Extracto
El cáncer de próstata exhibe tremenda variabilidad en el comportamiento clínico, que van desde indolente a la enfermedad letal. Se necesitan mejores marcadores de pronóstico para estratificar los pacientes para la terapia apropiada agresivo. Por perfiles de expresión, podemos identificar una firma de proliferación de forma variable expresada en cánceres de próstata. Aquí, nos preguntamos si uno o más biomarcadores tisulares podrían capturar esa información, y proporcionar una utilidad pronóstica. Que analizaron los genes de la firma de tres proliferación:
MKI67 gratis (Ki-67; también es un biomarcador proliferación clásica),
TOP2A gratis (ADN topoisomerasa II, alfa), y
E2F1 gratis ( factor de transcripción E2F 1). La tinción inmunohistoquímica fue evaluable en 139 casos de prostatectomía radical (en formato de microarrays de tejidos), con una mediana de seguimiento clínico de ocho años. Cada uno de los tres marcadores de proliferación era por sí mismo pronóstico. En particular, la combinación de los tres marcadores en conjunto como un "índice de proliferación" (. 0 ó 1,
vs
2 o 3 marcadores positivos) proporcionan un rendimiento superior de pronóstico (razón de riesgo = 2,6 (IC del 95%: 01.04 a 04.09) ;
P
= 0,001). En un análisis multivariado que incluía el antígeno prostático específico preoperatorio (PSA), grado de Gleason y el estadio tumoral patológico, el índice de proliferación de material compuesto siguió siendo un predictor significativo (
P
= 0,005). El análisis de curvas características de receptor de funcionamiento (ROC) confirmó el pronóstico mejora ofrecida por la incorporación del índice de proliferación (en comparación con los datos clínico-Alone). Nuestros resultados ponen de relieve el valor potencial de un multi-gen de diagnóstico y definir un índice de proliferación tri-marcador con posible utilidad para mejorar el pronóstico y la estratificación del tratamiento en el cáncer de próstata basada en firmas
Visto:. Malhotra S, Lapointe J , Salari K, Higgins JP, Ferrari M, Montgomery K, et al. (2011) Un Tri-marcador de índice de proliferación predice la recidiva bioquímica después de la cirugía para el cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (5): e20293. doi: 10.1371 /journal.pone.0020293
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de enero de 2011; Aceptado: 28 de abril de 2011; Publicado: 23 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Malhotra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud: CA111782 (JDB), CA122246 (JRP), CTSA conceder UL1 RR025744 (Stanford Spectrum); y de la Wellcome Fondo Burroughs:#1007519 (JRP, JDB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. A pesar de ello, el cáncer de próstata muestra una considerable variabilidad en el comportamiento clínico. Muchos (si no la mayoría) de los cánceres de próstata clínicamente son indolentes, mientras que otros son clínicamente agresiva, llegando a ser metastásico y letal. Para el cáncer de próstata localizado, las opciones de tratamiento van desde la vigilancia activa ( "espera vigilante") a la extirpación quirúrgica decisiva (prostatectomía radical) o radioterapia [2], [3]. la quimioterapia docetaxel también está siendo evaluado en el tratamiento adyuvante y neoadyuvante [4]. Cada vez más, hay una necesidad de biomarcadores de pronóstico para pacientes con precisión estratificar para la terapia adaptada al riesgo apropiada
factores pronósticos actuales incluyen el grado de Gleason, estadio tumoral y PSA sérico preoperatorio [5] -. [8], y nomogramas que combinan estos datos [9], [10]. Sin embargo, sigue habiendo mucha incertidumbre, y como tal, muchos hombres optan por la terapia innecesariamente agresivo. Otras medidas, por ejemplo, histología del tumor, la ploidía del ADN, marcadores de proliferación, y los genes del cáncer seleccionados, son también objeto de evaluación [11] - [15]. De estos, los marcadores de la proliferación de células tumorales, por ejemplo, fracción de la fase S o Ki-67 inmunotinción, ya están en uso clínico para otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama ejemplo [16], tumores neuroendocrinos de páncreas-gastroentero [17], y el linfoma de células del manto [18].
en estudios anteriores, hemos utilizado microarrays de DNA para el perfil de expresión génica en el cáncer de próstata [19]. agrupamiento no supervisado de los perfiles de expresión reveló grupos distintos de tumores (que definen los subtipos moleculares), así como grupos distintos (o "funciones") de genes co-expresados, la identificación de las vías y procesos biológicos subyacentes. Entre ellas, una característica prominente de expresión genética revela ostensiblemente los niveles de proliferación de células tumorales, y su expresión varió sustancialmente a través de los cánceres de próstata. Aquí, nos propusimos caracterizar los genes de proliferación en firmas como biomarcadores de tejidos, y para evaluar su utilidad pronóstica.
Métodos
firmas moleculares
Para evaluar una firma de proliferación celular en cáncer de próstata, se analizaron publicó anteriormente [19] cDNA microarrays perfiles de expresión génica de cáncer de próstata 71 y 41 de la próstata normal (tejido no afectado de los lóbulos opuestos) especímenes. Los datos de microarrays MIAME son compatibles, y los datos brutos son accesibles al GEO (adhesión GSE3933). La agrupación jerárquica [20] se aplicó a los 7.957 genes (ADNc) que fueron ambos bien medidos (señal /fondo & gt; 1,5 en al menos 50% de las muestras) y de forma variable expresada (cambio expresión ≥2 veces a partir de la mediana en al menos 2 muestras). Un grupo de genes que incluía muchos genes con funciones conocidas en la proliferación celular (un putativo "firma de proliferación" cluster) se evaluó adicionalmente. Los solapamientos entre el supuesto grupo proliferación de firma (que contiene 94 genes únicos) y 639 vía canónica (BioCarta y KEGG) se evaluaron conjuntos de genes utilizando la base de datos de firmas moleculares (MSigDB) [21] función de "solapamiento de cómputo", basada en la distribución hipergeométrica. Ki-67, TOP2A y E2F1 fueron seleccionados de entre los genes de la firma de proliferación basados en la disponibilidad de anticuerpos adecuados para inmunohistoquímica sobre tejido incluido en parafina y fijado en formalina.
Tissue microarrays cohorte
microarrays de tejidos se compone de 139, tumores completamente evaluables fijado en formol e incluidos en parafina primarios de próstata seleccionados de casos de prostatectomía radical de diagnóstico realizados en el hospital de la Universidad de Stanford entre 1986 y 1996, con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional y el consentimiento escrito del paciente (ID de protocolo 11612) [19]. Cada caso fue representado por núcleos tumorales duplicadas 0,6 mm. características clínico-patológicas de los casos se resumen en la Tabla 1. Los pacientes fueron tratados con prostatectomía radical sola, y clínicos de seguimiento cada 6 meses incluyeron la prueba de PSA y el examen físico; la mediana de seguimiento clínico fue de 8 años.
La inmunohistoquímica
Las secciones seriadas de 4 micras se cortaron del bloque de microarrays de tejidos, de-con parafina en Citrisolv (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), y se hidrataron en una serie graduada de soluciones de alcohol. la recuperación de antígeno inducida por calor se llevó a cabo por el tratamiento previo de microondas en citrato (1 mM, pH 6,0) durante 15 minutos antes de la tinción. La peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación previa con peróxido de hidrógeno al 1% en solución salina tamponada con fosfato. anticuerpo monoclonal de ratón Ki-67 (MIB-1; Dako, América del Norte, Carpinteria, CA) se utilizó a una dilución 1:100, anticuerpo monoclonal de ratón TOP2A (SWT3D1; Research Diagnostics, Flandes, NJ) a una dilución de 1:10, y E2F1 anticuerpo de ratón monoclonal (18E10; GeneTex, Irvine, CA) a una dilución 1:200, cada uno por 30 min. detección cromogénica se llevó a cabo usando un reactivo de anticuerpo y DAB secundarios conjugados con peroxidasa proporcionadas con el kit de detección de Envision (Dako). Inmunotinciones fueron anotados por un patólogo (J.P.H) conocimiento de los datos clínicos, y los criterios de positividad establecen para proporcionar una gama dinámica. Para Ki-67 y TOP2A, una fuerte tinción de los núcleos tumorales ≥5% se calificó como positivo. Para E2F1, que tiñó una mayor proporción de núcleos, una fuerte tinción en los núcleos tumorales ≥50% se puntuó como positivo. Si cualquiera de núcleo duplicado calificó como positivo, el caso se consideró positiva.
El análisis estadístico
Las correlaciones entre biomarcadores de proliferación fueron evaluados por correlación de Pearson. Las asociaciones entre los marcadores de proliferación y las variables clínico-patológicas se evaluaron mediante la prueba exacta de Fisher. gráficos de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank se utilizaron para probar la igualdad de las funciones de supervivencia entre los grupos de cáncer de próstata. El análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox multivariado, con lazos que maneja el appoximation Efron, se utilizó para identificar los predictores significativos de recurrencia de PSA. Se evaluaron receptor curvas características de funcionamiento (ROC) para los predictores significativos de recurrencia de PSA. Todos los análisis se realizaron utilizando el paquete de software estadístico R y el software WinStat (R. Fitch Software, Chicago, IL).
Resultados
En nuestros estudios previos, de perfiles de expresión de los cánceres de próstata revelaron distinta molecular subgrupos, así como las características de expresión de genes que reflejan los procesos biológicos subyacentes [19]. En un nuevo análisis de estos datos, una característica prominente de expresión de genes (Fig. 1A) incluye los genes que regulan el ciclo celular (por ejemplo,
CCNE1
,
CDK1
,
), y que participan en la replicación del ADN (por ejemplo,
Pôle2
,
MCM4
,
TK1
) y la dinámica de los cromosomas (por ejemplo,
SMC4
,
CENPE
), lo que refleja ostensiblemente los niveles de proliferación de células tumorales. Esta característica se expresó de forma variable a través de los cánceres de próstata, y particularmente prominente entre metástasis de ganglios linfáticos, y un subconjunto de tumores primarios dentro de los subtipos moleculares 2 y 3, los subgrupos que antes se consideraban [19] clínicamente más agresivos. La evaluación de los solapamientos entre este grupo de genes y conjuntos de genes vía canónica dentro de la base de datos de firma molecular [21] confirmó una conexión a la proliferación celular; los cinco primeros significativamente (
P Hotel & lt; 0,01). gen superposición de conjuntos de todos los relacionados con el ciclo celular /vías de proliferación (Fig. 1B)
(A) análisis de agrupamiento no supervisado de los cánceres de próstata ( conjunto de datos de la ref. [19]) revela subtipos moleculares de cáncer de próstata (1, 2 y 3, de etiqueta), y la expresión de genes de las características que reflejan procesos biológicos subyacentes.
Izquierda
, mapa de calor en miniatura del análisis de conglomerados.
derecho, vista ampliada de la "proliferación grupo", con los genes seleccionados se muestran (
MKI67
,
TOP2A
y
E2F1
en texto rojo, marcado por la flecha). los niveles de expresión rojos y verdes reflejan los valores alto y bajo, respectivamente (ver clave). Red círculos rellenos (
a continuación
) identificar metástasis en los ganglios linfáticos. (B) de la matriz de superposición de los genes proliferación grupo (N = 94) con la vía (CP) conjuntos de genes canónicos identifica los principales partidos conjunto de genes (todas significativas,
P Hotel & lt; 0,001) todos ellos relacionados con el ciclo celular /proliferación . relleno azul continua indica la pertenencia de solapamiento entre proliferación grupo y conjuntos de genes consultados.
Las altas tasas de proliferación en los cánceres son típicamente asociados con un peor resultado clínico. Por lo tanto, tratamos de evaluar el valor pronóstico de la firma genes proliferación, individualmente y en combinación, en el cáncer de próstata. Sobre la base de la disponibilidad de anticuerpos adecuados para inmunohistoquímica sobre tejido incluido en parafina y fijado en formalina, se optó por centrarse en tres firma genes de proliferación,
MKI67 gratis (que codifica el marcador clásico de la proliferación celular, Ki-67) [22 ],
TOP2A gratis (ADN topoisomerasa II, alfa), y
E2F1 gratis (factor de transcripción E2F 1) (fig. 1A).
la inmunohistoquímica se realizó en un microarray tisular que contenían los casos de cáncer de próstata de la prostatectomía radical (Tabla 1), asociado con una mediana de seguimiento clínico de ocho años. Todos los tres marcadores de proliferación mostraron la tinción nuclear se esperaba (Fig. 2A). Curiosamente, mientras Ki-67 y TOP2A típicamente tiñeron sólo una pequeña fracción de los núcleos tumorales, E2F1 menudo tiñó la mayoría de las células tumorales (Fig. 2A). Ki-67 y TOP2A inmunotinción través de los casos se correlacionó significativamente (r = 0,38,
P Hotel & lt; 0,001) (Figura 2B.). Ki-67 y E2F1 estaban menos relacionadas (sólo falta la significación estadística) (R = 0,13,
P
= 0,06), y hasta cierto punto sorprendente, TOP2A y E2F1 no aparecen correlacionados (R = 0.00,
P
= 0,50) (figura 2B)
(A) La inmunotinción de marcadores de proliferación Ki-67, TOP2A y E2F1..; los casos positivos y negativos representativos muestran. (B) de comparación por parejas de las puntuaciones immunostain través de los casos. La correlación de Pearson (R) Los valores mostrados. (C) Análisis de Kaplan-Meier de Ki-67 (& lt; 5%
vs
≥5% de núcleos tumorales.), TOP2A (& lt; 5%
vs
≥5% de núcleos tumorales. ) y E2F1 (& lt; 50%
vs
≥50% núcleos tumorales) inmunotinción..
P-valores
(prueba de log-rank) que se muestran. análisis (D) de Kaplan-Meier de la tinción marcador combinado (ver claves).
P-valores
(log-rank test) se muestra.
Para evaluar y comparar el valor pronóstico, se realizó un análisis de Kaplan-Meier en el set de 139 casos que fueron evaluables para todos tres marcadores de proliferación. Ki-67 positividad (≥5% de tinción núcleos) mostró una fuerte tendencia a la anterior bioquímica de recidiva después de la prostatectomía (
P = 0,107
) (Fig. 2C) (análisis de la totalidad de los 156 casos evaluables para ki -67 alcanzó significación estadística; datos no mostrados). TOP2A positividad (≥5% de tinción núcleos) y la positividad de E2F1 (≥50% de tinción núcleos) se asociaron significativamente con la recurrencia anterior (
P = 0,028
y
P = 0,043
, respectivamente) (figura . 2C). Ninguno de los tres biomarcadores de proliferación se asoció significativamente con otras características clínico-patológicas, incluyendo el PSA preoperatorio, grado de Gleason y el estadio del tumor (Tabla 2).
También determina si la combinación de marcadores podría aumentar el valor pronóstico. Una comparación de los casos que no tienen, una, dos o tres marcadores de proliferación positivos mostró diferencias significativas (
P
= 0,009), en general, con números crecientes de marcadores positivos asociados con la recurrencia anterior (Fig. 2D). La estratificación de los casos sin ninguna o con un marcador positivo,
vs.
Casos con dos o tres marcadores positivos, en lo sucesivo denominado el tri-marcador "índice de proliferación", siempre y cuando la mayor importancia pronóstica (
P =
0,001), con un riesgo relativo de 2,6 confianza (95% intervalo de 01/04 a 04/09). Este resultado también fue evidente por el análisis de las curvas ROC (Tabla 3; tenga en cuenta la mayor área bajo la curva para el índice de proliferación tri-marcador)
marcadores de pronóstico Cabe destacar que, en un análisis multivariado que incluía conocidos. - PSA sérico preoperatorio, grado de Gleason y el estadio patológico, - el índice de proliferación de material compuesto se mantuvo un predictor significativo (
P
= 0,005) (Tabla 4). El pronóstico mejora ofrecida por la incorporación del índice de proliferación (en comparación con los datos clínico-Alone) fue confirmada por comparación de gráficos de Kaplan-Meier (Figura 3A;. En cuenta la prueba P-valor más significativo de log-rank) y de curvas ROC (Tabla 3 y la figura 3B;. en cuenta la mayor área bajo la curva)
(a) el análisis de Kaplan-Meier comparando modelos multivariados basados en los datos clínico-patológicas (
la izquierda) y los datos clínico-patológicas más el tri. el índice de proliferación marcador (
derecha). Los casos se agrupan por tercil. Log-rank test
P
-valores se indican. Análisis de la curva (B) ROC comparar los modelos multivariados basados en los datos clínico-patológicas (
la izquierda) y de datos clínico-patológicas más el índice de proliferación tri-marcador (
derecha). El análisis hecho a los 8 años de seguimiento (la mediana del tiempo de seguimiento de la cohorte). Las áreas bajo la curva (AUC) se indican.
Discusión
En este estudio, se evaluó el cáncer de próstata la utilidad pronóstica de biomarcadores tisulares de la proliferación celular, identificado a partir de de perfiles de expresión patrones. Dos biomarcadores, TOP2A y E2F1, anotado por inmunohistoquímica, eran cada pronóstico (y el clásico marcador Ki-67 casi). En particular, los marcadores de la combinación de mejorar aún más valor pronóstico. Un índice de proliferación de material compuesto (0,1
vs.
2,3 marcadores positivos) proporcionó la mayor importancia pronóstica, y retuvo valor cuando se combina con factores pronósticos que se utilizan actualmente.
Los marcadores que evaluamos eran seleccionado de entre los genes de racimo proliferación de cáncer de próstata. La "firma de proliferación" (revisado en ref. [23]) es un modelo comúnmente encontrado en los estudios de microarrays. Informó por primera vez en líneas celulares de cáncer de mama y los tumores [24], la firma de proliferación es prominente en diversos tipos de cáncer (en comparación con el tejido normal) [25]. Entre sus miembros se solapa significativamente con el ciclo celular regulados los genes [26], y su presencia se correlaciona con tiempos de duplicación de células en cultivo [27], y Ki-67 tinción en los tumores [24], [25]. La firma de proliferación también se ha encontrado pronóstico en el cáncer de mama [28], [29] y en el linfoma de células del manto [30].
Gene firmas probable capturar más información de la que el ensayo de genes individuales, y de hecho la firma multi-gen Los ensayos han alcanzado el uso clínico [31] - [33]. En particular, dos firmas de predicción /pronósticos como cáncer de mama incluyen genes que informan sobre la proliferación celular [31], [32]. Sin embargo, las pruebas de microarrays no es fácil de implementar en el laboratorio clínico. Por ello, pregunta si un pequeño número de genes podría capturar de manera efectiva la información pertinente en la firma de proliferación, mediante técnicas de inmunohistoquímica directa.
Se evaluaron tres genes de proliferación. Ki-67 (proliferación asociada Ki-67 antígeno), codificada por el gen
MKI67
y comúnmente identificado por el anticuerpo MIB-1, es un antígeno nuclear expresa en la proliferación pero no las células quiescentes [34], aunque su función específica sigue siendo incierto. Estudios previos han demostrado Ki-67 para ser un predictor independiente de los resultados en pacientes con cáncer de próstata tratados con prostatectomía radical [35] - [39] o la radioterapia [40]. De acuerdo con estos estudios, también encontramos Ki-67 para ser de pronóstico, a pesar de que se perdió importancia para el subconjunto de casos evaluables para los tres marcadores de proliferación.
TOP2A es una topoisomerasa de ADN de tipo II, el control del estado topológico de ADN (catalizando roturas de doble cadena transitorios) durante la transcripción del ADN, la recombinación, replicación y partición de cromosomas en la división celular [41]. TOP2A es también un objetivo de varios fármacos antineoplásicos, por ejemplo, doxorrubicina y etopósido. expresión TOP2A por inmunohistoquímica ha demostrado ser de pronóstico en cáncer de mama [42] y de ovario [43] cánceres. Más recientemente, TOP2A transcripción [44] y de la proteína [45] niveles se han asociado con la progresión sistémica de cáncer de próstata. Nuestros propios datos corroboran esta asociación.
E2F1 es un regulador transcripcional clave de la replicación del ADN y la progresión del ciclo celular, y está regulado negativamente por el supresor de tumor RB1 [46]. La vía de Rb /E2F se interrumpe en la mayoría de tipos de cáncer [47]. En particular, un enriquecimiento significativo de sitios de unión de E2F1 se ha encontrado entre las regiones promotoras de los genes de la firma de proliferación [48], y objetivos conocidos incluyen, por ejemplo,
CCNE1
,
CDC25A
,
MCM4
,
TK1
, y
CENPE
[49]. Por lo tanto, E2F1 es no sólo un gen firma de proliferación, pero sí un regulador transcripcional de otros genes de la firma proliferación.
inmunotinción E2F1 se ha encontrado para ser pronóstico en cáncer de mama [50] y el pulmón [51] tipos de cáncer, y nos ahora ampliar este trabajo para el cáncer de próstata. Cabe destacar que, mientras que E2F1, Ki-67 y TOP2A los niveles de transcripción son todos del ciclo celular regulado [26], por lo general observamos E2F1 inmunotinción en una mayor proporción de células tumorales, a diferencia de Ki-67 y TOP2A, que tiñe sólo una fracción minoritaria de las células. Como tal, anotando positividad E2F1 podría ser más sencillo y reproducible, y una nueva evaluación de E2F1 como la proliferación y marcador pronóstico en la próstata y otros tipos de cáncer se justifica.
Es importante el descubrimiento de que anotar tres marcadores de proliferación proporciona superiores información pronóstica y asegurar que exista sólo uno. ¿Por qué esto es así? En el nivel de transcripción, E2F1, TOP2A y Ki-67 pico en diferentes etapas del ciclo celular, G
1 /S, G
2 y G
2 /M, respectivamente [26]. Por lo tanto, es posible que los tres marcadores en conjunto proporcionan una instantánea más completa de las células proliferantes. Como alternativa, utilizando tres marcadores pueden "suavizar" la imprecisión en la puntuación patólogo. Si la inclusión de más de tres marcadores de proliferación podría mejorar aún más el rendimiento es desconocida, aunque se nota que tres marcadores está dentro del rango de lo que es práctico para los laboratorios de histología (donde los paneles de anticuerpos están clasificadas de forma rutinaria), y más fácil, más rápido y más barato que un microarray.
en resumen, hemos demostrado que un índice de proliferación tri-marcador proporciona un rendimiento mejorado pronóstico en el cáncer de próstata, añadiendo valor por encima de los factores pronósticos que se utilizan actualmente. Mientras que en las cohortes de validación adicionales, y en las secciones de tejidos enteros, se justifica, nuestros hallazgos sugieren que el índice de proliferación podría ayudar en la estratificación del riesgo, para la selección de terapias agresivas apropiada (por ejemplo, el uso de la terapia adyuvante) y, finalmente, mejorar los resultados del paciente. serían necesarios ensayos clínicos Cleary, para evaluar el beneficio con respecto a la morbilidad y la mortalidad asociada al cáncer de próstata. Por último, vale la pena señalar que muchos fármacos antineoplásicos se dirigen a la proliferación celular [23], incluidos los taxanos, que parecen ser prometedores en el tratamiento adyuvante /neoadyuvante [4]. Por lo tanto, es posible (y vale la pena investigar más) que el índice de proliferación también puede mostrar utilidad para predecir la respuesta a la quimioterapia específica.
Reconocimientos
Queremos agradecer a los miembros del laboratorio de Pollack discusión útil.