Extracto
Antecedentes
La activación de la MAPK y las vías /Akt /mTOR PI3K está implicado en la mayoría de los cánceres. La activación de mutaciones en ambos de estas vías se ha descrito en el cáncer colorrectal (CRC), lo que indica su potencial como dianas terapéuticas. Este estudio evaluó la combinación de un inhibidor de PI3K /mTOR (PF-04691502 /PF-502) en combinación con un inhibidor de MEK (PD-0325901 /PD-901) en líneas celulares de CRC y modelos de xenoinjerto de tumor de CRC derivados del paciente (PDTX) .
Materiales y Métodos
Los efectos antiproliferativos de PF-502 y DP-901 se evaluaron como agentes individuales y en combinación frente a un panel de líneas celulares de CRC con diversos orígenes moleculares. La sinergia se evaluó usando el método de Bliss aditividad. En líneas celulares seleccionadas, se investigaron los efectos de la combinación de los efectores por inmunotransferencia. Después se evaluó la combinación de varios modelos CRC PDTX totalmente anotados genéticamente.
Resultados
in vitro
experimentos demostraron una amplia gama de IC
50 valores para ambos agentes contra un panel de línea celular. La combinación de PF-502 y PD-901 demostró una actividad anti-proliferativa sinérgica con los valores de la dicha en el rango de aditivo. Como era de esperar, p-AKT y p-ERK fueron regulados a la baja por el PF-502 y DP-901, respectivamente. En los modelos PDTX, después de una exposición de 30 días a PF-502, PD-901 o la combinación, la combinación demostró una mayor reducción en el crecimiento del tumor en comparación con cualquiera de los agentes solo, independientemente de KRAS o PI3K estado mutacional.
conclusiones
La combinación de una PI3K /mTOR y un inhibidor de MEK mejorados demostraron efectos antiproliferativos contra líneas celulares de CRC y modelos PDTX
Visto:. Pitts TM, TP Newton, Bradshaw-EL Pierce , Addison R, Arcaroli JJ, Klauck PJ, et al. (2014) Dual farmacológico orientación de la MAP cinasa y PI3K /mTOR Camino en modelos preclínicos de cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (11): e113037. doi: 10.1371 /journal.pone.0113037
Editor: Marie-Josée Boucher, Universidad de Sherbrooke, Canada |
Recibido: 19 Junio, 2014; Aceptado: 17 de octubre de 2014; Publicado: 17 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Pitts et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Pfizer Inc y la Universidad de Colorado Cancer Center de Grant P30 CA046934. Los donantes tenían un papel menor en el diseño del estudio y la decisión de publicar. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en la recogida de datos y análisis, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores de este manuscrito han leído la política de la revista y tienen los siguientes intereses en competencia: Pfizer ofrece apoyo financiero a las SGE para becas oncología. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Dos de las vías celulares más implicadas en el cáncer son las quinasas fosfatidilinositol-3 (PI3K) y la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) vías. La clase I (PI3K) son quinasas de lípidos heterodiméricas que comprenden una subunidad p85 y una subunidad reguladora p110 de catalizador [1]. PI3K fosforila el grupo 3-hidroxilo de fosfatidilinositol, participando en una variedad de vías de señalización importantes para el cáncer tales como la proliferación, la diferenciación, la quimiotaxis, la supervivencia, el tráfico y la homeostasis de la glucosa [2], [3]. Debido a la diversidad de su función en la célula, el eje de PI3K es altamente implicados en los cánceres humanos; hasta el 30% de todos los cánceres humanos tienen una mutación en un componente de la vía PI3K [4]. En el cáncer colorrectal (CCR), el
PIK3CA
gen, que codifica la subunidad catalítica de PI3K p110α de clase I, se ha encontrado que se va a mutar en el 10-20% de las muestras de tumor de CRC [5].
Un componente aguas abajo de la vía de señalización PI3K es el objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR). El crecimiento celular es una de las funciones primarias que se rigen por mTOR; activación de mTOR través de la vía PI3K /AKT es crítica para la célula en la absorción de equilibrio de nutrientes y el crecimiento, y la hiperactivación aberrante de esta vía contribuye a la tumorigénesis [6], [7]. El papel de la mTOR en estas funciones celulares hace que sea un objetivo atractivo para la inhibición; ya que el desarrollo de la rapamicina hace cuarenta años, muchos inhibidores de la primera y segunda generación de mTOR se han sintetizado y se encuentran en diversas etapas de desarrollo clínico y preclínico [8], [9].
El MAPK /ERK (MEK) complejos son componentes del eje de señalización Ras /Raf. Señalización través de esta vía da como resultado aumento de la proliferación y la resistencia a la apoptosis, mientras que la activación constitutiva contribuye a la quimiorresistencia en varios tipos de cáncer [10], [11]. Las mutaciones en KRAS, las ANR, o BRAF (todo aguas arriba de los complejos MEK) son muy comunes en el CCR, y se han encontrado en el 50-60% de las muestras tumorales [12], [13]. Una variedad de agentes se han desarrollado que se dirigen a EGFR, RAS, RAF, o MEK, muchos de los cuales están en ensayos clínicos y algunos de los cuales ya están aprobados [14].
La diafonía entre la PI3K /Akt /mTOR existe vía: por ejemplo, PI3K puede ser activado por RAS, y la tuberina supresor de tumor (un regulador negativo de mTOR) es un sustrato directo de ERK [15] - [17]. Se ha encontrado también que la co-ocurrencia de alteraciones en la PI3K-AKT-mTOR y vías RAS-RAF-MEK se produce en un tercio de las muestras de CRC, lo que sugiere que la inhibición simultánea de ambas vías puede ser necesario para el beneficio terapéutico [12]. Además, se piensa que el eje de señalización RAS-RAF-MEK puede actuar como un mecanismo de compensación con la inhibición de la vía PI3K-AKT-mTOR, y viceversa [18], [19]. La evidencia de la extensa diafonía entre estas vías ha creado un gran interés en la inhibición simultánea, con diferentes tipos de estrategias actualmente en desarrollo [20].
Para explorar la eficacia de la inhibición simultánea de la PI3K-AKT-mTOR y las vías RAS-RAF-MEK, que examinaron la combinación de PF-04691502 (PF-502) con la EP-0325901 (EP-901). PF-502 es un potente inhibidor biodisponible por vía oral, ATP-competitiva quinasa de PI3Ks I y mTOR [21] tanto de clase, [22]. En un reciente realizada en la Fase I de ensayos clínicos, PF-502 resultó ser bien tolerado por la fatiga, disminución del apetito, hiperglucemia náuseas, erupciones cutáneas, vómitos, diarrea y la inflamación de la mucosa siendo los efectos adversos más comúnmente observados. Sin embargo la mayoría de estos fueron de grado 1 ó 2. [23] PD-901 es un muy potente, inhibidor oral, de molécula pequeña de MEK1 y MEK2 que demostró cierta actividad en los primeros ensayos clínicos y se asoció con toxicidad en las características de esta clase de agentes : erupción
, diarrea, fatiga, náuseas y trastornos de la visión, [24]. PD-901 está actualmente en ensayos clínicos de fase I para el tratamiento de CRC en combinación con PKI-587 (PF-0.521.384), un inhibidor dual PI3K /mTOR con potencia similar a PF-502 [24] - [26]. Una ventaja de esta combinación es que a través de la inhibición de la PI3K aguas arriba, se evita realimentación regulación al alza de AKT en la inhibición de mTOR [27].
En el estudio actual se describe la actividad antitumoral mejorada del doble PI3K /inhibidor de mTOR PF-502 y el inhibidor de MEK PD-901 en
in vitro e
in vivo y modelos de cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Productos químicos y Reactivos
PF-04691502 (PF-502) y PD-0325901 (EP-901) fueron proporcionados por Pfizer Inc. (San Diego, CA). Para
in vitro
trabajo en, ambos agentes se disolvieron en DMSO al 100% a una concentración de 10 mM. Para
in vivo
estudios, PF-502 se suspendió en 0,5% de metilcelulosa en agua, y PD-901 se suspendió en 0,5% de metilcelulosa de hidroxipropilo, 0,2% de Tween-80 en agua.
Cell líneas y Cultura y
líneas celulares de cáncer colorrectal humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection, DSMZ, o la línea celular Banco de Corea. células Geo, descritos anteriormente [28], fueron amablemente proporcionados por el Dr. Fortunato Ciardiello (Cattedra di Oncologia Medica, Dipartimento di Medico-Chirurgico Internistica Clinica e Sperimentale "F Magrassi e A Lanzara," Seconda Universita 'degli Studi di Napoli, Nápoles, Italia). KM12L4, KM12C y KM20, descritos anteriormente [29], todos fueron amablemente proporcionados por Scott Kopetz (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Todas las células se cultivaron de forma rutinaria en medio RPMI 1640. Todo medio fue suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y aminoácidos no esenciales MEM 1%. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C bajo una atmósfera que contiene 5% de CO
2. Las células se ensayaron de forma rutinaria para la presencia de micoplasma (MycoAlert; Cambrex BioScience). Todas las líneas celulares de CRC utilizados en este estudio se han caracterizado completamente y autenticado en la Universidad de Colorado Cancer Center Secuenciación de ADN y análisis de testigos.
Sulforodamina B (SRB) y CyQuant celulares Ensayos de proliferación de
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de ventaja en 2000-8000 células por pocillo, dependiendo de las propiedades de líneas celulares. Para el ensayo CyQuant, las células se sembraron en placas de paredes negras. Después de 24 h, se incubaron las células durante 72 h con sólo medio o concentraciones variables de PD-901 (0.015 umol /L-1 umol /L) o PF-502 (0,08 umol /L-5 umol /L), como agentes únicos o en combinación. Para el ensayo CyQuant, las placas se preparan y se leen de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA). Sulforodamina B de ensayo (SRB) se realizó como se describe anteriormente [30]. Brevemente, las células fueron fijadas con 10% tricloroacético acidat 4 ° C durante 30 minutos, se lavó 3 veces con agua y se secó a temperatura ambiente. Posteriormente fueron teñidos con un sulforrodamina B (SRB) solución (0,4% w /v SRB en ácido acético al 1%) durante 20 min a temperatura ambiente se lavó 3 veces con ácido acético al 1%, y SRB restante se solubilizó con 10 mM no tamponada Tris . La absorbancia se leyó a 492 nm, utilizando el lector de placas Synergy 2 (Biotek, Winooski, VT). Los datos se normalizó a la absorbancia de ningún fármaco (ND). Un efecto de combinación se analizó utilizando el modelo de la dicha aditividad como se describe anteriormente [31].
caspasa 3/7 Actividad
La caspasa-Glo 3/7 Ensayo luminiscente (Promega, Milwaukee, WI) se usó como un indicador de la actividad apoptótica a través de la caspasa 3 y 7 actividad. Las células se sembraron en placas de paredes blancas en 2000-8000 células por pocillo, dependiendo de las propiedades de la línea celular. Después de 24 h, las células se incubaron para el punto de tiempo indicado con sólo o concentraciones variables de PD-901 o PF-502 medios de comunicación, como agentes únicos o en combinación. Los datos se presentan como factor de cambio, normalizado a control.
clonogénicos Ensayos
Las células se sembraron a 2000 células por pocillo de una placa de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Se añadió Pd-901 o PF-502 como agentes únicos o en combinación y se incubaron durante 72 horas. Después de 72 horas las células se lavaron en medio completo y medio sin fármaco se añadió de nuevo durante 72 horas adicionales. Las células se fijaron con 100% de metanol durante 30 min y se tiñeron con 2% de cristal violeta. A continuación, el cristal violeta se solubilizó en ácido acético 1% y el sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocillos. La absorbancia se leyó a 565 nm, utilizando el lector de placas Synergy 2 (Biotek, Winooski, VT). Los datos se normalizó a controlar.
inmunotransferencia de anticuerpos y la matriz
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante 24 h. Las células se incubaron a continuación durante 24 h, ya sea con PD-901 o PF-502, o la combinación. Después, las células se lavaron con PBS y se lisaron con tampón RIPA (Señalización Celular, Danvers, MA). Después de tratamiento con ultrasonidos y centrifugación, un total de 30 ug de lisado de proteína se cargó en un gel NuPage (Life Technologies, Carlsbad, CA), electroforesis, y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa utilizando el iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). La membrana se bloqueó durante la noche y se sondeó con anticuerpos primarios, se lavaron durante 10 minutos 3 veces con, y se sondeó con anticuerpos secundarios (DyLight la señalización celular, Danvers, MA), y la imagen usando el Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Todos los anticuerpos primarios se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) y se diluyeron como por los fabricantes 'instrucciones. Para la matriz de anticuerpos, los tumores extirpados se lisaron en tampón RIPA usando un homogeneizador de tejidos FastPrep24 (MP Biológicos, Santa Ana, CA). La concentración de proteína se normalizó y se añade al estrés PathScan y matrices de Apoptosis Señalización anticuerpo como por los fabricantes 'instrucciones. La matriz se ha desarrollado utilizando el Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). La intensidad de cada punto se analizó usando el software Image Studio (Licor, Lincoln, NE) y la densidad de cada mancha fue graficada.
derivado del paciente xenoinjerto Estudios
De cinco a seis semanas de edad ratones desnudos atímicos hembra (Harlan Labs, Indianapolis, IN) se utiliza para todos los estudios con animales enjaulados, en grupos de 5, mantiene en un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad, y se le dio comida y agua estériles
ad libitum
. Los xenoinjertos derivados del paciente se generaron como se describe anteriormente [28]. Brevemente, una muestra de tumor se recogió en el momento de la cirugía de un paciente que consienten en la Universidad de Colorado Hospital. material tumoral restante tras el análisis histopatológico fue cortado en 2 a 3 mm
3 piezas, sumergidos en Matrigel, e implantados subcutáneamente en el flanco de cinco ratones desnudos. Después de tumores se expandieron a través de al menos la generación F3, que fueron extirpados, corte, y se inyectaron en los costados izquierdo y derecho de aproximadamente 25 ratones para cada estudio de xenoinjerto (50 tumores total dividido entre cuatro grupos: control del vehículo, PF-502 de agente único , PD-901 como agente único, y PF-502 /PD-901 combinación). Cuando el tamaño medio de tumor alcanzó un volumen de aproximadamente 200 mm
3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos diferentes. Los ratones se controlaron diariamente para detectar signos de toxicidad y se pesaron dos veces por semana. El tratamiento se administró una vez al día (10 mg /kg PF-502 y /o 1,0 mg /kg PD-901) por sonda oral. El volumen del tumor (ecuación de volumen = (longitud x anchura
2) x 0,52) se evaluó dos veces por semana con calibres digitales, utilizando el paquete de software Director del Estudio (Studylog Systems, South San Francisco, CA). las tasas de crecimiento de los tumores se determinaron para cada tumor individual mediante el ajuste de datos de volumen de tumor en el transcurso del período de tratamiento a una ecuación tasa de crecimiento exponencial con SAAM II v. 2.3. (El Grupo de Epsilon, Charlottesville, VA). Al final del tratamiento, los ratones fueron sacrificados por CO
2 sobredosis seguido por dislocación cervical antes de la eliminación de los tumores para su posterior análisis.
Análisis de Datos
unidireccional análisis ANOVA con se utilizó un post-test de Tukey para determinar la significación estadística entre varios grupos. Los análisis se realizaron con Prism versión 5.0,
p-
valores. & Lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Declaración de Ética
Todo el trabajo y el cuidado de los animales se llevaron a cabo bajo las directrices de el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC). una autorización específica para los experimentos con ratones se obtuvo con el 51410 (08) 1E protocolo titulado "Desarrollo y Mantenimiento de un tumor gastrointestinal primaria del Banco para el diseño de tratamiento racional utilizando explantes tumorales de ratón". Todos se hicieron esfuerzos razonables para aliviar el sufrimiento, incluida la anestesia para procedimientos dolorosos. Los tumores humanos se obtuvieron utilizando Colorado Junta de Revisión Institucional Múltiple (COMIRB) aprobó el protocolo número 08-0439. El consentimiento para la recuperación del tumor fue escrito.
Resultados
Los efectos del PF-502 y DP-901 como agentes únicos sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer colorrectal
CRC líneas celulares eran expuesto a concentraciones crecientes de PF-502 y PD-901 durante 72 horas, se evaluó la proliferación y IC
50 Los valores se calcula a partir de la proliferación media de experimentos por triplicado. Como se representa en las figuras 1 y 2 que había una diferencia mayor de 10 veces en la IC
50 entre las líneas de células sensibles y resistentes CRC que no se correlacionó con el estado mutacional de KRAS, BRAF, o PIK3CA. Cuatro líneas celulares de CRC con diferentes genotipos se eligieron para su posterior análisis.
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante 24 horas. Las células fueron expuestas a concentraciones crecientes de compuesto durante 72 horas y la proliferación se evaluó usando el ensayo CyQuant. ensayos Proliferaion se realizaron por triplicado y IC
50 valores se calculan a partir de la proliferación de la media. estado mutacional del gen KRAS, BRAF, y PIK3CA se encuentran en cajas de colores.
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante 24 horas. Las células fueron expuestas a concentraciones crecientes de compuesto durante 72 horas y la proliferación se evaluó usando el ensayo de SRB. Los ensayos de proliferación se llevaron a cabo por triplicado y IC
50 valores se calculan a partir de la proliferación de la media. estado mutacional del gen KRAS, BRAF, y PIK3CA se encuentran en cajas de colores.
efectos combinatorios de la vía PI3K /mTORi PF-502 y la Meki, PD-901 en líneas celulares de cáncer colorrectal
LOVO (KRAS
G13D /PIK3CA
WT), HCT116 (KRAS
G13D /PIK3CA
H1047R), WIDR (BRAF
V600E /PIK3CA
P449T), y Geo (KRAS
G13D /PIK3CA
WT) se eligieron para su posterior análisis combinación.
Cada una de las 4 líneas celulares de CRC se expusieron a concentraciones variables de la vía PI3K /mTORi, PF-502 y la meki PD- 901 como agentes únicos o en combinación durante 72 horas. La proliferación se evaluó usando el ensayo CyQuant y valores de inhibición se presentan en la Figura 3A. La combinación demostró un mayor efecto sobre la inhibición de la proliferación en las cuatro líneas celulares de CRC ensayados en varias concentraciones. Estos datos se confirmó en las líneas celulares de CRC utilizando el modelo de la dicha aditividad. Dicha valores se calcularon como se describe en los Materiales y Métodos y la puntuación para cada combinación se presenta en la Figura 3B. HCT116, WIDR y GEO ambos muestran las puntuaciones medias de la dicha ligeramente por encima de 1 demuestran un efecto mayor que la aditiva (1,08 ± 0,09, 1,11 ± 0,08, 1,08 ± 0,08, respectivamente), mientras que LOVO demostró un efecto aditivo o menos (1,019 ± 0,08,). Para determinar si el efecto de la combinación observado se asoció con la inhibición irreversible de la proliferación, se realizó un ensayo clonogénico. Las cuatro líneas celulares de CRC se expusieron a 0,6 mol /L de PF-502 y 0,3 mol /L de PD-901 como agentes únicos y en combinación. Las cuatro líneas celulares mostraron una reducción en la clonogenicidad de la combinación frente a cualquiera de los agentes solo mientras que el HCT116, GEO, y WIDR demostró diferencias estadísticamente significativas. (Figura 4).
LOVO (KRAS
G13D), HCT116 (KRAS
G13D /PIK3CA
H1047R), WIDR (BRAF
V600E /PIK3CA
P449T), GEO (KRAS
G13D). Las células se expusieron a varias combinaciones de PF-502 y PD-901 durante 72 horas. (A) La fracción inhibido fue graficada tras la exposición a un agente único y la combinación. (B) aditividad de Bliss se calculó y para evaluar los efectos combinatorios. se graficaron las puntuaciones medias de la dicha.
(A) Lovo (B) HCT116, (C) WIDR, y (D) GEO se sembraron en placas de 6 pocillos y se expone a un solo agente de la PI3K /mTORi , PF-04691502, el meki, PD-0325901 o la combinación durante 72 horas. Drogas se retiró y se reemplazó con medio para permitir la regeneración de los clones. Las células fueron teñidas con cristal violeta y se fotografiaron. (E) El violeta cristal se solubilizó en ácido acético al 1% y la absorbancia se determinó en un lector de placas. Los datos se normalizó a controlar y representar gráficamente. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar, valores p ajustados de Tukey ANOVA: *
p
, 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001 vs vehículo,#
p
, 0,05, ##
p Hotel & lt; 0,01, ###
p Hotel & lt; 0,001 frente a PF-502, & amp;
p
, 0,05, & amp; & amp;
p Hotel & lt; 0,01, & amp; & amp; & amp;
p Hotel & lt; 0,001 frente PD-901. Todos los datos representan tres experimentos independientes.
También caracterizaron los efectos de la vía PI3K /mTORi, PF-502 y la Meki, PD-901 en los efectores establecidos de las vías pertinentes. PF-502 se ha demostrado que disminuye la AKT, 4EBP1 y S6RP fosforilación [22], mientras que PD-901 inhibe la fosforilación de ERK [32], [33]. Para validar los efectos de estos 2 agentes y buscar evidencia de un efecto cooperativo, se analizaron modulación de objetivos de abajo en las vías de MAPK y PI3K. Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con PF-502 o PD-901 disminuciones inducidas en pAKT, pS6RP, P4EBP1, y pERK respectivamente. Curiosamente, tras la exposición a la meki, PD-901 se observó una disminución más pronunciada en pS6RP de lo que se observó en las células tratadas PF-502 en tres de las cuatro líneas celulares de CRC. Estas disminuciones se mantuvieron en gran medida en la combinación.
La apoptosis se ha mejorado después de la exposición a la combinación de PF-502 y DP-901 en líneas celulares de cáncer colorrectal
Los datos indicaron que clonigénicas la combinación dio lugar a efectos antiproliferativos sostenidos, por lo tanto se midió la apoptosis como otro punto final fenotípica. Para ello nos exponemos las cuatro líneas celulares de CRC a 0,6 mmol /L de PF-502 y 0,3 mmol /L de la DP-901 como agentes individuales y en combinación durante 24 horas. La apoptosis se midió por el ensayo de la caspasa 3/7 Glo. Como se representa en la figura 6, aunque hubo una tendencia hacia un aumento de la apoptosis con la combinación en todas las líneas celulares, en las células WiDr estos efectos fueron estadísticamente significativos en comparación con los dos agentes individuales.
Todos los datos presentados como media ± SD, valores p ajustados de Tukey ANOVA: *
p
, 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001 frente a vehículo,#
p
, 0,05, ##
p Hotel & lt; 0,01, ###
p Hotel & lt; 0,001 frente a PF-502, & amp;
p
, 0,05, & amp; & amp;
p Hotel & lt; 0,01, & amp; & amp; & amp;
p Hotel & lt; 0,001 frente PD-901. Todos los datos representan tres experimentos independientes.
efectos antitumorales del PF-502 y DP-901 en xenoinjertos de tumores de pacientes derivada
Siguiente para confirmar los efectos antitumorales observados en nuestro
in vitro
modelo, expusimos cuatro modelos de pacientes derivados xenoinjertos de tumores (PDTX) con diferentes estado mutacional de la vía PI3K /mTORi, PF-502, el Meki, PD901, o la combinación. Los efectos anti-tumorales de cada compuesto se evaluó mediante la determinación de la tasa de crecimiento de cada tumor individual en cada grupo de tratamiento. Como se muestra en la Figura 7A, sólo el modelo CUCRC040 (
KRAS
G12V /PIK3CA
E542G) demostraron un beneficio significativo del tratamiento de combinación sobre los tratamientos con un único agente (p & lt; 0,05). El tratamiento de combinación fue también estadísticamente significativa en el CUCRC108 (KRAS
G12C) y CUCRC125 (KRAS
WT) modelos PDTX comparación con los controles, pero no en comparación con los grupos de tratamiento con un solo agente (Figura 7B-C). Y, el (G13D KRAS
) CUCRC042 modelo fue relativamente insensible a todos los tratamientos (Figura 7D). curvas de crecimiento del tumor se muestran en la Figura S1.
Cada punto representa un único tumor. La media de la tasa de crecimiento del tumor ± desviación estándar están representados por la barra y asas. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar, valores p ajustados de Tukey ANOVA: * P & lt; 0,05 frente a control;
† P & lt; 0,05 frente a 901;
‡ P & lt; 0,05 frente a 502.
La combinación de PF-502 y DP-901 inhibe las vías pro-supervivencia e impactos marcadores de apoptosis en modelos PDTX
Para evaluar los efectos en las vías de la PI3K de señalización /mTORi, PF-502 y la meki, PD-901 en los modelos PDTX, una matriz de anticuerpos se utilizó con los lisados de tumores recogidos de grupo para cada modelo al final del estudio. Los tumores se lisaron en tampón RIPA y se aplican al estrés PathScan y matrices de Apoptosis Señalización de anticuerpos a concentraciones iguales. Las matrices se visualizaron en un Licor Odyssey y la densidad /intensidad de las manchas duplicadas de tres tumores diferentes se normalizaron con el control del vehículo y se representan. Los niveles de pERK y pAKT disminuyeron en los grupos de tratamiento PD-901 y PF-502, en comparación con el control, en el CUCRC040, modelos CUCRC108 y CUCRC125 PDTX, lo cual es consistente con los perfiles de crecimiento del tumor y la respuesta observada en los que estos grupos de tratamiento ( La figura 8A-B y la figura S2). Además, la regulación a la baja de pERK y pAKT se mantuvo en los grupos de combinación en estos modelos. Sin embargo, sólo en el modelo CUCRC040 fue el nivel de Perk en el grupo de combinación en realidad más bajo que los dos brazos con un solo agente. El modelo resistente CUCRC042 no mostró ninguna disminución de la pERK o pAKT (Figura 8A-B y la figura S2). Curiosamente, en el tratamiento CUCRC042 con PD-901 dio lugar a un aumento de pAKT y un aumento en pBAD (Figura 8B-C y la Figura S2).
La proteína total se purificó a partir PDTX al final del tratamiento y se evaluaron en una matriz de anticuerpos estrés y la apoptosis. Se obtuvieron densidad de las manchas, y graficó. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar, valores p ajustados de Tukey ANOVA: *
p
, 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001 vs vehículo,#
p
, 0,05, ##
p Hotel & lt; 0,01, ###
p Hotel & lt; 0,001 frente a PF-502, & amp;
p
, 0,05, & amp; & amp;
p Hotel & lt; 0,01, & amp; & amp; & amp;
p Hotel & lt; 0,001 frente PD-901. Todos los datos son un representante de los tres tumores separados de cada grupo.
Discusión
Aproximadamente el 40% de los cánceres colorrectales alberga una mutación en el gen KRAS causando esta vía sea constitutivamente activa. Otras mutaciones en esta vía, incluyendo RAS (ANR y HRAS) y BRAF constituyen otro 1-3% y 5-15%, respectivamente [34], [35]. PIK3CA mutaciones ocurren en aproximadamente el 15% de los cánceres colorrectales y de éstos 8-9% tienen mutaciones en ambas PIK3CA y KRAS [34], [36]. Con estos dos grandes pro-supervivencia /proliferación vías activas en los cánceres colorrectales, además de la diafonía /retroalimentación que se produce entre estas vías, hay una razón para apuntar ambas vías con inhibidores de moléculas pequeñas.
inhibidores de la vía RAS /RAF /MEK han existido desde hace más de una década y los estudios clínicos en monoterapia han sido en gran parte decepcionante. Por ejemplo, un ensayo de Fase II con CI-1040, un inhibidor de MEK de primera generación, en el cáncer colorrectal avanzado no demostró actividad antitumoral significativa. Sin embargo, un ensayo más reciente fase II con la segunda generación selumetinib inhibidor de MEK ha mostrado una actividad similar a la capecitabina agente quimioterapéutico en pacientes con CRC [37], [38]. Con modestos resultados a la inhibición de MEK agente único en los cánceres colorrectales, parece obvio que la terapia combinada debe ser investigada.
Numerosos estudios preclínicos han demostrado que la orientación tanto de la RAS /RAF /MEK y la vía PI3K /Akt /mTOR es más beneficioso en numerosos tipos de tumores [39] - [42]. En el cáncer de ovario co-direccionamiento de la PI3K /mTOR y RAS vía /MEK demostrado una inhibición sinérgica de la proliferación y la inducción de la muerte celular [42]. Del mismo modo, en modelos de cáncer de mama basal, se observó una inhibición mejorada de la proliferación y un aumento de la apoptosis
vitro
y un aumento de la inhibición del crecimiento tumoral se observó
in vivo
[39] . La mayoría de los datos en el cáncer colorectal ha sido en modelos mutantes KRAS ya que esta población está en la necesidad de nuevas terapias novedosas. Roper
et. Al
. demostró que la combinación PI3K y MEK inhibición promueve la apoptosis y la regresión del tumor en modelos de ratón de cáncer de colon [41]. Otro estudio en modelos PDTX colorrectales humanos, demostró más de un efecto de la estasis del tumor, con y poco regresión sugiere este régimen de combinación no puede traducirse en efectos terapéuticos duraderos [40].
En el presente estudio hemos utilizado tanto en el cáncer colorrectal líneas celulares y modelos PDTX para demostrar que la terapia de combinación PI3K /MEK es más activo que el tratamiento de agente único en modelos de CRC con antecedentes moleculares distintas. Tanto PF-502 y PD901 exhiben actividad como agente único contra en un gran panel de líneas celulares de cáncer colorrectal con independencia de RAS o PIK3CA estado mutacional. Cuando la combinación fue probada en KRAS mutado, mutante BRAF o KRAS /PIK3CA doble mutantes se produjo un efecto de combinación mejorada a diversas concentraciones con HCT116, WIDR y GEO exhibiendo un poco más robusto efecto de la combinación en comparación con LOVO. La capacidad para formar colonias después de la exposición a la combinación también se vio afectada que indica que la inhibición de estas vías conduce a un lugar de citotóxico fenotipo citostático. Esto fue apoyado además por un incremento en la apoptosis en la combinación. Es interesante observar que tras el tratamiento con el meki, PD901, se observó una marcada disminución en pS6RP en tres de los cuatro modelos de líneas celulares de CRC. Esto puede ser debido al hecho de que la actividad TORC1, que efectúa la fosforilación S6 es un punto de convergencia que incorpora múltiples vías de señalización aguas arriba en algunos tipos de tumores. Por ejemplo, en el melanoma sensible Mapki, el tratamiento con un Rafi o una meki, da como resultado la disminución PS6, mientras que en los modelos insensibles no se observa disminución de la fosforilación [43]. Lo mismo puede ser cierto en los tres-901 PD líneas sensibles CRC celulares (HCT116, Lovo y WiDr) en contraste con la línea más resistente CRC celular, GEO, lo que puede indicar que la disminución de pS6RP puede servir como un marcador de la capacidad de respuesta.
a continuación transición nuestros
in vitro
datos
in vivo
usando nuestros modelos CRC PDTX. Se cree que estos modelos para proporcionar mejoras significativas sobre xenoinjertos típicos de líneas celulares, aunque la validación clínica está en curso [40], [44]. Similar a la
in vitro
datos hubo respuestas heterogéneas a tratamiento de combinación con un modelo, CUCRC040, lo que demuestra un efecto estadísticamente significativo combinación. Esto fue en contraste con los modelos CUCRC108 y CUCRC125, donde la combinación sólo fue estadísticamente diferente de la del vehículo y para CUCRC042 que no mostró efectos del tratamiento. Curiosamente, este modelo PDTX resistentes, exhibió un aumento en pAKT cuando son tratados con la Meki, PD-901, que se asoció con un aumento en pBAD, una proteína que puede tener efectos anti-apoptóticos y conducir a la supervivencia celular mejorada [45]. Esto puede ser vale la pena como un mecanismo de resistencia putativa.
A pesar del fuerte evidencia preclínica para apoyar co-focalización de la vía PI3K /mTOR y las vías de MAPK en varios tipos de tumores, los primeros resultados de los ensayos clínicos han demostrado un éxito desigual [46 ] - [48]. Las combinaciones fueron generalmente bien tolerados y dosis terapéuticas se lograron con la evidencia preliminar de actividad anti-tumor observado en pacientes con melanoma avanzado y cáncer de ovario seroso de bajo grado, mientras que en los pacientes con la reducción del tumor de cáncer colorrectal fue raramente documentado.
en un estudio de fase I, los pacientes con cáncer colorrectal se sometieron perfiles moleculares prospectivo para las mutaciones en KRAS, BRAF, y PIK3CA niveles de expresión de PTEN y pMET. Estos pacientes fueron luego ofrecieron por primera vez en humanos estudios de Fase I sobre la base de los resultados de estos perfiles de expresión genética de proteínas /alterados. Las opciones incluyen la segunda generación de anti-EGFR mAb (si KRAS de tipo salvaje), inhibidores de la vía PI3K (si PIK3CA mutación o baja expresión de PTEN), inhibidores de mTORC1 más anti-IGF1R mAb (si baja expresión de PTEN), inhibidores de la vía PI3K más MEK inhibidores (si KRAS o mutación BRAF), inhibidor de BRAF (si la mutación BRAF) y anti-HGF mAB (si es alta expresión pMET) [49].