Extracto
La metástasis de las células de cáncer de colon aumenta el riesgo de mortalidad por cáncer de colon. Recientemente hemos demostrado que el ginseng americano previene el cáncer de colon, y un extracto de hexano de ginseng americano (AST) tiene propiedades anti-inflamatorias y anti-cáncer particularmente potentes. Desregulada microRNA (MIR) expresión se ha observado en varias condiciones de enfermedad, incluyendo el cáncer de colon. El uso de perfiles de expresión de miR mundial, se observó el aumento de miR-29b en células de cáncer de colon tras la exposición a la AST. Desde miR-29b juega un papel en la regulación de la migración de las células del cáncer, la hipótesis de que la AST induce la expresión de miR-29b para orientar la matriz metaloproteinasa-2 (MMP-2) suprimiendo de esta manera la migración de células de cáncer de colon. Los resultados son consistentes con esta hipótesis. Nuestro estudio apoya el entendimiento de que la orientación de MMP-2 por miR-29b es un mecanismo por el cual la AST suprime la migración de las células de cáncer de colon
Visto:. Poudyal D, Cui X, Le PM, Hofseth AB, A Windust , Nagarkatti M, et al. (2013) Un papel clave de microARN-29b para la represión de la migración de células del cáncer de colon por el ginseng americano. PLoS ONE 8 (10): e75034. doi: 10.1371 /journal.pone.0075034
Editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2013; Aceptado: August 7, 2013; Publicado: 9 Octubre 2013
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Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Investigación de la CAM en enfermedades autoinmunes e inflamatorias, NIH subvención 1P01AT003961-01A1 (PN, LJH, MN) y el COBRE financiado Universidad de Carolina del Sur Centro de Investigación del cáncer de Colon, NIH subvención P20RR17698-01 (Franklin Berger, director). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y mujeres y la tercera causa principal de muerte por cáncer. En los EE.UU., la Sociedad Americana del Cáncer estima que 141,210 nuevos casos de cáncer colorrectal y 49,380 muertes en 2011. La metástasis conduce a un 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer [1], [2]. En principio, durante la metástasis de CCR, algunas células cancerosas de la masa del tumor primario invaden el tejido circundante, intravasate en la vasculatura a viajar a través de la sangre y los vasos linfáticos, paro en los capilares distantes, extravasate en el parénquima del tejido distante (principalmente hígado y pulmones), donde siembran nuevas colonias para formar los tumores secundarios macroscópicos [3]. Estas células cancerosas metastásicas pierden su capacidad de adherirse a las células tumorales vecinas y desarrollar propiedades migratorias e invasivas para difundir a órganos distantes metastásicos. Al hacerlo, las células metastásicas se someten a cambios en la expresión génica y la función, ganando así más mesenchymal- características iguales y en este proceso se denomina como epitelial a mesenquimal transición (EMT), un evento crucial en la malignidad. Los microARN (MIR) son pequeños ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos (NTS) de largo que el post-transcripcionalmente regula la expresión de genes en plantas y animales. En los animales, los MIR objetivo transcripciones a través de apareamiento de bases imperfecta de 2-7 noches de extremo 5 'del MIR (la denominada secuencia de "semilla") a varios sitios 3' no traducidas regiones (UTRs) de ARNm diana, y esto imperfecta miR-híbridos de ARNm con bulbos centrales (nt 9-12) recluta miRNP (complejo de ribonucleoproteína microARN) que permiten inhibición de la traducción de ARNm o exonucleolıtica descomposición [revisado en [4]]. Muchos genes de limpieza han evolucionado con menor duración de la UTR en 3 'para evitar la regulación de miR [5]. Alrededor del 50% de los genes miR anotada humanos se encuentran en el cáncer asociado regiones genómicas o de los sitios frágiles que son susceptibles a la amplificación, supresión y la translocación en una variedad de tumores, incluyendo tumores de colon [6]. Debido a esto algunos miRs podrían actuar como supresor de tumores o oncogenes [7], [8], [9], [10], [11]. El análisis de perfiles de expresión ha revelado característicos firmas de miR que puede predecir los resultados clínicos de CRC [12], [13].
Una de las características clásicas de cáncer es la capacidad de las células tumorales para invadir y metastatizar [14] . miRs son ambos reguladores positivos y negativos de la metástasis del cáncer [15], [16], [17]. Un regulador negativo de la metástasis del cáncer es el miR-29b [por ejemplo [18], [19], [20], [21], [22]]. miR-29b pertenece a la familia de miR-29. La familia de miR-29 está compuesto por tres paralogs: miR-29a, -29b y -29˚C. miR-29a y miR-29b1 están situados en el cromosoma 7q32; miR-29b2 y miR-29c están situados en el cromosoma 1q23 [23]. secuencias de miR-29b1 y miR-29b2 son idénticos, pero se distinguen b1 y b2 debido a la diferencia en el locus. MMP-2, una matriz extracelular (ECM) de la enzima degradante que tiene una implicación importante en la metástasis y la angiogénesis ha demostrado ser el blanco directo de miR-29b [20]
ginseng americano (AG;.
Panax quinquefolius
) es una sombra perenne nativa obligado de América del Norte. De Bioensayo guiada fraccionamiento de AG, hemos demostrado recientemente que una fracción hexano de AG (HAG) es un anti-oxidante y anti-cáncer potente agente [24], [25]. Hasta la fecha, los estudios contra el cáncer limitados de los extractos lipofílicos de AG se han llevado a cabo, y estos estudios se centran principalmente en los efectos antiproliferativos y citotóxicos [26], [27], [28], [29]. Para comprender mejor el mecanismo anti-cáncer de la AST (un extracto lipofílico), se estudió el papel del MIR en la migración de las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Fracción de hexano AG
El em> P
extracto ha sido descrito previamente en detalle por nuestro laboratorio [30]. A su vez, hemos descrito recientemente la generación de la AST se utiliza en el presente estudio [24].
Cultivos Celulares
HCT 116 de tipo salvaje (WT), LOVO y DLD-1 de colon las células de cáncer se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). HCT 116 células se cultivaron en medio de McCoy (ATCC, Manassas, VA); células LOVO eran cultivo en medio F-12K (ATCC, Manassas, VA); y DLD-1 células fueron cultivo en medio RPMI-1640. Todos los medios se complementó con 10% recién nacido de suero de ternera (NBCS; Gibco /Life Technologies, Grand Island, NY), glutamina 2 mM (Biofluids, Rockville, MD), penicilina (10 U /ml, Biofluids) y estreptomicina (10 mg /ml, Biofluids).
Global mir Expresión
HCT 116 células WT fueron sembradas a 1 × 10
6 células /placa en placas de 6 pocillos en cuatro repeticiones. Después de cultivo durante 24 h, 260 g /ml de AST se añadió en cada pocillo. Las células se recogieron a los 0, 12, y 24 h por separado en tubos de RNasa libre de EP. El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Ambion, Austin, TX). La concentración de ARN se determinó por el Nanodrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng de ARN de las células HCT 116 WT se utilizó para la versión 1.2 Ensayo de Expresión nCounter miARN (Nanostring Technologies, Seattle, WA) que contiene 800 miARN está siguiendo las instrucciones del fabricante.
expresión de miR-29b
Las células fueron sembradas, expuesta al vehículo (medios solamente) o 260 mg /ml de AST, y se recogieron a las 24 horas. Para la detección de miR-29b, se utilizó 10 ng de ARN total para revertir-transcribir en ADNc utilizando el kit TaqMan MIR transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante y los cebadores de miR específicos para hsa-miR-29b para la detección y la pequeña proteína RNU6B nuclear (U6) para la normalización (Applied Biosystems). medición de qPCR de-29b MIR y U6 expresión se realizó usando TaqMan de miR ensayos (Applied Biosystems) con el sistema de ensayo PCR 7300 (Bioystems Biosystems). El método de ciclo umbral comparativo (Ct) se utilizó para evaluar la abundancia relativa de miR-29b en comparación con la expresión U6 (sofá cambios relativos a U6). Todos los tratamientos experimentales se llevaron a cabo en tres ocasiones separadas; cada vez con tres repeticiones.
siRNA transfección y miR
En la MMP-2 siRNA, 1,5 × 10
5 células fueron cultivadas en placas de 6 pocillos en 1 día antes de la transfección medio. Usando INTERFERin siRNA reactivo de transfección (Plyplus, iLllkirch, Francia), las células se transfectaron con 5 nM de MMP-2 Trilencer-27 humana siRNA (Origene, Rockville, MD). Después de 48 h de transfección, las células fueron procesadas para el análisis de transferencia de Western para evaluar la eficacia de tumbar (Figura S3). Para inhibidor mirVana-miR-29b y el inhibidor de control mirVana-Negativo (Ambion, Austin, TX) transfección, 1,5 × 10
5 células fueron cultivadas en medio en placas de 6 pocillos 1 día antes de la transfección. Usando INTERFERin siRNA reactivo de transfección (Polyplus transfecciones, Illkirch, Francia), las células fueron transfectadas con 10 nmol /L de inhibidor Mirvana-miR-29b o inhibidor de control Mirvana-Negativo. Después de 48 h de la transfección, las células se recogieron en tubos de RNasa libre de EP. ARN total fue extraído por medio de TRIzol regente. La concentración de ARN se determinó por Nanodrop 2000. 10 ng de ARN total fue inverso-transcrito a cDNA utilizando el kit TaqMan MicroARN transcripción inversa con cebadores específicos para microARN hsa-miR-29b y el pequeño RNU6B proteína nuclear (U6) para la normalización. qPCR medición de miARN-29b y U6 expresión se realizó utilizando TaqMan microARN Los ensayos con el sistema de ensayo de PCR 7300. Se utilizó el factor de cambio relativo del nivel de miR-29b para representar la abundancia relativa de los genes miARN-29b en comparación con la expresión U6. Como por el proveedor de inhibidor mirVana-miR-29b (Ambion por Life Technologies, Austin, TX), la eficacia con la que las células de mamífero se transfectan con inhibidor mirVana-MIR depende del tipo de célula y agente de transfección utilizada. Se recomienda que experimento de optimización (concentraciones de 1 nM a 100 nM inhibidor MIR) se llevará a cabo para obtener la actividad máxima con citotoxicidad mínima. La eficacia de la transfección y el origen de 3 líneas celulares HCT116, LoVo y DLD-1 son diferentes y a partir del experimento de optimización (datos no mostrados), mirVana miR-29b Inhibidor mostraron actividad máxima a 10 nM después de 48 h de transfección para las células HCT116 y 50 nM para LoVo y células DLD-1. Después de 48 h de la transfección con inhibidor Mirvana-miR-29b, se añadió la AST (260 mg /ml) durante 24 h y se recogieron las células para la expresión del gen diana (MMP-2) y para el ensayo de migración. Todas las muestras de control experimental se trataron con una concentración igual de una secuencia de control negativo inhibidor no la focalización, para su uso como controles para los efectos no específicos de la secuencia en experimentos de MIR. controles falsamente transfectadas no produjeron ningún efecto significativo en ninguno de los parámetros analizados.
Análisis de ARNm
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA). Una g de RNA total sirvió como molde para la síntesis de ADNc de cadena sencilla en una reacción utilizando oligo (dT) cebadores y transcriptasa inversa de AMV (Promega Corp, WI) en las condiciones indicadas por el fabricante. PCR de muestras de ADNc se realizó con muestras amplificadas durante 30 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, hibridación a 50 ° C durante 30 s y extensión a 72 ° C durante 30 s con extensión final a 72 ° C durante 10 min . Las secuencias para los cebadores PCR en tiempo real utilizados fueron: MMP-1 adelante 5'-AGG TCT CTG AGG GTC AAG CA-3 '; MMP-1 Reverse 5'-CTG GTT GAA AAG CAT GAG CA-3 '; MMP-2 adelante 5'-ACA TCA AGG AGG TTC ACG AG-3 '; MMP-2 inversa 5'-CCG TCG TAT ACC ACG TCA AT-3 '; MMP-7 hacia adelante 5'-GAG TGC CAG ATG TTG CAG AA-3 '; MMP-7 inverso 5'-AAA TGC AGG GGG ATC TCT TT-3 '; MMP-9 hacia adelante 5'-TTG ACA ACA GCG AGA AGT GG-3 '; MMP-9 inverso 5'-CGC ATT CAC GTC GTC CTT AT-3 'y 5'-GAPDH Forward GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3', 5'-GAPDH inversa TTG TTG GAG ATT GGA TCT CG-3 '( Integrated DNA Technologies, Inc). PCR en tiempo real (qPCR) se realizó utilizando el sistema 7300 PCR en tiempo real de ensayo (Applied Biosystems, CA) con Power SYBR verde PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA) y cebadores para la MMP-1, -2, -7, -9 y GAPDH de acuerdo con el protocolo del proveedor. La expresión del gen MMP se normalizó por la expresión del gen GAPDH. El factor de cambio en la expresión de genes es en relación con el vector tratados [1x Tampón fosfato salino (PBS)] las células cosechadas en 24 h.
Análisis Western Blot y anticuerpos
transferencias Western se llevaron a cabo como se describe anteriormente [31]. Los anticuerpos utilizados incluyen: MMP-2 (policlonal de conejo, diluido 1 en 500, cat#4022s; Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA), y GAPDH (policlonal de conejo, diluido 1 en 1000, cat#5174; Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MAMÁ). Para todas las transferencias, una proteína estándar (de referencia prestained proteína de escalera; Invitrogen, Carlsbad CA) se ha ejecutado para garantizar el peso molecular correcto de cada una de las bandas observadas. anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante se compraron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Secundaria anticuerpos se diluyeron en 1:2000. Todos los anticuerpos se diluyeron en 5% de leche /PBST (Tween 20 0,1% en 1 x PBS). señal de Western blot se detectó por Pierce ECL Western Blot sustrato (Thermo Scientific, Rockford, IL) y se desarrolló en Hyperfilm.
in vitro
ensayo para la migración
El 24 pocillos Costar transwell de soporte permeable con una 8-micras de tamaño de poro de membrana de policarbonato (Corning Incorporated, NY), y con un inserto de 6,5 mm se utilizó para analizar la migración de células tumorales. Para este ensayo la migración, la membrana se empapó transwell con 15 mg /ml de colágeno tipo I (BD Biosciences) durante 30 min a 37 ° C en medio libre de suero. El colágeno se eliminó con la pipeta y la membrana recubierta de colágeno era el lugar en una placa de 24 pocillos. Las células fueron suero de hambre durante 12 h y 50.000 células se resuspendieron en 200 l de medio libre de suero (SFM) y se transfieren a la cámara superior de la transwell. La cámara inferior se llenó con 750 l de SFM o medio de crecimiento completo (10% NCS complementado, como un quimioatrayente para las células) o AST (260 g /ml en medio completo). La placa transwell se incubó a 37 ° C durante 12 h. Después de la incubación, el medio se retira de la cámara, la membrana transwell se lavó en 1X PBS y las células se fijaron por formaldehído (3,7% en PBS) y se permeabilizaron por 100% de metanol y se tiñeron con 0,4% de cristal violeta mancha. La membrana se lavó con PBS 1X y la no migrada en la parte superior de la membrana Transwell se rasparon con el bastoncillo de algodón estéril. La membrana transwell se cortó de la cámara transwell y fijado en portaobjetos de microscopio con Permount y se observa bajo el microscopio (ampliación 100x). 7 secciones al azar fueron fotografiados de cada diapositiva y las células migradas en la parte inferior de la membrana transwell se contaron automáticamente utilizando el software Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Análisis estadístico
para el análisis global de MIR, todos los datos se importaron en v1.0 análisis NSolver Software (Nanostring Technologies) y se normalizaron a la media geométrica de los 100 MIR con los más altos valores de expresión. Los datos normalizados se ha importado a BRB-ArrayTools v4.1.0 para su análisis. Antes del análisis, los datos se filtró en la que se omite cualquier valor inferior a 10 y cualquier MIR desaparecido en & gt; 50% de las muestras fueron excluidos dejando 248 MIR de para su análisis. Los criterios de filtrado se estableció de tal manera que cualquier punto normalizado de datos & lt; 10 o el log2 transformado valor de datos & lt; 3,321928 fueron llamados desaparecido y fueron excluidos debido a que está en el nivel de fondo. Sólo aquellos puntos de datos & gt; 10 o de valor de datos log2 transformado & gt; 3.321928 se tomaron en consideración y se pasan los criterios de filtrado dejando 248 MIR para el análisis. prueba de comparación de clases utilizada t de Student pruebas para comparar MIR de las células no tratadas tratados vs. las pruebas de tendencia utilizaron modelos de regresión lineal en las variables categóricas de 0 h, 12 hy 24 h. El procedimiento Benjamini-Hochberg se utilizó para calcular las tasas de falso descubrimiento. Cuando se compararon más de dos grupos, se determinó diferencias estadísticas usando un análisis unidireccional de la varianza, seguido de la prueba de comparación múltiple de Scheffe una. Si se compararon dos grupos, se utilizó la prueba t de Student. El valor de p para la significación elegido en este estudio fue de 0,05.
Resultados
AST Induce miR-29b en células de cáncer de colon
El ginseng americano y la AST ambos han ejercido un efecto preventivo sobre el modelo inducido químicamente cáncer de colon [24], [32]. Para iniciar nuestro estudio, ya que miRs se han demostrado tener propiedades tanto pro-tumorales y anti-tumorales, estudiamos el efecto de la AST en la expresión de miR mundial en células de cáncer de colon. Hubo una correlación significativa positiva en 2 miRs, y correlación negativa significativa en 6 miRs después de la exposición de las células HCT 116 de AST (260 g /ml) durante 0 h, 12 h, y 24 h (Tabla 1). Con base en el entendimiento de que la familia de miR-29 se ha regulado en múltiples neoplasias [21], [23], [33], [34], que varios estudios han demostrado que hasta la regulación de miR-29 que tiene efectos antitumorales [22], [35], y que el aumento de expresión de miR-29b se demostró con dos métodos estadísticos diferentes (Tablas 1 y 2), nos centramos en esta MIR. Para confirmar el miR-29b regulación de Hag, se repitió el experimento y examinamos la regulación positiva de miR-29b por QRT-PCR. En consonancia con los resultados globales de análisis de miARN, la figura 1 muestra que hubo una mayor expresión de miR-29b (7,3 veces) con la exposición de las células HCT 116 de la AST. También hubo un aumento en la expresión de miR-29b con la exposición de las otras dos líneas celulares de cáncer de colon (DLD-1, 3,1 veces, y Lovo 1,5 veces). (Figura 1) guía
HCT 116, sistema antibloqueo de frenos -1, y células LOVO se expusieron a 260 mg /ml de AST durante 24 h (n = 3 por punto de tiempo). endógenas niveles de expresión de miR-29b relativos se detectaron mediante qRT-PCR usando los cebadores Taqman y las sondas para detectar madura miR-29b y el pequeño RNU6B nuclear RNA (U6), un control interno. Niveles relativos de expresión de miR-29b se normalizaron al valor medio de las muestras no tratadas (0 h). *, Indica una diferencia significativa (valor de p & lt; 0,005). Desde el mando a 0 h
AST Suprime la MMP-2 expresión en células de cáncer de colon
objetivo potencial genes de miR-29b se predijo a partir de bases de datos de primera línea, incluyendo miRTarBase, TargetScan, PicTar, y Miranda. MMP-2 se prevé que sea el objetivo potencial de miR-29b por todas estas bases de datos (Figura 2A). Debido a que la MMP-2 se sobreexpresa en los tejidos tumorales [36], [37], [38], y tiene una implicación directa en la metástasis y la angiogénesis de las células del cáncer [39], [40], lo primero que examinó los efectos de la AST activada MMP -2 expresión. El tratamiento de células HCT-116 con AST durante 24 h dio como resultado la reducción de la MMP-2 de la expresión génica en aproximadamente media veces [(1 ± 0,14-0,57 ± 0,05), p-valor = 0,078] (Figura 2B). tratamiento AST durante 24 h, redujo significativamente la expresión del gen MMP-2 en las células DLD-1 [(1 ± 0,03 a 0,03 ± 0,01), p-valor & lt; 0,005] (Figura 2D). Del mismo modo el tratamiento de células LOVO con AST durante 24 horas dio como resultado la reducción de la MMP-2 expresión [(1 ± 0,06 a 0,74 ± 0,017), p-valor & lt; 0,05] (Figura 2F). Para verificar si la AST reduce la actividad de MMP-2, las células HCT-116 se trataron con la AST durante 24 h y la proteína MMP-2 se analizó. Figura S4: HAG redujo el pro-activo y expresión de la proteína MMP-2; confirmando que la AST reduce la actividad de MMP-2 y la expresión génica. Además otras MMP degradantes de ECM, tales como MMP-1, MMP-7 y MMP-9 expresión del gen no estaba regulado por el tratamiento de AST (Tabla S2). Curiosamente, estas MMP (MMP-1, -7 y -9) no son el blanco directo de miR-29b.
(A) miR-29 familiares (miR-29a /b /c) y su putativo secuencia de unión en el 3'-UTR del gen MMP-2. La secuencia de semillas de la familia miR-29 se muestra en el cuadro. (B) las células WT HCT116 se expusieron a 260 mg /ml de AST para 24 h. las células (C) HCT116 transfectadas con 10 nM de Mirvana miR-29b, 48 h y se expusieron a 260 mg /ml de AST para 24 h. las células (D) DLD-1 se expusieron a 260 mg /ml de AST para 24 h. (E) las células DLD-1 transfectadas con 50 nM de Mirvana miR-29b, 48 h y se expusieron a 260 mg /ml de AST para 24 h. células LOVO (F) fueron expuestas a 260 mg /ml de AST para 24 h. células LOVO (G) transfectadas con 50 nM de Mirvana miR-29b, 48 h y se expusieron a 260 mg /ml de AST para 24 h. Relativa nivel de expresión de MMP-2 se detectó mediante qRT-PCR. MMP-2 mRNA para cada muestra se normalizó por la expresión de GAPDH. Doble cambio en el nivel de mRNA de MMP-2 era relativa de células no tratadas cosechadas a 0 h (n = 3 por punto de tiempo). Los resultados indican la fracción hexano de AG suprime MMP-2 nivel de ARNm en comparación con las células no tratadas. * Indica una diferencia significativa, el valor de P & lt;. 0,05 h desde 0 Control
Además, para verificar si la supresión mediada por la AST del gen MMP-2 es dependiente de miR-29b, silenciamos miR 29b (Figura S1) utilizando un inhibidor de miR-29b (véase métodos 4.2.5). AST no suprime la MMP-2 y la expresión génica cuando miR-29b es silenciada (Figuras 2C, 2E y 2G). De hecho, hay un aumento de 2,4 veces en la expresión de MMP-2 en las células HCT116 silenciados miR-29b cuando se expone a la AST, 24 h (Figura 2C). No hubo disminución en MMP-2 en la expresión de genes miR-29b silenciado células de cáncer de colon DLD-1 y LOVO cuando se expone a la AST, 24 h (Figuras 2E y 2G). En conjunto, estos resultados son consistentes con la hipótesis de que la supresión de la MMP-2 de Hag depende de miR-29b.
HAG suprime la migración de las células del cáncer de colon
objetivos de miR-29b clave jugadores para reprimir la invasión y la metástasis [19], [20], [21], [22]. MMP-2 está implicada en la migración de células de cáncer de colon (Tabla S1; Figura S2). una reducción de aproximadamente 3,5 veces en el número de células migradas /campo microscópico en las células HCT116 MMP-2 de detonación /abajo las células en comparación con las células HCT116 WT en presencia de 10% de suero como quimioatrayente se informa (Tabla S1; Figura S2). Esta es una clara indicación de que la MMP-2 es un factor clave en la regulación de la migración celular, sin embargo, no debe descartarse que otras MMP degradantes ECM tales como la MMP-1, MMP-7, MMP-9 y MMP-13 tienen ha demostrado estar asociado con la progresión del cáncer colorrectal [37], [41], [42], [43], [44]. Desde la AST hasta regula la expresión de miR-29b y hacia abajo-regula la expresión de la enzima degradante de MMP-2 genes ECM, se investigó aún más el efecto funcional de la AST en la migración de las células cancerosas. En las células HCT116, AST suprimió la migración de las células de cáncer en casi 7 veces (Figuras 3A y 3C). En el miR-29b silenciados células HCT-116, AST no suprimió la migración. En consonancia con la MMP-2 resultados (Figura 2C), en ausencia de la actividad de miR-29b, la AST elevado el número de células que migran a la cámara inferior del transwell membrana en casi 2,5 veces en comparación con el control positivo (Figuras 3B y 3D). Del mismo modo, la AST suprimió la migración de las células DLD-1 sólo en la presencia de miR-29b, donde se redujo el número de células que migran por casi 5 veces en comparación con el control positivo (Figuras 4A y 4C). AST no ejerció actividad anti-migratoria cuando miR-29b fue silenciado en las células DLD-1 (Figuras 4B y 4D). En general, los resultados muestran aquí miR-29b está en el cruce de la capacidad de la AST para ejercer actividades anti-migratorias.
El colágeno tipo I (15 mg /ml) de cámara transwell recubiertos se aplica con 5 × 10
4 HCT116 (A /B) durante 12 h. La cámara inferior contiene SFM /Suero (10%) o la AST (260 mg /ml en medio completo). (A) las células WT 5 × 10
4 HCT116 se aplicaron a la cámara superior de la membrana Transwell. (B) 5 × 10
4 HCT116 (transfectadas con Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) se aplicaron las células a la cámara superior de transwell membrana. Después de 12 h de incubación a 37 ° C, las células migran al interior (membrana inferior) de transwell membrana se contó usando el software ImageJ (7 campos aleatorios microscópicas (100x) fueron evaluados para el recuento de células). (C) Representa la imagen representativa de la migración celular HCT116 WT de cada tratamiento. (D) Representa la imagen representativa de HCT116 (transfectadas con Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) la migración de células de cada tratamiento. El fondo de la imagen muestra el poro 8 micras en la membrana Transwell. *, Indica una diferencia significativa (valor de p & lt; 0,005) en comparación con el MFS. #, Indica diferencia significativa (valor de p & lt; 0,005). En comparación con 10% de suero
colágeno de tipo I (15 mg /ml) cámara transwell recubiertos se aplica con 5 × 10
4 células DLD-1 (A /B) durante 12 h. La cámara inferior contiene SFM /Suero (10%) o la AST (260 mg /ml en medio completo). (A) 5 × 10
4 células DLD-1 WT se aplicaron a la cámara superior de la membrana Transwell. (B) 5 × 10
4 DLD-1 (transfectadas con Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) se aplicaron las células a la cámara superior de transwell membrana. Después de 12 h de incubación a 37 ° C, las células migran al interior (membrana inferior) de transwell membrana se contó usando el software ImageJ (7 campos aleatorios microscópicas (100x) fueron evaluados para el recuento de células). (C) Representa la imagen representativa de DLD-1 migración de células WT de cada tratamiento. (D) Representa la imagen representativa de DLD-1 (transfectadas con Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) la migración de células de cada tratamiento. El fondo de la imagen muestra el poro 8 micras en la membrana Transwell. *, Indica una diferencia significativa (valor de p & lt; 0,005) en comparación con el MFS
Discusión
Aquí hemos demostrado que la AST suprime la migración de células de cáncer de colon.. Esta propiedad anti-metastática de la AST está mediada por la regulación de microARN-29b, que se dirige directamente y regula a la baja una molécula clave implicada en la metástasis, la MMP-2
Análisis global de la AST MIR -. Tratada HCT116 células dieron lugar a la elevada expresión de miR-29b que hacía juego tanto la tendencia y el análisis estadístico veces de cambio (Tablas 1 y 2). Hubo 8 miRNAs (HSA-miR-938, hsa-miR-203, hsa-miR-1975, hsa-miR-29b, hsa-miR-600, hsa-miR-1244, hsa-miR-548o y HSA-mir -590-5p) que fueron estadísticamente (p & lt; 0,05) hacia arriba o hacia abajo-regulado. Un coeficiente de correlación positiva indicaron niveles de MIR aumentó con el aumento de la exposición a la AST (0 h 12 h 24 h) con sólo 2 MIR (HSA-miR-29b y hsa-miR-590-5p) que caen en esta categoría. De estos 2 MIR, MIR-29b tenía el valor más alto coeficiente de correlación de 0,621. Además, dado que el miR-29b fue también estadísticamente significativamente hasta reguladas por la AST en el análisis del cambio veces (Tabla 2), y que esta MIR ha sido demostrado por otros a jugar un papel supresor tumoral [23], [33], [ ,,,0],45], [46], [47], nos hemos centrado en el miR-29b para este estudio en particular. El papel de miR-29b como un supresor de tumores ha sido bien dilucidado en varios tumores malignos, incluyendo, AML [23], [45], de pulmón [33], CLL [46], [47] y colangiocarcinoma [48]. El descenso de regulación de la familia miR-29 se ha informado en varios cánceres humanos incluyendo cáncer de pulmón [49], de próstata [50], el cáncer de mama invasivo [51]. Recientemente, Kuo et'al han informado de un menor nivel de expresión de miR-29a /c en un grupo recurrencia temprana del cáncer colorrectal en comparación con la de un grupo de recurrencia temprana no indica bajo nivel de expresión de miR-29a /c como un biomarcador potencial para recurrencia temprana de CRC [52]. Nuestros resultados han dilucidado mejor los posibles mecanismos de este hallazgo
La familia de miR-29 se compone de tres miembros:. MiR-29a, 29b-MIR, y miR-29c (miR29a /b /c) que muestran alta similitud de secuencia y comparte una secuencia de semillas comunes para el reconocimiento de destino (Figura 2A). Otros han informado de una relación inversa con respecto a la expresión de miR-29b y MMP-2 [20], [22], [53], [54]. Además, debido a las bases de datos de miR (miRTarBase, TargetScan, PicTar, y Miranda) indican MMP-2 como un objetivo potencial de miR-29b, se analizó la importancia funcional de esta. MMP-2, también conocida como gelatinasa A o colagenasa tipo IV, es una enzima degradante ECM, y se expresa ampliamente en la mayoría de tejidos y células [55]. Además, MMP-2 se sobreexpresa en los tejidos tumorales [36], [37], [38] y la activación de MMP-2 da como resultado la degradación de ECM, que facilita la invasión y metástasis de las células tumorales [56]. Nuestros datos en tiempo real RT-PCR mostró que la AST reduce la expresión de MMP-2 por 2 veces en las células HCT116 y a la reducción de aproximadamente 30 veces en las células DLD-1 (Figuras 2C y 2E). AST también redujo la MMP-2 expresión de la proteína (Figura S4). Cuando la actividad de miR-29b es silenciada por la transfección de células de cáncer de colon con un inhibidor mirVana miR-29b (Figura S1), AST no tiene ningún efecto sobre la reducción de la MMP-2 expresión (Figuras 2C, 2E y 2G) y en cierta medida indujo la MMP -2 expresión. La razón podría ser debido a la ausencia de miR-29b endógena, la AST fue incapaz de regular el miR-29b que mejora aún más la secreción de MMP-2. Algunos de los componentes presentes en la AST, podría tener el potencial para mejorar la expresión de MMP-2 directamente en ausencia de miR-29b endógena, sin embargo para ello se necesita estudio adicional por confirmar. Por lo tanto, un proceso de aislamiento vigorosa de los componentes activos de la AST es estudios en curso y futuros con respecto a este están en la línea. En conjunto, nuestros datos sugieren que miR-29b es crítica para la AST para suprimir la expresión de MMP-2 en células de cáncer.
metaloproteinasas de la matriz han sido considerados como moléculas clave ayudar a las células tumorales durante la metástasis [57], [58 ], [59], [60]. Las MMPs son una familia de endopeptidasas que contienen cinc más conocidas por su papel en la remodelación fisiológica y patológica de la MEC durante la angiogénesis, curación de heridas, la embriogénesis, la metástasis tumoral, y diversas enfermedades cardiovasculares e inflamatorias [61], [62]. Se ha demostrado que el miR-29b está implicado en la regulación negativa de la metástasis en varios tipos de cáncer [18], [20], [63]. La combinación de estos hallazgos, en los que el miR-29b es un regulador negativo de la metástasis y objetivos clave de la metástasis de MMP-2, y la AST induce miR-29b y suprime la MMP-2 expresión (Tablas 1 y 2. Las figuras 1, 2 y S4), hicimos la pregunta si la AST suprime funcionalmente metástasis de las células de cáncer de colon. Hemos demostrado que la AST suprime funcionalmente la
in vitro
metástasis de las células de cáncer de colon mediante la realización de ensayo de migración de células de cáncer de colon (Figuras 3A, 3C, 4A y 4C). En ausencia de la actividad de miR-29b, AST no era eficaz en la supresión de la migración de células de cáncer de colon (Figuras 3B, 3D, 4B y 4D). Aunque, aún no se ha demostrado
in vivo
, todos juntos, nuestro
in vitro
datos indican que la AST lleva a cabo su actividad anti-metastásico mediante la regulación de miR-29b.
Mayor componentes presentes en el extracto de hexano (extracto lipófilo) de AG son poliacetilenos (Panaxydiol, panaxydol y panaxynol), que comprende aproximadamente el 50% del extracto total, así como los ácidos grasos, con casi no ginsenósidos [24]. Recientemente hemos demostrado que la AST posee propiedades anti-inflamatorias y anti-cáncer [24]. Varios otros estudios sobre las propiedades anti-inflamatorias y anti-cáncer de ginseng americano se han centrado en el ginsenosido o el contenido de saponina de ginseng [64], [65], [66], [67], que se obtiene a partir de un extracto de etanol acuoso (disolvente polar) de ginseng.