Extracto
Antecedentes
muestras quirúrgicas han sido utilizados como temas importantes para la investigación del cáncer. De acuerdo con un aumento de la terapia neoadyuvante, las muestras de biopsia se han convertido recientemente imperativo para transcriptoma cáncer. Por otro lado, tanto la biopsia y muestras quirúrgicas están disponibles para perfiles de expresión para predecir el resultado clínico de la terapia adyuvante; Sin embargo, todavía no está claro si los perfiles de expresión de la muestra quirúrgica son útiles para la predicción a través de muestras de biopsia, ya que poco se ha hecho sobre la expresión génica comparativa de perfiles entre los dos tipos de muestras.
Metodología y Hallazgos
Un total de 166 muestras (77 y 89 de biopsia quirúrgica) de las lesiones normales y malignos del esófago se analizaron mediante microarrays. Perfiles de expresión génica se compararon entre biopsia y muestras quirúrgicas. Artificialmente inducida transición epitelio-mesenquimal (aiEMT) se encontró en las muestras quirúrgicas, y también se produjo en las capas de células epiteliales del esófago de ratón bajo una condición isquémica. La identificación de subgrupos clínicamente significativas fue pensado para ser interrumpido por el trastorno del perfil de expresión a través de este aiEMT.
Conclusión y significado
En este estudio se evocará la mala interpretación fundamental que incluye la subestimación de la potencia evaluación pronóstica de los marcadores de la sobreestimación de la EMT en la investigación del cáncer pasado, y se proporcionará un consejo para el futuro próximo de la siguiente manera: 1) la comprensión de cuánto tiempo los tejidos estaban bajo una condición isquémica. 2) La prevalencia de las muestras de biopsia para
in vivo
de perfiles de expresión con sesgos bajas en la investigación básica y clínica. 3) Comprobación del contenido de células cancerosas y la contaminación normal o necrótico del tejido en las muestras de biopsia de prevalencia
Visto:. Aoyagi K, K Minashi, Igaki H, Tachimori Y, Nishimura T, Hokamura N, et al. (2011) inducido artificialmente epitelio-mesenquimal transición en sujetos quirúrgicas: sus implicaciones en Clinical Cancer Research and Basic. PLoS ONE 6 (4): e18196. doi: 10.1371 /journal.pone.0018196
Editor: Irene Oi Lin Ng, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: December 24, 2010; Aceptado 22 de febrero de 2011; Publicado: 21 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Aoyagi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Programa de Promoción de Estudios Fundamentales en Ciencias de la Salud del Instituto Nacional de la innovación biomédica; una subvención-en-Ayudas a la estrategia de 10 años Tercera Integral de Control del Cáncer del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón; Princesa Takamatsu Fondo de Investigación del Cáncer, y la Fundación para la Promoción de la Investigación del Cáncer (RR: T.N.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer es una de las principales causas de muertes en humanos. muchos paises. Perfiles de expresión génica de los microarrays de ADN son individualizados y útil en el diagnóstico y pronóstico de enfermedades [1]. Aunque algunos factores artificiales tales como isquemia, hipoxia, desnutrición y estrés por frío, posiblemente se producen durante la resección quirúrgica y el transporte de la muestra (Figura S1), las muestras quirúrgicas han sido utilizados como temas importantes para la investigación del cáncer clínica y básica. De acuerdo con un aumento de la terapia neoadyuvante (en cabeza y cuello, de esófago, de pulmón, de páncreas, de próstata, y cánceres de mama), las muestras de biopsia se han convertido recientemente imperativo para transcriptoma cáncer. Por otro lado, tanto la biopsia y muestras quirúrgicas están disponibles para perfiles de expresión para predecir el resultado clínico de la terapia adyuvante (en los cánceres de estómago, colon, hígado, vejiga, páncreas, cerebro, riñón, ovario, cervical, y de la mama). Los objetivos para el análisis de microarrays fueron, durante los últimos diez años, la mayoría samplesfrom quirúrgica el desarrollo y la prevalencia de los dos tipos de microarrays: oligonucleótido [2], [3] y el ADNc [4], [5]. Sin embargo, si un gran número de perfiles de expresión de la muestra quirúrgica acumulados son útiles para la predicción mediante el uso de muestras de biopsias de pacientes pretratados todavía no está claro, ya que poco se ha hecho sobre la expresión génica comparativa de perfiles entre los dos tipos de muestras.
quimiorradioterapia (CRT), seguido de la cirugía es el tratamiento estándar para el cáncer de esófago en los países occidentales. En Japón, la quimioterapia neoadyuvante seguida de cirugía y CRT definitiva son las terapias estándar [6], y para los cánceres de esófago localmente avanzado (estadio II o III), la cirugía fue el tratamiento estándar no hace aproximadamente 5 años [7]. Esto nos permite obtener tanto la biopsia y muestras quirúrgicas de pacientes con cáncer de esófago y para comparar los perfiles de expresión génica entre estos dos tipos de muestras. Aquí mostramos que la inducida artificialmente transición epitelio-mesenquimal (aiEMT) se produce en muestras quirúrgicas. Su presencia allí posiblemente ha interferido no sólo con microarray- o investigación clínica basada en immunohistochemistory sino también con la investigación básica.
Resultados
Comparación de los perfiles de expresión entre la biopsia y muestras de tumores de esófago resecado quirúrgicamente Obtenido a partir diferentes Casos
en primer lugar, compararon los perfiles de expresión génica entre 35 muestras de biopsia frescos que no contienen lesión necrótica y 66 muestras de tumores de esófago quirúrgicas, que se obtuvieron de un margen del tumor después de la exposición durante 4-7 horas bajo una condición isquémica , por el agrupamiento no supervisado con 3.126 genes procesados (Materiales y Métodos). No hubo diferencia significativa en la distribución del estadio clínico o patológico entre estos dos conjuntos de los cánceres de esófago porque los tumores localmente avanzados (estadio II o III) son los principales objetivos tanto de la quimiorradioterapia y cirugía [8] - [10]. Sesenta de las 66 muestras quirúrgicas (90,9%) y 29 de las 35 muestras de biopsias (82,9%) apareció en un (izquierda) y el grupo B (derecha) muestra, respectivamente (Figura 1A). Para investigar el número de genes expresados diferencialmente entre estos dos tipos de muestras con la reproducibilidad, se compararon los perfiles de expresión entre los tres conjuntos de muestras independientes (A, B, y C): otra muestra 20 de biopsia versus los tres conjuntos de muestras quirúrgicas (A, B, y C) que contiene 20 casos seleccionados al azar a partir de los 66 casos (Figura 1B, superior). El número de genes expresados diferencialmente seleccionados por u-test (p & lt; 0,01) fueron 2, 295, 2328, y 2, 245 en los conjuntos A, B, y C, respectivamente. Entre estos 3 sistemas, 1.495 genes (65,1% en A, 64,2% en B y 66,6% en C) fueron identificados comúnmente (Figura 1B, superior). Por lo tanto, más de 20% (1,495 /6,000, 24,9%) de los genes son expresados diferencialmente entre la biopsia y muestras quirúrgicas debido a que el número medio de genes detectables en cada caso fue de aproximadamente 6.000. Estos resultados sugieren que existe una gran diferencia entre la biopsia y muestras quirúrgicas.
(A) el agrupamiento no supervisado con 3.126 genes procesados. se muestran quirúrgicos (a) y la biopsia de conglomerados de la muestra (B). (B) Comparación de los perfiles de expresión entre tres conjuntos independientes (A, B, y C): una muestra de 20-biopsia seleccionada al azar versus los tres conjuntos de muestras quirúrgicas (A, B, y C) que contiene 20 casos independientes. El número de genes expresados diferencialmente seleccionados por U-test (p & lt; 0,01): 2, 295 en el conjunto A, 2.328 en el conjunto B, y 2, 245 en el conjunto C (superior). El número de genes expresados diferencialmente con un 3 veces el cambio entre las dos intensidades de señal promedio: 297, 273, y 300. Los resultados de la agrupación con estos conjuntos de genes (inferior). (C) los genes regulados hasta en muestras quirúrgicas o biopsias. Mediante el uso de todos los perfiles en condiciones rigurosas de selección (ver Materiales y Métodos), 38 y 219 genes fueron identificados como hasta reguladas genes en las muestras de biopsia y quirúrgicos, respectivamente.
A partir de la 1.495 genes, se seleccionaron más genes expresados diferencialmente entre los 3 conjuntos que tenían un 3 veces el cambio entre las dos intensidades de señal promedio de cada gen entre la biopsia y muestras quirúrgicas. De los conjuntos A, B, y C, 297, 273, y 300 genes fueron identificados, respectivamente (Figura 1B, inferior). Más del 80% de estos genes estaban sobreexpresados en las muestras quirúrgicas, lo que sugiere una presencia preferencial de factores artificiales o una contaminación de las porciones normales.
Genes
Para hacer frente a la razón de la diferencia, que finalmente seleccionados que expresaban preferentemente en toda la biopsia 35 o 66 muestras quirúrgicas en condiciones severas con u-test (p & lt; 0,01), permutación de prueba, y un cambio de 2 veces, etc. (Materiales y Métodos). Por este procedimiento, 38 y 219 genes fueron identificados como genes regulados hasta en la biopsia y muestras quirúrgicas, respectivamente (Tabla S1 y Figura 1C). Curiosamente, en las muestras quirúrgicas, se han encontrado muchos marcadores de EMT que se expresa preferentemente y con frecuencia. resultados de microarrays de 13 marcadores de EMT representativas incluyendo la fibronectina (FN), vimentina (VIM) y colágenos (cols) se muestran en la Figura 2A. Por otra parte, también se encontraron transductores de señal de membrana tales como citoquinas, quimioquinas y receptores que ser hasta reguladas en las muestras quirúrgicas. microarrays representante y los resultados de RT-PCR de
IL8
,
CXCR4
,
CXCL9
,
PDGFRB
,
CCL5
, y
TLR2
, respectivamente, se muestran en las Figuras 2B y 2C. En correspondencia con la EMT, E-cadherina (
CDH1
) se encontró que se redujeron reguladas en las muestras quirúrgicas (Figura 2A, la derecha más baja).
(A) Los patrones de expresión de un epitelio marcador de células e-cadherina (
CDH1
) y marcadores de EMT típicos incluyendo fibronectina (
FN
), vimentina (
VIM
), y colágenos (
Las CDA
). (B) Los patrones de expresión de transductores de señal 6 de membrana: una citocina (
IL8
), dos quimiocinas (
CXCL9
y
CCL5
), y tres receptores de tipo membrana (
CXCR4
,
PDGFRB
, y
TLR2
). (C) los resultados semi-cuantitativos de RT-PCR de estos 6 transductores de membrana en muestras representativas.
Comparación de los perfiles de expresión entre las muestras de biopsias quirúrgicas y muestras de tumor resecado esofágicas obtenida en casos idénticos
de la misma forma anterior, se compararon los perfiles de expresión de genes entre 18 biopsia y 18 muestras de tumores de esófago resecado quirúrgicamente, y se seleccionaron 41 y 716 genes que fueron identificados como genes regulados en los dos tipos de muestras, respectivamente (Tabla S2 y la figura 3). De acuerdo con los resultados anteriores de diferentes casos, también se han encontrado muchos marcadores de EMT y transductores de señal de membrana para ser hasta reguladas con frecuencia en las muestras quirúrgicas (Figura 4A). Más importante aún, dos reguladores de la EMT,
ZEB1
y
ZEB2
, y algunos factores de transcripción miogénica relacionados EMT-incluyendo
MEOX2
y
MEF2C
fueron capaces de ser seleccionado como genes regulados en las muestras quirúrgicas (Figuras 4A). Cuantitativa en tiempo real RT-PCR confirmó la sobreexpresión de
ZEB1
,
ZEB2, FN, y VIM
en las 18 muestras quirúrgicas de asuntos idénticos (Figura 4B). La sobre-expresión de
ZEB1
y
ZEB2
también se encontró en las 66 muestras quirúrgicas de diferentes casos (figura S2), aunque estos dos reguladores de la EMT no se pudieron obtener a partir de los perfiles de expresión bajo el encima de las condiciones estrictas. Snai1 /Caracol, SNAI2 /Slug, ZEB1 /ZFHX1A, ZEB2 /SIP1 /ZFHX1B, TWIST1 /TWIST, y TWIST2 son reguladores EMT representativas [11], [12]. Entre ellos,
TWIST1
así como dos
ZEBs
estaban sobreexpresados en los dos grupos de tumores de esófago (Figura S3). Para investigar si aiEMT en los niveles de mRNA afecta inmunohistoquímica (IHC), se realizó IHC en un típico vimentina marcador mesenquimal en la biopsia y muestras quirúrgicas de los casos idénticos. En primer lugar se determinó condiciones en las que no podían ser teñidas capas de células epiteliales normales, pero las células tumorales con EMT podría ser (Figuras 5A, 5B), ya que las capas no diferenciadas (basales y parabasales) se han reportado para expresar genes relacionados con el EMT incluyendo
VIM
[4]. En 3 de cada 5 pares de las muestras examinadas, se encontraron lesiones tumorales de una muestra quirúrgica para ser teñidas más alto que los de una muestra de biopsia (Figuras 5C-H); sin embargo, los 2 pares restantes no mostraron tal diferencia (datos no mostrados). Por lo tanto, se pensaba que el aiEMT que se produjo en las muestras quirúrgicas en el nivel de mRNA de afectar sólo un subconjunto de muestras quirúrgicas en el nivel de proteínas relacionadas con la EMT.
Mediante una selección rigurosa (véase Materiales y Métodos), 41 y 716 genes fueron identificados como hasta reguladas genes en las muestras de biopsia y quirúrgicos, respectivamente.
(A) los patrones de expresión de 2 reguladores EMT representativos (
ZEB1
y
ZEB2
), 8 marcadores de EMT típicos incluyendo fibronectina (
FN
), vimentina (
VIM
), 3 colágenos (
COL1A2
,
COL3A1
y
COL14A1
),
FBN1
,
MYH11
, y
ACTC1
y 2 myogenic factores de transcripción relacionados con la EMT-(
MEOX2 Opiniones y
MEF2C
). (B) en tiempo real los resultados cuantitativos de RT-PCR de
ZEB1, ZEB2, FN, y VIM
. Caja cerrada: muestra quirúrgica; Caja abierta:. muestra de biopsia
IHC de vimentina en una muestra quirúrgica adicional, que contenía porciones normales, mostró que las células epiteliales del esófago normales no estaban manchadas, pero las células tumorales invasoras eran (A, B). En 3 de los 5 pares de biopsias y piezas quirúrgicas, se observó la sobre expresión de vimentina en las muestras quirúrgicas. (Biopsia: C, E, G; quirúrgica: D, F, H) guía empresas
La sobreexpresión de la
ZEB1
,
ZEB2
, y
Hoteles en TWIST1 resecado quirúrgicamente tejidos normales
Se obtuvieron muestras de biopsia 4 y 5 muestras quirúrgicas de no tejidos cancerosa, y compararon sus perfiles de expresión. De la misma manera con los anteriores perfiles de expresión de los tejidos tumorales (Figuras 2, 4, S2 y S3), tres reguladores de la EMT (
ZEB1
,
ZEB2
, y
) y dos marcadores de EMT típicos (
VIM Opiniones y fueron encontrados
FN
) que se expresa en off en las 5 muestras quirúrgicas (Figura 6A). Nuestro informe anterior que muestra la participación de ZEB2 y TWIST1 en la EMT de las células epiteliales normales y malignos de esófago [9] apoya la presencia allí de EMT inducida artificialmente.
(A) La sobreexpresión de la EMT-reguladores (
ZEB1
,
ZEB2
, y
TWIST1
) y EMT-marcadores (
VIM
y
FN
) en condiciones normales el esófago resecado quirúrgicamente mucosa. (B) La inducción de ratón
ZEB1
,
Zeb2
,
Vim
, y
Fn
bajo condición isquémica. Después de la resección del esófago del ratón, lo colocamos en PBS durante 0 o 4 horas a temperatura ambiente (menos de una condición isquémica), secciones congeladas hechas inmediatamente, capturamos la capa de células epiteliales (superior) mediante microdisección láser, amplificado ARNm por TALPAT [24] - [28], y los perfiles de expresión obtenidos utilizando el ratón expresión serie 430 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los experimentos se realizaron en 3 ratones. El
ZEB1
,
Zeb2
,
Vim
, y
Fn
genes son inducidos 4 horas después de la resección (Baja). *
P Hotel & lt; 0,05. (C) en tiempo real RT-PCR cuantitativa de
ZEB1
,
Zeb2
,
Vim
, y
Fn
. La sobreexpresión de la
ZEB1
,
Zeb2
,
Vim
, y
Fn
, mostrado por microarrays, se confirmó.
por último, para investigar si estos 5 genes se inducen en las células epiteliales de la isquemia relacionada con la resección quirúrgica, hemos resecado un esófago del ratón, y lo colocó en PBS durante 0 o 4 horas, e inmediatamente se hicieron cortes congelados, seguido por capturada por láser microdisección de las capas de células epiteliales (Figura 6B, parte superior). perfiles de expresión de las capas de células epiteliales del ratón a 0 o 4 horas después de la resección del ratón revelaron que
ZEB1
,
Zeb2
,
Vim
, y
Fn
fueron inducidos 4 horas después de la resección (Figura 6B, bajar). Cuantitativa en tiempo real RT-PCR confirmó la sobreexpresión de
ZEB1
,
Zeb2
,
Vim
, y
Fn
después de la resección (Figura 6C) . Dado que la sensibilidad global de vectores Affymetrix ratón se sabe que es más baja que en los seres humanos, y el uso de una pequeña cantidad de ARN tales como sujetos láser capturado también es conocida para reducir la sensibilidad de microarrays,
TWIST1
mRNA en sí no podía ser detectado en este experimento ratón (datos no mostrados).
Para investigar si aiEMT en los niveles de mRNA afecta IHC, se realizó IHC en un típico vimentina marcador mesenquimal 8 horas después de la resección. A continuación se determinó condiciones en las que se tiñen capas de células epiteliales normales. En todas las 3 muestras independientes examinados, no se encontraron capas de células epiteliales normales a ser manchado altamente 8 horas después de la resección (Figuras 7A-C). La discrepancia entre el nivel de ARNm y proteínas se puede explicar por las siguientes dos razones: 1) aunque se han reportado capas diferenciadas (basales y parabasales) para expresar los genes relacionados con la EMT-incluyendo
VIM
[4], su los niveles de expresión fueron muy inferiores a tumor (Figura 5B). 2) También puede ser difícil para mostrar el cambio aproximado de 2 veces en el nivel de mRNA (figuras 6B, C) como en el nivel de proteína por IHC, porque IHC es inferior a la RT-PCR en la sensibilidad y la cuantificación.
Después de la resección del esófago del ratón, se lo colocó en PBS durante 0, 4, 8 horas a temperatura ambiente (bajo un estado isquémico), inmediatamente hizo secciones congeladas, y IHC de vimentina se llevó a cabo en condiciones más sensibles en comparación con la figura 5 . Los experimentos se realizaron en 3 ratones (a-C). La sobreexpresión de la vimentina en el epitelio esofágico ratón no se observó incluso después de 8 horas de exposición bajo una condición isquémica. Flecha: vimentina-positivas del músculo liso, punta de flecha:. Capas de células epiteliales del esófago de ratón estratificadas
Todos los resultados sugieren que la EMT, especialmente en el nivel de ARNm, se induce artificialmente en tanto epiteliales normales y malignos Las células de los eventos relacionados con la resección quirúrgica (hipoxia-isquemia inducida y la desnutrición, y la inflamación inducida por hipoxia, etc.).
artificialmente inducida EMT (aiEMT) por la identificación de subgrupos basados en microarrays resección quirúrgica Previene
identificación de subgrupos clínicamente significativos es muy importante para la medicina personalizada y para el desarrollo de medicamentos contra los casos intratables. Cuando se utilizaron los perfiles de expresión de las 35 muestras de biopsias obtenidas de pacientes tratados con quimiorradioterapia [8], el agrupamiento no supervisado con 5.570 genes procesados (Materiales y Métodos) identificaron un grupo de buena respuesta que consiste en 9 pacientes (7/9, 78% que muestra completa respuesta a la quimiorradioterapia) de la 35 (Figura 8A, la izquierda). Sin embargo, cuando se utilizaron los perfiles de las 66 muestras quirúrgicas, sin agrupación con 2.016 genes procesados no pudo identificar ningún subgrupo (Figura 8A, derecha). Por lo tanto, los perfiles de expresión de la muestra de biopsia parecía ser más eficaz en la identificación de subgrupos de los de las muestras quirúrgicas. De hecho, hemos informado anteriormente que los perfiles de expresión muestra de biopsia podían distinguir los supervivientes a largo plazo oa corto plazo de quimiorradioterapia definitiva [8]; Sin embargo, los perfiles de expresión de muestras quirúrgicas nunca se identificaron subgrupos de mal pronóstico con una amplia metástasis en ganglios linfáticos [10]. Por otra parte, en las muestras quirúrgicas, EMT se aceleró en 36 (85,7%) de los 42 cánceres de esófago [9]. Este alto porcentaje parece ser causada por aiEMT.
(A) el agrupamiento no supervisado de 35 biopsia y 66 resecado quirúrgicamente muestras de tumores de esófago con 5.570 y 2.016 genes transformados, respectivamente. Una agrupación de la muestra con 2.971 genes sólo aparece en las muestras de biopsia. (B) Comparación del número de genes procesados de agrupamiento no supervisado entre la biopsia y muestras quirúrgicas. El número de genes procesados y genes comúnmente seleccionados se indica. (C) Distribución de frecuencias para el porcentaje de muestras de conjuntos de genes procesados por último. Cada distribución de 5, 570 genes en muestras de biopsia (izquierda) y 2.016 genes en muestras quirúrgicas (derecha) se indica.
Para hacer frente a la razón por la cual es difícil en subgrupos muestras quirúrgicas, se comparó el número y la distribución de cada uno de los genes transformados, que fueron utilizados para el agrupamiento no supervisado. Nos primero seleccionaron los genes con una intensidad de señal de más de 1000 en más de 10% de las muestras. De 35 muestras de biopsia y 66 quirúrgicas, 6.551 y 4.797 genes, respectivamente, fueron seleccionados. De estos genes, se seleccionaron finalmente más de 3 veces genes modificados mediante la comparación de la intensidad de señal media de cada gen en más de 10% de las muestras. En las muestras de biopsia 35, 85% (5570) de 6.551 genes primero procesados se mantuvo, mientras que el número de genes transformados finales disminuyó de 4.797 primeros genes transformados a 2,016 (42%) (Figura 8B, parte superior). De los 2.016 genes finalmente procesados en las muestras quirúrgicas, 1.724 (86%) se incluyeron en los 5.570 genes finalmente procesados en las muestras de biopsia; sin embargo, 3846 (69%) de 5.570 genes eran únicas para las muestras de biopsia (Figura 8B, inferior). Por otra parte, la distribución de frecuencias (por porcentaje de muestras) de estos dos conjuntos de genes finalmente procesada muestra que aproximadamente el 60% de los 2.016 genes transformados en las muestras quirúrgicas expresa sólo en un número limitado de casos (0-10%) (Figura 8C) . En consecuencia, aiEMT en muestras quirúrgicas puede disminuir el número de genes procesados útiles para la identificación de subgrupos.
Discusión
Recientemente hemos informado de la presencia de diafonía entre Hedgehog (Hh) y EMT de señalización en condiciones normales y malignos células epiteliales del esófago [9]. En ese informe,
ZEB2
ha demostrado ser un gen aguas abajo tanto de un transductor GLI1 transcripcional primaria en la señalización de Hh y de otro regulador de la EMT, TWIST1, y que ZEB2 más arriba reguladas 5 de quimiocinas o receptores de factores de crecimiento,
PDGFRA
,
EDNRA
,
CXCR4
,
VEGFR2
, y
TRKB gratis (figura S4). El bloque de señal Hh inhibe la diferenciación de los queratinocitos de esófago y cáncer de células invasión y el crecimiento. En consecuencia, la sobre-expresión de
ZEB2
y
TWIST1 Hoteles en muestras quirúrgicas de ambos tejidos normales y tumorales pueden inducir EMT, lo que resulta en la sobre-expresión de los marcadores de EMT representativos
VIM
,
FN
, y
cols
(Figuras 2, 4, 6, S2 y S3) y transductores de señal de membrana
IL8
,
CXCL4
,
CCL5
,
CXCR4
,
PDGFRB
, y
TLR2 gratis (Figura 2). La sobreexpresión de la membrana transductores de señales puede activar aún cascadas de aguas abajo. Esta es una razón importante por la gran diferencia de los perfiles de expresión entre la biopsia y muestras quirúrgicas (Figuras 1 y 3).
Amplia contaminación de porciones mesenquimales normalmente en los tejidos tumorales resecado quirúrgicamente puede también explicar la sobreexpresión de los reguladores de la EMT y los genes relacionados con la EMT, a pesar de que los patólogos entrenados cuidadosamente extirpados muestras de tejido grueso del tumor principal, dejando un margen claro desde el tejido normal circundante (Materiales y Métodos). Sin embargo, la sobre-expresión también se observó en las capas de células y tejidos epiteliales normales de ratón quirúrgicamente resecados 4 horas después de la resección (Figura 6). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la EMT inducida artificialmente, denominado aiEMT, se produce tanto en las células epiteliales normales y malignas de los eventos quirúrgicos relacionados con la resección (hipoxia-isquemia inducida, desnutrición inducida por isquemia y la inflamación inducida por hipoxia, etc.) (Figura S1 ).
Recientemente, se ha informado de los factores inducibles por hipoxia (HIF-1a o HIF-2A) para regular directamente TWIST1 [13], [14] y LOXL2, que al parecer se estabilizó un regulador de la EMT, Snai1 /CARACOL, a través de la interacción física en el dominio SLUG y residuos de lisina de caracol K98 y K137 [15]. El sitio de unión Snai1 también se encontró en la región promotora 5 'de
ZEB2
[16]. La sobreexpresión de ambos
HIF1A
y
LOXL2
se observó sólo en los tejidos tumorales resecado quirúrgicamente obtenidas a partir de diferentes casos (Figura S5). Por otra parte, otros
HIF1
familias (
HIF1B
y
HIF2A
) fueron nunca se sobre-expresan en ninguna de las muestras quirúrgicas. Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos moleculares de aiEMT en muestras quirúrgicas se mantiene para estudios futuros. Sin embargo, hemos observado que la hipoxia y /o inflamación inducida por isquemia se ha reportado para liberar la represión de NFkB [17], que regula
ZEB1
,
ZEB2
, y
TWIST1
[18], [19] y que la señalización de TGF-β puede estar implicado en aiEMT, debido a la sobre expresión de
NFKB1
y
TGFBR2
se encontró en las muestras quirúrgicas (Figura S6).
como se mencionó en la introducción, las muestras quirúrgicas se han utilizado como temas importantes para la investigación del cáncer clínica y básica durante muchos años. Por lo tanto, aiEMT en muestras quirúrgicas puede haber posiblemente interferido o impedido no sólo microarray- o basado en inmunohistoquímica investigación clínica (identificación marcador de diagnóstico, subgrupo, haciendo predictores y la evaluación pronóstico, etc.), sino también la investigación básica (haciendo un mapa señal vía , la identificación de objetivos terapéuticos, etc.). Este estudio es probable que evocan la mala interpretación fundamental que incluye la subestimación de la potencia evaluación pronóstica de los marcadores de la sobreestimación de la EMT en la investigación del cáncer pasado, y proporcionará un consejo para el futuro próximo de la siguiente manera: 1) la comprensión de cuánto tiempo los tejidos estaban bajo una condición isquémica ( desde el inicio de la resección de la acción o la preparación de ARN). La cantidad total de tiempo que nunca debe exceder de 4 horas. 2) La prevalencia de las muestras de biopsia para
in vivo
de perfiles de expresión con sesgos bajas en la investigación básica y clínica; por ejemplo, para la predicción clínica resultado de no sólo neoadyuvante sino también quimioterapia adyuvante, radioterapia y quimioterapia, tales como en los informes anteriores [8], [20] - [23]. 3) Comprobación del contenido de células cancerosas y la contaminación normal o necrótico del tejido en las muestras de biopsia de la prevalencia. En el muestreo por una biopsia con aguja, porciones tumorales (2mm x 2mm) se debe obtener de un margen (periferia) del tumor mediante la exclusión de las lesiones necróticas centrales conforme a la endoscopia. Si las lesiones necróticas fueron severamente contaminados en las muestras, las muestras deben quedar excluidos por la cuantificación y calificación de ARN. Si las muestras contenían lesiones extensas normales, estas muestras pueden ser excluidos por el método de puntuación basado en perfiles de expresión utilizando genes específicos normales y /o tumorales.
Materiales y Métodos
Muestras de Tejido
Todo el cáncer de esófago (carcinomas de células escamosas) y los tejidos no cancerosos fueron proporcionados por el hospital central o el hospital del Este del Centro Nacional del cáncer después de obtener el consentimiento informado por escrito de cada paciente y la aprobación del Comité de Ética del Centro.
todas las muestras quirúrgicas se obtuvieron de los pacientes sin tratamiento neoadyuvante, y se obtuvieron todas las muestras de biopsia antes del tratamiento. Para las muestras quirúrgicas, patólogos entrenados cuidadosamente extirpados muestras de tejido a granel del tumor principal, dejando un margen claro desde el tejido normal circundante. De este modo, se obtuvieron muestras quirúrgicas de un margen (periferia) del tumor. Para las muestras de biopsia de aguja, las porciones tumorales (2 mm x 2 mm) se obtuvieron en la endoscopia de un margen del tumor por la exclusión de cualquier lesiones necróticas centrales. Si las muestras fueron severamente contaminados por lesiones necróticas, las muestras fueron excluidos por la cuantificación y calificación de ARN. Si las muestras contenían lesiones extensas normales, se excluyeron tales muestras por el método de puntuación basado en el perfil de expresión usando genes específicos normales y /o tumorales (en preparación).
El proceso general de una operación de cáncer de esófago requiere mucho tiempo . Por lo tanto, las muestras quirúrgicas fueron extirpados de un margen del tumor por los patólogos formados después de la exposición durante 4-7 horas bajo una condición isquémica, y se congelaron inmediatamente a -80 ° C hasta su uso. Por el contrario, las muestras de biopsia de aguja resecados bajo endoscopia se congelaron inmediatamente a -80 ° C hasta su uso. la información clínico-patológico se da en las Tablas S3, S4, S5.
microdisección por láser seguido de extracción de ARN y la amplificación
secciones de criostato (8μm) de muestras de esófago ratón congelados fueron láser microdissected con el MMI CellCut sistema (MMI Inc., Rockledge, FL). El ARN total se aisló mediante la suspensión de las células en un tampón de lisis ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japón), seguido de precipitación con isopropanol. ARN se amplificó mediante un método eficiente de la amplificación de mRNA de alta fidelidad, llamado TALPAT (T7 RNA promotor unido de la polimerasa, mediada por ligación del adaptador, y la amplificación por PCR seguida por
in vitro
T7-transcripción) [24-28 ]
Análisis de microarrays
perfiles de expresión génica se obtuvieron de 166 muestras:. conjuntos diferentes de tumores (casos) de independientes 35 y 20 muestras de biopsia y 66 muestras quirúrgicas, otro tumor establecido (caso idéntico) de 18 muestras de biopsia y 18 muestras quirúrgicas, un conjunto normal de 4 muestras de biopsia y 5 muestras quirúrgicas. Total de ARN extraído de las muestras de tejido fueron a granel marcado con biotina y se hibridan con micromatrices de oligonucleótidos de alta densidad (Human Genome U95Av2 o matriz U133PLUS2.0, Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para capas de células de ratón láser capturado esofágicas epiteliales, se utilizó genoma del ratón 430 2,0 Array. Los datos escaneados de las matrices fueron procesadas por Affymetrix Microarray Suite versión 4.0 o 5.0, que escala la intensidad media de todos los genes en cada matriz a una señal objetivo de 1000 para comparar de forma fiable múltiples matrices variables. Todos los datos de microarrays se han depositado en una base de datos compatible con MIAME, GEO; el número del mismo SuperSeries GSE22954.
gen de selección a partir de microarrays de datos y la agrupación jerárquica
La agrupación jerárquica se utiliza ampliamente como uno de los métodos de aprendizaje sin supervisión. La agrupación jerárquica de los microarrays de datos se realizó mediante el uso de GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., CA, EE.UU.), Microsoft Excel y Cluster & amp; software TreeView [29] .Para agrupamiento no supervisado (Figuras 1A y 8A), se seleccionaron primero los genes con una intensidad de señal de más de 1000 en más de 10% de las muestras, y a partir de estos genes, que finalmente selecciona más de 3 veces las modificaciones de los genes mediante la comparación de la intensidad de señal media de cada gen en más de 10% de las muestras. Para los genes sobreexpresados en las muestras quirúrgicas o biopsias, se seleccionaron primero genes de u-test (p & lt; 0,01), permutación de prueba, y el cambio de 2 o 3 veces entre las intensidades de señal promedio de los dos conjuntos de muestras, y de la primer seleccionado los genes que finalmente seleccionaron los genes con más de 1.000 en la intensidad media de la señal.
semi-cuantitativa y RT-PCR cuantitativa
el ARN total se aisló mediante la suspensión de las células en tampón de lisis Isogen (Nippon gene, Toyama, Japón), seguido de precipitación con isopropanol.