorubicina a aptámero era 25:1. La concentración de aptámero en el TLS11a-GC, GC-TD05, TLS11a-GC-Dox y grupos TD05-GC-Dox se mantuvo a 300 nM. A partir de los datos mostrados en la Figura 3a, TLS11a-GC y TD05-GC no tuvieron efecto significativo sobre la viabilidad celular. Es obvio que el tratamiento con conjugados de TLS11a-GC-Dox disminución de la viabilidad celular. La eficiencia de la toxicidad celular era doxorubicina & gt; TLS11a-GC-Dox & gt; TD05-GC-Dox. A pesar de que la toxicidad celular de TLS11a-GC-Dox era menor que la de la doxorrubicina libre, el efecto de toxicidad de TD05-GC-Dox era mucho más pobre. Otros experimentos utilizando Hu1229 células hepáticas humanas normales (Fig. 3b) mostraron que DOX libre tuvo una toxicidad significativa, mientras que TLS11a-GC-Dox y TD05-GC-Dox tenían una toxicidad similar y muy limitado. Estos datos demuestran que la especificidad de aptámero TLS11a-GC a las células LH86 toxicidad sólo estén dirigidos a células logra

(a) la viabilidad celular relativa de LH86 (línea celular diana).; (B) la viabilidad celular relativa de Hu1229 (células hepáticas normales humanos); (C) Hoechst 33258 tinción de células apoptóticas y muertas LH86 tratados con una serie de concentraciones de TLS11a-GC-Dox o TD05-GC-Dox; (D) los resultados de Western blot para la caspasa 3 escindida en las células LH86 tratados con una serie de concentraciones de TLS11a-GC-Dox o TD05-GC-Dox.

apoptosis celular se investigó mediante tinción Hoechst 33258 ( Fig. 3c). A partir de las imágenes de fluorescencia, cuando la concentración de Dox era de 60 mM, había más apoptosis y las células muertas en el grupo TLS11a-GC-Dox (35,1%) que en el grupo TD05-GC-Dox (13,7%), lo que indica adicionalmente la especificidad de conjugados de aptámero-dox. Además, la activación de la caspasa 3 se monitorizó mediante Western blot (Fig. 3d). La caspasa 3 juega un papel importante en la apoptosis celular, y la caspasa 3 escindida indica su activación. A partir de los datos mostrados, cuando la concentración de Dox era de 60 mM, la densidad de la banda de la caspasa 3 escindida en las células tratadas con TLS11a-GC-Dox era 3,3 veces mayor que en las células tratadas con TD05-GC-Dox.


En Vivo
Estudios

Treinta NOD. ratones IL2 CG-Prikdc (SCID) se trataron como se describe en la sección experimental. El tamaño del tumor de cada ratón se midió cada dos días, y el volumen medio del tumor se calculó (Fig. 4a). Los datos muestran que tanto libre Dox y complejo TLS11a-GC-DOX tenían efectos obvios inhibición del tumor en comparación con el grupo no tratado. Además, el complejo TLS11a-GC-DOX tuvo un efecto más eficiente en comparación con DOX libre, lo que indica que los conjugados TLS11a-GC-Dox dirigidos a las células tumorales y lograron una mayor concentración local de Dox en el sitio del tumor en comparación con libre Dox. También, se recogieron los tumores de cada ratón y se fijaron utilizando 10% de formalina durante 24 h. A continuación, todas las muestras fueron enviadas al laboratorio central patología molecular para H & amp; E tinción. Desde el H & amp; E diapositivas manchadas, el tumor compleja tratados TLS11a-GC-DOX (Fig. 4b, derecha) mostró una necrosis significativa de las células tumorales en comparación con el tumor sin tratar (Figura 4b, izquierda).

(. a) el volumen medio de los tumores de los ratones tratados con nada (negro), doxorrubicina (rojo), o TLS11a-GC-Dox (azul); (B) Imágenes de microscopía de H & amp;. E manchadas diapositivas de tejido tumoral

Discusión

aptámero TLS11a se generó usando células de cáncer de hígado de ratón, pero también muestra una alta afinidad de unión de hígado humano Células cancerígenas. Además, es la primera TLS11a aptámero de ser identificado como específico de las células de cáncer de hígado humano. Nuestros resultados mostraron que la molécula diana de TLS11a es muy probable una proteína de membrana que puede ser internalizado en las células. Estos resultados indican que TLS11a puede ser un aptámero útil para la administración dirigida de fármacos en el tratamiento del cáncer de hígado.

La doxorrubicina juega un papel muy importante en el tratamiento del cáncer de hígado, y se considera que es el medicamento contra el cáncer más utilizado en todo el mundo. Dox es capaz de inhibir la proliferación celular a través de la intercalación de ADN en el núcleo de la célula. Varios informes han demostrado que el libre Dox es la membrana permeable y puede ser especialmente captado por las células a través de un mecanismo de difusión pasiva, que se transportan rápidamente a los núcleos, y unido al ADN cromosómico. [29] Por lo tanto, mientras que Dox es generalmente tóxicos para las células proliferantes, también es tóxico para las células normales, lo que limita su eficacia terapéutica en el uso clínico. Aquí, haciendo uso de la modificación de un aptámero específico del cáncer de hígado y la propiedad de intercalación de Dox, generamos un método fácil, rápido y eficiente para entregar Dox a las células de cáncer específicas. Durante
in vitro
experimentos, hemos podido comprobar la afinidad de unión específica del modificada TLS11a-GC a las células diana LH86, pero el no reconocimiento de las células normales del hígado humano. Además, hemos demostrado la toxicidad específica de complejo TLS11a-GC-Dox a las células diana, en comparación con las células normales del hígado, lo que limita su toxicidad a sólo células diana. Esta orientación se logró a través de la afinidad de unión específica del aptámero TLS11a. Aunque TLS11a-GC-Dox logra buena toxicidad celular en comparación con el control de TD05-GC-Dox durante el ensayo MTS, se observó una menor toxicidad en el grupo TLS11a-GC-Dox que en el grupo Dox libre. Además, se observó menos internalización y liberación de Dox en el grupo TLS11a-GC-Dox que en el grupo Dox libre mediante microscopía confocal. sí Dox es una molécula pequeña que puede ser especialmente captado rápidamente por las células a través de un mecanismo de difusión pasiva. Dentro de 15 min, las células tratadas con conexión Dox muestran una intensa fluorescencia roja en la región nuclear, lo que indica que la velocidad de absorción es muy rápida. [29] Sin embargo, una vez Dox se intercala en aptámero de ADN para formar una molécula mucho más grande, la captación celular del complejo de aptámero-Dox era dependiente principalmente en el aptámero y su objetivo membrana celular. Además, la internalización aptámero requiere más tiempo (alrededor de 2 h) de DOX libre, frenando así la internalización del complejo de aptámero-Dox y la liberación de Dox del complejo. Por lo tanto, se observó una menor toxicidad en el grupo TLS11a-GC-Dox que en el grupo Dox libre durante el
in vitro
experimentos. Durante
in vivo
experimentos, TLS11a-GC-Dox había disminuido la velocidad de internalización celular en comparación con DOX libre. Sin embargo, a causa de reconocimiento del objetivo por TLS11a aptámero, se aumentó la concentración local de Dox, en comparación con libre Dox. Por lo tanto, una mayor eficacia de inhibición de tumor se consiguió en el grupo de ratón tratado-TLS11a-GC-Dox.

En resumen, haciendo uso de la capacidad de los fármacos de antraciclina a intercalarse entre las bases de nucleótidos, un nuevo diseño para modificar aptámero TLS11a a TLS11a-GC y hacer Dox y conjugados TLS11a-GC se investigó. La especificidad y la eficacia de este conjugado para servir como una plataforma de distribución del fármaco demostró aún más
in vitro
y
in vivo
. Nuestros datos muestran que el aptámero modificado conserva su especificidad y puede cargar mucho más Dox que el aptámero sin modificar. Además, los conjugados de aptámero-Dox son estables en medio de cultivo celular y diferencialmente pueden dirigirse a las células LH86. La especificidad de este sistema se demostró adicionalmente mediante el tratamiento de las células normales del hígado humanos, que carecen de la diana de unión de aptámeros. El conjugado de aptámero-Dox evita la absorción no específica de Dox y disminuye la toxicidad celular a las células no objetivo. Además, la
in vivo
experimento mostró una inhibición mejor en tumor por el grupo TLS11a-GC-Dox en comparación con todos los otros grupos de control, lo que indica la entrega exitosa de Dox por el aptámero modificado. Esta especificidad de orientación asegura una mayor concentración local de Dox en el tumor. Además, los conjugados de aptámero-Dox son más pequeños que systemsand de administración de fármacos basado en anticuerpos algún otro sistema de suministro, [30], [31] lo que permite más rápido de penetración y menos inmunorreacciones. Anticipamos que la plataforma de conjugación aptámero-Dox de nuevo diseño, que se basa en la intercalación de antraciclinas dentro de las bases de aptámeros, puede utilizarse en formas distintas de desarrollar nuevas dirigido modalidades terapéuticas para la quimioterapia del cáncer más eficaz.

materiales y Métodos

Cultivo celular y reactivos

LH86 células se han descrito anteriormente. [21] Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (inactivado por calor) y 100 IU /ml de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2. clorhidrato de doxorrubicina (DOX) se compró de Fisher Scientific (Houston, TX, EE.UU.). Todos los reactivos para la síntesis de ADN se adquirieron de Glen Research. A menos que se indique lo contrario, reactivos, tampones y disolventes se obtuvieron comercialmente de Fisher Scientific.

Conjugación del aptámero-Dox

aptámero TLS11a (5'-
ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTG TTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG
-3 ' ); TD05 una secuencia de control

(5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCG GTG-3 ').; aptámero modificado TLS11A-GC (5'-
CGCGCGCGCGCGCGC GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCT G
-3 '); y la secuencia de control modificado TD05-GC (5'-
CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAACACCGTGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG
-3 ') Se sintetizaron en un sintetizador de ADN /ARN ABI3400 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias completas se desprotegen a continuación, en AMA (hidróxido de amonio /40% de metilamina acuosa 01:01) a 65 ° C durante 30 min y se purificó adicionalmente por HPLC de fase inversa (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, EE.UU.) en un C -18 columna usando mM de tampón de acetato 100 trimetilamina (TEAA, pH 7,5) y acetonitrilo como fase móvil. Para hacer conjugados de aptámero-Dox, ya sea TLS11a-GC o TD05-GC se mezclaron con doxorrubicina en tampón (PBS que contiene mM MgCl 5
2, 4,5 mg /ml de glucosa, 0,1 mg /ml de ARNt de levadura, 1 mg /ml de unión BSA) o DMEM los medios de comunicación en una proporción de 1:25 de aptámero de Dox.

Seguimiento de Formación de complejos por fluorescencia

conjugados físicas entre aptámero (TLS11a o TD05) y doxorrubicina se prepararon a una 1 :28 relación molar de aptámero de doxorrubicina (10 mM) en tampón de unión, y la fluorescencia se monitorizó a 500 a 720 nm (1,5 mm de hendidura) en un Fluorolog-Tau-3 Espectrofluorímetro (Jobin Yvon) con excitación a 480 nm.

Determinación de la afinidad del aptámero

Las células LH86 se separaron de platos usando solución de disociación celular no enzimática (Cellgro) y después se lavaron con tampón de lavado (PBS que contenía 5 mM de MgCl
2 y 4,5 mg /ml glucosa). La afinidad de unión de TLS11a se determinó por las células LH86 de incubación (10
5) en hielo durante 30 min con una serie de concentraciones de TLS11a marcado con biotina en tampón (100 l) de unión. Las células fueron lavadas dos veces con tampón de lavado (1,0 ml) y se suspendieron en estreptavidina marcada con fluoresceína (0,1 ml) durante una incubación adicional (15 min en hielo). Antes del análisis de citometría de flujo, las células se lavaron dos veces con tampón de lavado y se suspendieron en tampón de lavado (0,2 ml). La intensidad de fluorescencia media de las células se utilizó para calcular la constante de equilibrio de disociación (Kd) de la interacción de células TLS11a y LH86 mediante el ajuste de la dependencia de la intensidad de fluorescencia (F) de la concentración de la TLS11a marcado con biotina (L) a la ecuación F = Bmax [L] /(Kd + [L]). Los experimentos de ensayo de unión se repitieron al menos tres veces.

Para controlar la afinidad de unión de TLS11-GC, un experimento de competición se llevó a cabo. Brevemente, 200 nM TLS11a-GC se incubó con células LH86 para 20 min en hielo, y se añadió marcado con biotina y luego 1 M TLS11a de 15 min de incubación adicional. Las células fueron lavadas dos veces con tampón de lavado (1,0 ml) y se suspendieron en estreptavidina marcada con fluoresceína (0,1 ml) durante una incubación adicional (15 min en hielo). Antes del análisis de citometría de flujo, las células se lavaron dos veces con tampón de lavado y se suspendieron en tampón de lavado (0,2 ml).

Evaluación de la célula La captación de Dox por microscopía confocal

Para imágenes confocal, doxorrubicina o aptámero conjugados -DOX se incubaron con una monocapa de células LH86 en una de 35 mm de vidrio placa de cultivo de fondo (Mat Tek Corp.) en medio DMEM a 37 ° C durante 1 h. Después de lavar una vez utilizando los medios de comunicación, se añadieron medio fresco a los platos de 3 h de incubación a 37 ° C. A continuación, los platos con las células se colocaron por encima de un objetivo 40 × de un microscopio confocal Olympus FV500-IX81 (Olympus America Inc., Melville, NY). Después se usó una 5-mW, 488 nm-Ar + láser para la excitación de la doxorrubicina. El objetivo utiliza para la imagen era un Olympus LC Plan de F1 40X /0.60 ph 2 × 40 objetivo.

MTS viabilidad celular Ensayo

quimiosensibilidad de LH86 a Dox o aptámero-Dox conjugados se determinó utilizando el CellTiter ensayo de proliferación celular 96 (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Brevemente, una alícuota de 100 l de células LH86 (5 × 10
4 células /ml) se sembraron en placas de 96 pocillos (
n
= 3) y se dejaron crecer durante la noche. Después, las células se trataron con 100 l de: 1) control de aptámero TD05-GC, 2) aptámero TLS11a-GC, 3) Dox, 4) TD05-GC-Dox conjugado física (25:1 doxorrubicina a razón molar TD05-GC) o 5) conjugado física TLS11a-GC-Dox (25:1 doxorrubicina a TLS11a relación en moles) durante 1 hora, se lavaron y se incubaron adicionalmente en medio fresco durante un total de 48 horas. Para la medición de la citotoxicidad, los medios se retiraron de cada pocillo, y después de reactivo CellTiter (20 l) y los medios (100 l) se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 3 h. El uso de un lector de placas (lector de microplacas Tecan Safire, AG, Suiza), la absorción se registró a 490 nm. El porcentaje de viabilidad celular se determinó mediante la comparación de Dox y las células tratadas con conjugados aptámero-Dox con el control sin tratar.

Hoechst 33258 tinción de células apoptóticas

apoptosis celular se determinó por el cambio morfología núcleo. células LH86 en crecimiento exponencial se colocaron en una placa de 48 pocillos a una concentración final de 1,5 x 10
4 células por pocillo. Después de 12 h, las células se trataron con diferentes concentraciones de conjugado física TD05-GC-Dox (25:1 doxorrubicina a TD05-GC relación molar) o conjugado física TLS11a-GC-Dox (25:1 doxorrubicina a razón molar TLS11a) para 1 hora, se lava, y se incubaron adicionalmente en medio fresco durante un total de 48 horas. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con Hoechst 33258 solución de tinción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de incubación a 37 ° C durante 10 min, núcleo de la célula fragmentación /condensación se detectó mediante microscopía de fluorescencia. La muerte celular apoptótica se evaluó mediante el cálculo del número de células apoptóticas con núcleos condensados ​​en seis a ocho áreas seleccionadas al azar. Los resultados mostrados representan tres experimentos independientes.

Western Blotting Análisis

Las células se recogieron y se lavaron dos veces con tampón fosfato salino. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis que contiene Nonidet-40 P (HEPES 10 mM, pH 7,4, EGTA 2 mM, 0,5% Nonidet P-40, mM NaF 1 mM, Navo 1
4, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 ditiotreitol mM, 50 mg de inhibidor de tripsina /ml, 10 mg /ml de aprotinina, leupeptina y) y se incubaron en hielo durante 30 min. Después de centrifugación a 12.000 × g a 4 ° C durante 15 min, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, y se determinó la concentración de proteína. Muestras equivalentes (20 g de proteína) se sometieron a SDS-PAGE en geles al 12%. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondaron con los anticuerpos indicados primarios (anticuerpo caspasa-3 troceados, Cell Signaling Technology, Inc.), seguido por los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano (HRP, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Las bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando mayor quimioluminiscencia (ECL, Pierce). Los tamaños moleculares de las proteínas detectadas se determinaron por comparación con marcadores de proteínas preteñidos (Bio-Rad). Todas banda densidades se calcularon utilizando el software ImageJ.


En vivo
Experimento

El NOD. ratones IL2 cg-Prkdc (SCID) fueron adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se alojaron en el animalario de la Universidad de Florida, con la aprobación normativa institucional (Institucional Cuidado de Animales y el empleo). Este estudio fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión con la aprobación ID IC00001331. Treinta NOD. ratones IL2 cg-Prkdc (SCID) fueron inyectados por vía subcutánea con 7 × 10
6
Tarjetas telefónicas células LH86 -propagated in vitro. Cuando los tumores podrían ser vistos fácilmente y medidos, los ratones se dividieron en tres grupos: (1) el grupo 1, sin tratamiento; (2) grupo 2, tratados con Dox libre; y (3) el grupo 3, tratado con complejo TLS11a-GC-DOX. La dosis de doxorrubicina se mantuvo la misma en los grupos 2 y 3 a 2 mg /kg. Todos los tratamientos continuaron durante 11 días. Los fármacos se inyectan a través de vena de la cola en los días 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, y todas las muestras se recogieron en el día 11. El tamaño del tumor para cada ratón se midió cada dos días. El corazón, pulmón, hígado, riñón y tumor de cada ratón se recogieron en el día 11 y se fijaron con formalina al 10% durante 24 h a temperatura ambiente, y después hematoxilina y eosina (H & amp; tinción E) se llevó a cabo
.
Apoyo a la Información
Figura S1.
imágenes confocal de tinción aptámero con células cultivadas LH86. Las células se incubaron con aptámero conjugado con biotina, y el evento se observó unión con estreptavidina AlexaFluor 633-conjugado. No vinculante TD05 secuencia mostró la unión de fondo. Los aptámeros muestran una unión significativa sobre la señal de fondo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033434.s001 gratis (TIF)
figura S2.

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