Extracto
microARN (miARN) jugó un papel importante en la progresión del cáncer de hígado y sus valores de diagnóstico y pronóstico han sido estudiados con frecuencia. Sin embargo, diferentes técnicas de microarrays y el tamaño pequeño de la muestra condujeron a resultados contradictorios en estudios previos. Se realizó un metanálisis integral de un total de 357 muestras de tumor y 283 no cancerosos de 12 publicados estudios de expresión de genes miARN utilizando robusto método de agregación rango. Como resultado, hemos identificado una diferencia estadísticamente significativa meta-firma de cinco upregulated (miR-221, miR-222, miR-93, miR-21 y miR-224) y cuatro downregulated (miR-130a, miR-195, miR 199a y miR-375) miRNAs. A continuación, realizó miARN objetivo de predicción y análisis de vías de enriquecimiento para encontrar cuál es el proceso biológico estos miRNAs pueden afectar. Se encontró que la mayor parte de las vías se asocia frecuentemente con la señalización celular y la patogénesis del cáncer. Así, estos miRNAs pueden implicar en la aparición y progresión de cáncer de hígado y servir como potenciales dianas de diagnóstico y terapéuticos de esta malignidad
Visto:. Yang J, Han S, Huang W, Chen T, Liu Y, Pan S , et al. (2014) Un Meta-Análisis de la expresión de microARN en cáncer de hígado. PLoS ONE 9 (12): e114533. doi: 10.1371 /journal.pone.0114533
Editor: Isabelle A. Chemin, el CRCL-INSERM, Francia |
Recibido: 3 Julio, 2014; Aceptado: 10 de noviembre de 2014; Publicado: 9 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se incluyen dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Proyecto de Investigación de Guangxi Universidades (201203YB035) y Guangxi Proyecto Clave de Ciencia y Tecnología (1355005-4-8). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de hígado en los hombres es la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer y es la sexta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres, lo que hace que aproximadamente 700 mil muertes por año con cerca de 750 mil casos nuevos diagnosticados en todo el mundo. [1] La supervivencia baja se atribuye a un diagnóstico tardío, la resistencia a la quimioterapia, la recurrencia del tumor y la metástasis, por lo tanto, haciendo hincapié en la necesidad de nuevos diagnósticos y terapéuticos. Numerosos estudios de expresión génica han demostrado que una activación aberrante general de las vías de señalización se atribuyó a la oncogenicidad, sin embargo, una firma o una sola vía característica prominente podrían no ser definidos en el cáncer de hígado. [2]
microARNs (miARN), pequeños ARN no codificante de 18-25 nucleótidos de longitud, que se consideraban para controlar la expresión génica en casi todas las células cancerosas, se investigaron con respecto a la ocurrencia, el progreso abundantemente, clasificación, diagnóstico y tratamiento de tumores recientemente. La participación de miRNAs en la patogénesis del cáncer está bien establecido, ya que pueden comportarse como oncogenes o genes supresores de tumor en función de la función celular de sus objetivos. [3] La comprensión de la biología de los miARN y su contribución al desarrollo del cáncer puede prometer el diagnóstico precoz y el control efectivo de los tumores malignos.
Los resultados recientes de perfiles de estudios integradores y basados en el mecanismo han proporcionado información importante acerca de las funciones de miRNAs en las células normales y condición de la enfermedad. Estos estudios podrían mejorar nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de las enfermedades crónicas del hígado y cáncer de hígado. Numerosos estudios que relacionan a la desregulación de la expresión de los genes miARN de cáncer de hígado se han reportado con métodos múltiples. [4] Sin embargo, debido a la aplicación de diferentes plataformas tecnológicas y el tamaño pequeño de la muestra, la expresión de los genes miARN perfiles de esfuerzos han dado lugar a resultados inconsistentes entre los estudios.
Para superar las limitaciones en las investigaciones actuales, se realizó un meta -análisis de aplicar el método de agregación sólido rango, [5] seguido por la vía de análisis, para identificar los genes miARN la desregulación en el cáncer de hígado y las vías que miRNAs clave pueden tener un impacto. El método de validación cruzada de dejar uno de salida se utilizó para validar los resultados. Identificación de los genes miARN meta-firma y invovled vías proporcionarían objetivos potenciales para más estudios experimentales del desarrollo del cáncer de hígado.
Material y Método
Selección de los estudios y la extracción de datos
Una sistemática búsqueda bibliográfica se realizó para la identificación de los estudios de cáncer de hígado miARN expresión de perfiles utilizando una estrategia de búsqueda de dos niveles. En primer lugar, se realizó una búsqueda basada en la web en Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm.-nih.gov/geo/) usando término de búsqueda ( "Neoplasias (" [Mesh] Y "Hígado" [Mesh]) Y "Los microARNs" [Mesh]) y "seres humanos" [Mesh]. Para realizar una recuperación completa, buscando en ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress), también se llevaron a cabo el PubMed y la base de datos Embase. En segundo lugar, las listas de referencias de todos los estudios pertinentes y existentes fueron revisados a través de una búsqueda manual para su posterior identificación de los posibles estudios pertinentes.
Los resúmenes fueron seleccionados cuidadosamente y se evaluaron los textos completos de los resúmenes pertinentes potenciales. Se incluyeron estudios con diseño experimental original que analizaron la expresión de los genes miARN perfiles en los humanos entre los tejidos de cáncer de hígado y los tejidos no tumorales del hígado. Mientras tanto, los estudios no fueron elegibles para el metanálisis si cumplían los siguientes criterios de selección:. 1) utilizando únicamente las líneas celulares, 2) preseleccionada investigación genes candidatos, 3) perfiles diferentes subtipos clínicos o histológicos sin incluir tejidos no tumorales
Las listas de los miRNAs expresados estadísticamente significativas fueron extraídos de publicaciones. Se estableció contacto con los autores cuando no se pudieron obtener las listas. Todos los nombres de miARN se estandarizaron a través de la versión miRBase 20. miRNAs que no se pueden relacionar con cualquiera -3P o -5p en miRBase fueron designados con hsa-miR *, tales como HSA-miR-210. Los identificados como entrada muertos en miRBase se quedaron sus nombres mencionados en las literaturas
El análisis estadístico
Las listas de miRNAs se extrajeron basan en los valores de p de la prueba estadística (. & Lt; 0,05 fue considerado significativo ). Entonces, miRNAs en todas las listas fueron priorizados por los cambios veces u otros valores que podrían indicar el grado de desregulación. Para asegurarse de que miRNAs extraídos se pueden clasificar de una manera más fiable, se utilizó robusto método de agregación rango. [5] El método se basa en la comparación de los datos reales con un modelo nulo que asume orden aleatorio de listas de entrada. Un P-valor asignado a cada elemento de la lista agregada describe cuánto mejor se clasificó de lo esperado. En caso de resultados positivos falsos, se realizó la corrección de Bonferroni. Mientras tanto, para evaluar la estabilidad de los valores de p adquiridos, deje un out validación cruzada se aplicó en el algoritmo robusto agregación de valor. Un valor de p se obtuvo un promedio de las listas de genes al azar después de repetir el análisis de 10.000 veces.
La agrupación de análisis
Para investigar las correlaciones entre los perfiles de expresión de genes miARN de los estudios individuales, se realizó la agrupación jerárquica utilizando los miRNAs desregulados. Se llevó a cabo en dos dimensiones-vinculación media de la agrupación jerárquica de una matriz de similitud de correlación de Spearman construido a partir de análisis separados para las listas de genes upregulated y downregulated.
identificación integrativa de los genes miARN objetivos
Los miRNAs meta-firma fueron seleccionados para la predicción de destino mediante TargetScan base de datos versión 6.2 [6], PicTar (predicciones a partir de la base de datos miRWalk) [7] y diana-microT-CDS v5.0 (usando MITG umbral de puntuación de 0,7) [8]. TarBase v6.0database [9] y la base de datos CLIP-Sec base estelar [10] se utilizaron para adquirir objetivos validados. Para mejorar la precisión de la predicción blanco, blancos de consenso se extrajeron de los objetivos previstos por la superposición de al menos dos algoritmos más validados objetivos de TarBase y base estelar.
Análisis de enriquecimiento
Para identificar las vías de predijo miARN objetivos, Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG), las vías de la pantera y términos de ontología de genes se llevaron a cabo con la herramienta web GENECODIS (http://genecodis.dacya.ucm.es/). [11]
Resultados
Selección de los estudios y la extracción de datos
búsquedas de bases de datos inicialmente produjeron un total de 251 publicaciones y 16 estudios cumplieron los criterios de inclusión. (Fig. 1) Cuatro investigaciones [12] - [15] fueron excluidos en el análisis final, ya que las listas de clasificados miARN no eran ni públicamente ni personal disponible de los autores correspondientes. La mayoría de los estudios fueron publicados entre 2009 y 2013. Dos tercios de las investigaciones vinieron de región de Asia y los restos fueron proceden de América y Europa. Además, los estudios incluidos utilizaron diferentes plataformas de microarrays y el número medio de sondas de genes miARN fue 626 (que van desde 121 hasta 1205). Se incluyeron un total de 357 muestras de tumor y 283 no cancerosos. La mayoría de los estudios se centraron en el carcinoma hepatocelular (HCC) en comparación con los tejidos adyacentes nontumorous o tejidos hepáticos normales, excepto Cario 2010 y Selaru 2009, que se centraron, respectivamente, en el hepatoblastoma (HB) y colangiocarcinoma (CCA). Las principales características de estos estudios se enumeran en la Tabla 1.
En total, se registraron 136 miRNAs como upregulated significativamente y 138 como downregulated significativamente en los estudios incluidos. El número de miRNAs desregulados significativamente varió considerablemente entre los estudios (de entre 14 y 91).
Cluster análisis
Para evaluar el grado de concordancia entre las listas de genes miARN y la posible correlación de acuerdo con los subgrupos de tumores histología, región y tamaño de la muestra, el análisis de agrupamiento jerárquico se realizó (Figura S1). La agrupación de estas listas mostró que los resultados de Shih 2012, Sato 2011 y Li 2008 utilizando los tejidos HCC eran más similares entre sí que otros estudios. Los resultados más similares eran Li y Li 2008-1 2008-2, llevado a cabo por el mismo grupo de trabajo utilizando la misma plataforma, aunque el tamaño de la muestra es muy diferente. No está claro si existe una cierta superposición de las muestras entre los dos estudios, pero si este es el caso, puede ser una explicación para la gran similitud de los resultados. No se observaron similitudes obvias entre más otros subgrupos.
Mirna meta-firma
Se identificó una diferencia estadísticamente significativa meta-firma de cinco miRNAs upregulated y downregulated cuatro miRNAs en muestras de cáncer de hígado en comparación con el hígado no canceroso tejido de acuerdo con la permutación p-valor. (Tabla 2) Sólo dos miRNAs upregulated downregulated pero no alcanzaron significación estadística después de la corrección de Bonferroni. El número de estudios meta-miRNAs firma informó variado en gran medida, pero al menos tres miRNAs desregulados fueron reportados por cada estudio, con la excepción de El Cairo de 2010 y Selaru 2009, que acaba de informar por separado dos miRNAs upregulated. El miRNAs significativamente más desregulado, miR-221, miR-222, se presentan, respectivamente, por los nueve y diez conjuntos de datos. Por otra parte, los valores de p de permutación de otros tres miRNAs upregulated, miR-93, miR-21 y miR-224 y cuatro miRNAs downregulated, miR-130a, miR-195, miR-199a y miR 375 son & lt; 0,05, pero no alcanzan la significación corregida.
Meta-firma genes miARN se encuentran dispersos en diferentes localizaciones cromosómicas con una excepción de miR-221 y miR-222 genes, los cuales están ubicados en Xp11.3. MIR-224 genes se encuentran en la misma región cromosómica, Xq28, que es una región citogenética que contiene una gran parte de la familia de genes de antígenos de cáncer /testículo. [16]
predicción de destino y el análisis de enriquecimiento
objetivos de consenso para miRNAs que alcanzan significación robusta agregación rango se extrajeron de los objetivos previstos por la superposición de al menos dos algoritmos más validadas experimentalmente objetivos a partir de dos bases de datos. El veraniega de los recuentos de destino se presenta en la Fig. 2. miR-130a y miR-195 tienen más objetivos que otros miRNAs, mientras que miR-199a no tiene objetivos, ya que fue predicho por un único algoritmo.
análisis de enriquecimiento se realizaron utilizando genes objetivo previsto con GENECODIS herramienta web. Varias vías enriquecidas por KEGG vías y Panther eran relativamente importantes y la mayoría de ellos se asocian con frecuencia a la señalización celular (por ejemplo, la neurotrofina, Wnt, FGF, y vía de señalización de p53) y el cáncer. (Tabla 3, Fig. 3, S2 Figura)
La intensidad del color representa el valor de p corregido-FDR. Sólo se muestran esas vías, que son significativas durante más de cuatro miRNAs (se dispone de datos completos como S2 Figura).
Discusión
Uso robusto método de agregación rango, 14 miARN listas priorizadas de los 12 estudios publicados fueron analizados y finalmente identificaron cinco upregulated y downregulated miRNAs cuatro. Pero después de la corrección de Bonferroni sólo dos miRNAs upregulated llegaron a la diferencia estadística.
Los miRNAs desregulados identificados por diferentes centros de investigación no permiten una conclusión coherente. Las diferencias entre las técnicas de microarrays, etapa del tumor, aspecto histológico y factores etiológicos atribuirse a la heterogeneidad. [17] Ha habido intentos de dividir los datos en subgrupos sobre la base de la plataforma y del tipo de tumor subtipo, pero ninguno de los dos estudios se han utilizado misma plataforma y la mayoría de las muestras tumorales fueron de HCC tejidos. Sin embargo, el análisis de conglomerados demostró que dos conjuntos de datos llevada a cabo por un grupo de trabajo utilizan una plataforma idéntica hechas alta similitud y anteras meta-análisis utilizados robusto método de agregación rango también dio lugar a la misma conclusión que nosotros. [18]
En este estudio, se utilizó el método de Bonferroni para controlar la tasa de falsos positivos y de hecho los resultados más confiables. En última instancia, el miR-221 y miR-222 eran sólo dos estadísticamente significativas miRNAs meta-firma. Por otra parte, los valores de p de permutación de otros tres upregulated (miR-93, miR-21 y miR-224) y cuatro miRNAs downregulated (miR-130a, miR-195, miR-199a y miR-375) fueron & lt; 0,05, pero sus valores p corregidos no fueron significativas. Las siguientes limitaciones se pueden explicar estos hallazgos: 1) que no había datos suficientes para la integración, 2) los tamaños de muestra de los conjuntos de datos fueron relativamente pequeños, 3) diferentes investigadores metodología utilizada hicieron más discrepante
A pesar de que no tiene importancia fuerte. se observó en todos los miRNAs meta-firma, los estudios experimentales en los últimos años demostraron que estaban muy asociados con el cáncer de hígado. MiR-221 fue el más frecuente entre los miRNAs estudió meta-firma. Fornari et al. [19] han demostrado que el miR-221 funciona como un oncogén en hepatocarcinogénesis por la orientación CDKN1B /p27 y CDKN1C /p57 en 2008. Mientras tanto, los resultados de Gramantieri et al. [20] han indicado que el miR-221 inhibe la apoptosis por la orientación Bmf y su sobreexpresión se asoció con un fenotipo más agresivo en 2009. En conjunto, estos hallazgos implicaron que el miR-221 podría ser un objetivo potencial para el tratamiento no convencional contra HCC. Además, Park et al. [21] encontró que el miR-221 silenciamiento bloqueado carcinoma hepatocelular y promueve la supervivencia en un modelo de ratón ortotópico válida de HCC y Callegari et al. [22] y Pineau et al. [23], respectivamente, han confirmado el papel oncogénico de miR-221 en el modelo de ratones. Por otra parte, Li et al. [24] demostraron que el suero de miR-221 podría proporcionar importancia predictiva para el pronóstico de los pacientes con HCC y He et al. [25] han demostrado que miR-221 silenciamiento inhibida propiedades malignas de cáncer de hígado in vitro e in vivo. En conjunto, el miR-221 se ha estudiado a fondo sobre su impacto en el cáncer de hígado, y podría ser un objetivo potencial candidato a diagnóstico y la terapia del cáncer de hígado
.
Además de miR-221, algunos otros miRNAs se han probado experimentalmente a asociar con la aparición, el desarrollo, y la metástasis. Tres meta-miRNAs upregulated firma, miR-222, miR-21 y miR-224, podrían exacerbar HCC través de las vías de señalización AKT. [26] - [28] miR-222 sobreexpresión es común en HCC y podrían conferir potencial metastásico en células de HCC, posiblemente mediante la mejora de la señalización de AKT. [26] miR-21 suprime PTEN y hSulf-1 de expresión y promueve la progresión a través de vías HCC AKT /ERK, y en cuanto a miR-224, que posiblemente activa la señalización de las vías por la orientación PPP2R1B AKT. [27], [28] Un estudio reciente mostró que el miR-21 y miR-222 expresiones fueron diferencialmente modulados por la Hepatitis B Virus X de proteínas en hepatocitos malignos. [29] Además, el miR-224 podría jugar un papel significativo en la migración y la invasión de células HCC. [30] - [32] Curiosamente, dos downregulated miRNAs meta-firma, miR-195 y miR-375, podría obras de teatro importantes funciones inhibidoras en la progresión del HCC. [33] - [38] Por ejemplo, el miR-195 podría inhibir la progresión del HCC por la orientación LATS2 y el NF-kB vía de señalización [33], [34] y suprimir la angiogénesis y la metástasis del carcinoma hepatocelular mediante la inhibición de la expresión de VEGF, VAV2 , y CDC42. [35] Xu et al. han demostrado que el miR-195 juega un papel importante en el control del ciclo celular y en la etiología molecular de HCC. [36] Por otra parte, el miR-195 puede apuntar PCMT1 en el carcinoma hepatocelular que aumenta la esperanza de vida del tumor [39] y negativamente regular los niveles de la proteína del receptor de esteroides coactivador-3 a través de la orientación de su región 3 'no traducida en células de HCC [40]. Otra miRNA downregulated, miR-375, también se ha demostrado para suprimir el crecimiento de células de cáncer de hígado in vitro o in vivo. [37], [38]
A pesar de que hemos demostrado que los miRNAs pueden implicar en la promoción o inhibición de la progresión del cáncer de hígado por la orientación de algunos genes en las vías principales de la regulación del cáncer, todavía hay un largo camino por recorrer en la interpretación el impacto de los miARN en el cáncer de hígado. El trabajo futuro debe mantener la atención continua en el mecanismo a través del cual los miRNAs regulan la aparición, progresión y metástasis de cáncer de hígado. Además, se necesitan estudios con un gran tamaño de la muestra y la misma plataforma.
En conclusión, sugerimos que los miRNAs meta-firma son conductores reguladores clave del proceso oncogénico, que pueden ser buenos objetivos potenciales para el diagnóstico y la terapia de cáncer de hígado.
Apoyo a la Información
S1 Figura. El análisis de conglomerados Red de lista de miARN. Posible correlación se mostró de acuerdo con los subgrupos de la histología del tumor, región, y tamaño de la muestra. La agrupación se realizó a través de correlación de Pearson y el método de vinculación promedio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114533.s001 gratis (TIF)
S2 Figura.
Camino enriquecimiento de meta-miARN objetivos de la firma. La intensidad del color representa el valor de p corregido-FDR. La agrupación se realizó a través de correlación de Pearson y el método de vinculación promedio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114533.s002 gratis (TIF)
S1 Lista de verificación. Lista de verificación
PRISMA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114533.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
gracias al Sr. Hui Chen y Sra.Shanshan Zeng por su apoyo en la sala de trabajo y red de recuperación.