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PLOS ONE: Undecylprodigiosin apoptosis inducida en células de cáncer P388 se asocia con su unión a Ribosome

2015/7/23


Extracto

prodigiosinas (PGs) son una familia de pigmentos rojos naturales con actividad contra el cáncer, y un miembro de la familia ha entrado ensayos clínicos de fase II. Sin embargo, los mecanismos anticancerígenos de PGs permanecen en gran medida poco clara. Este estudio fue diseñado para investigar la base molecular de la actividad contra el cáncer de UP, un derivado de PGs, en células P388. Mediante la introducción de inhibidores farmacológicos y utilizando una variedad de enfoques analíticos incluyendo el Western Blot, citometría de flujo y microscopía láser confocal, se encontró que UP inhibió la proliferación de P388 a través de células de detención en G2 /células inductoras de fase y la apoptosis M, que estaba relacionado con la activación de P38, JNK en lugar de ERK1 /2 señalización. ROS regeneración y la acidificación en las células no aparecen implicados en la apoptosis inducida por la UP. Además, la utilización de la espectrometría de masas, sacarosa fraccionamiento en gradiente de densidad y tinción de inmunofluorescencia, descubrimos que UP fue aparentemente situado en ribosoma. Estos resultados en conjunto indican que los ribosomas puede ser el objetivo potencial de UP en las células cancerosas, lo que abrió una nueva vía para delinear el mecanismo contra el cáncer de PGs

Visto:. Liu P, Wang Yy, Qi X, Gu Q, Geng H, Li J (2013) Undecylprodigiosin apoptosis inducida en células de cáncer P388 se asocia con su unión a ribosoma. PLoS ONE 8 (6): e65381. doi: 10.1371 /journal.pone.0065381

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Canada |
Recibido: 5 de Noviembre, 2012; Aceptado: April 24, 2013; Publicado: 14 Junio ​​2013

Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los subsidios de alta tecnología nacional de I + amp; D Programa (2011AA09070104) de China y Programa de Changjiang eruditos y Equipo de investigación innovadora en la Universidad (IRT0944). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

prodigiosinas (PGs) son una familia de pigmentos rojos naturales, estructuralmente caracterizados por un esqueleto pyrrolylpyrromethene común con diferentes cadenas laterales. PGs, originalmente aisladas de Serratia por Amak en 1929, se componen de prodigiosina (PG), prodigiosina 25-C (PG 25-C), metacycloprodigiosin (MP), cycloprodigiosin (CPRG) y undecylprodigiosin (UP), etc. PGs son la metabolitos secundarios de varias bacterias con diversas actividades biológicas, tales como anti-microbianas, anti-malaria, inmunosupresora y el cáncer. Las estructuras de PG y UP se muestran en la Figura 1 [1], [2].

El aumento de los estudios han sugerido que la actividad anticancerígena de PGs. Se ha informado de que PGs induce la apoptosis en células hematopoyéticas, gastrointestinal, de mama y de cáncer de pulmón, mientras que no es tóxico para las células no malignas [3] - [5]. En la actualidad, un derivado de PG GX15-070 ha entrado en ensayos clínicos de fase II para su actividad contra el cáncer [6].

Los estudios de crecimiento han llevado a cabo para revelar las dianas moleculares de las PG para obtener información sobre su eficacia contra el cáncer, pero la resultados revelaron grandes discrepancias en diferente contexto celular o el uso de compuestos individuales. PGs se han reportado para activar las vías de señalización posiblemente a través de la inducción de ADN se rompe y /o neutralización de gradientes de pH de doble filamento, lo que conduce a alteraciones del ciclo celular y apoptosis. Janus quinasa tirosina 3 (Jak3) que también se sugirió asociados con IL-2R tras la activación a ser la diana molecular para PGs en células de cáncer gástrico [7]. Recientemente, M. Espona-Fiedler identificó el objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) como una diana molecular candidato de PGs en las células de melanoma [8]. Sin embargo, el mecanismo molecular de PG sigue siendo en gran medida poco clara.

Hemos extraído a partir del caldo de fermentación de una esponja Mycale deriva-plumosas actinomiceto
Saccharopolyspora sp.nov
, y se encontró que este compuesto exhibía actividad citotóxica significativa contra cinco líneas celulares de cáncer, entre los que el impacto sobre la P388 de la leucemia murina era el más evidente [9]. En el presente estudio, hemos intentado revelar las bases moleculares de UP en su actividad contra el cáncer en las células P388. Los resultados indican que hasta inhibe la proliferación de P388 mediante la inducción de la detención G2 /M fase y apoptosis, que estaba relacionado con la activación de P38, JNK en lugar de ERK1 /2 señalización. El ribosoma aparece el objetivo potencial de la UP. Este estudio proporciona bases moleculares para dilucidar el mecanismo contra el cáncer de PGs en el futuro.

Materiales y Métodos

Reactivos

UP y PG fueron proporcionados por el profesor Gu (Escuela de Medicina y Farmacia, Universidad Oceánica de China, Qingdao, China). Sus purezas eran & gt; 99,5%. 4,6-diamino-2-phenyllindile (DAPI), el yoduro de propidio (PI). suero bovino fetal (FBS) se adquirió de GIBCO (Gaithersburg, MD). Un kit de quimioluminiscencia potenciada (ECL) se adquirió de Pierce (Holmdel, NJ) .U0126, SP60012, SB203580, SRB, DCFH-DA, BCECF AM, AO fueron todos adquiridos de Beyotime Instituto de Biotecnología (Jiangsu, China). PARP, Cyt C, caspasa-3, Caspse-8, caspasa-9, β-actina, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 y el anticuerpo P38 se adquirieron de Cell Signaling (Beverly, MA). anticuerpo S3 proteína ribosomal se adquirió de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA).

Líneas celulares y cultivo

Las líneas celulares fueron comprados por el Instituto de Bioquímica y Biología Celular (Shanghai, China) y mantenido de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. En resumen, las células P388 se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco mínimo esencial (DMEM); las células A459 se cultivaron en medio F12K. Ambos medios se suplementaron con suero bovino fetal 10%. Las células se mantuvieron en 5% de CO2 a 37 ° C.

Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular se midió por el ensayo de SRB. células P388 se cultivaron a 8 × 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos y después se trató con UP para 72 h. En algunos experimentos las células se trataron previamente con NAC, iminazole o inhibidor de MAPK para 1 h. Las células se incubaron con ácido 16% tricloroacético (TCA) a 4 ° C durante 1 h, después de lo cual, las placas se lavaron cinco veces con agua fría, el exceso de agua se drenó y las placas se dejan secar en el aire. se añadió tinción de SRB (100 l, 0,4% en ácido acético al 1%) a cada pocillo y se deja en contacto con las células durante 30 min, a continuación, las células se lavaron con ácido acético al 1% para cinco veces. Las placas se secaron y se añadieron 150 l de Tris base 10 mM (pH 10,5) a cada pocillo para solubilizar el colorante durante 30 min. La absorbancia (DO) de cada pocillo se leyó en un lector de microplacas (Tecan, Austria) a 490 nm de longitud de onda. El% de viabilidad celular = (DO de las células tratadas /OD de las células de control) x 100%.
Se sembraron
Contenido de ADN Análisis
células
P388 en placa de cultivo de 100 mm a 2 × 10
5 células /placa, 24 h después, las células se trataron con UP para 24 h. Después de eso, se recogieron las células, se fijaron con etanol al 70% frío a 4 ° C durante 12 h, se incubaron con RNasa A (30 mg /ml) durante 30 min a temperatura ambiente, y luego se tiñeron con yoduro de propidio (50 g /ml ) a 4 ° C durante 30 min. El ADN celular se analizó mediante citometría de flujo (Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA).

Análisis de Western Blot

Después de UP (0,05 M) de tratamiento durante 1 h ó 24 h, 1 × 10
6 células se lavaron con PBS y después se lisaron con RIPA (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% desoxicolato de sodio NP-40, 0,5%, 0,1% SDS) durante 30 min en hielo. El lisado celular se cargó para electroforesis en 10% SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a una membrana de NC (Millipore, EE.UU.). Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% diluido en TBS-T durante 2 horas a RT, después se incubaron durante la noche con anticuerpos para la PARP, Cyt C, caspasa-8, 9, 3, p-AKT, AKT, p- ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 y P38. IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:3000) se incubaron durante 1 h a TA. Entre cada incubación, las membranas se lavaron 3 x 5 min en TBS-T. Unión de los anticuerpos se detectó con el reactivo de quimioluminiscencia potenciada.

La localización de UP en células

P388 células cultivadas en cubreobjetos fueron tratados con UP (0,05 M) .at 37 ° C durante 1 h. Después de tres lavados con PBS, las células fueron incubadas con DAPI. Los cubreobjetos se examinaron con un microscopio confocal de barrido láser (LSM510-Meta, Zeiss, Alemania) [10].

AO tinción

Las células cultivadas vivas se tiñeron con naranja de acridina como se describe anteriormente [ ,,,0],11], [12]. Brevemente, las células P388 en un portaobjetos de cámara se expusieron a UP durante 1 h. Entonces se incubaron las células con naranja de acridina 5 mg /ml durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Los portaobjetos de cámara se lavaron con solución de Hanks y luego se examinaron mediante microscopía láser confocal.

Detección de pH intracelular (pHi)
células
P388 fueron expuestos a 0,05 M de UP durante 1 h. Las células cultivadas se lavaron con PBS, se centrifugaron y se cargaron con 10 M 29, 79-bis- (carboxietil) -5 (69) carboxifluoresceína acetoximetilo éster (BCECF-AM) a 37 ° C durante 30 min en PBS. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en PBS y se analizaron por citometría de flujo [4].

Detección intracelular de especies reactivas del oxígeno (ROS)

estrés oxidativo intracelular se evaluó mediante la medición de la oxidación intracelular de 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCFH). El sustrato es DCFH-DA que se difunde fácilmente en la célula y está al lado desacetilado por esterasas celulares a la más hidrófila, DCFH no fluorescente. la generación de ROS en la célula oxida DCFH al fluorescente 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCF). células P388 se sembraron, y se incubaron con UP (0,05 M) durante 1 h, después se recogieron las células, se lavaron, y se cargaron con DCFH (10 mM) a 37 ° C durante 30 min. Entonces se recogieron las células, se lavaron, y se cargaron con DCFH (10 mM) a 37 ° C durante 30 min. Finalmente las células se lavaron con PBS, y la fluorescencia celular se adquirieron usando citometría de flujo con excitación a 488 nm y emisión a 530 nm [13], [14].

nativo-PAGE y análisis de espectrometría de masas

Después de la incubación con UP (0,05 M) durante 1 h a 37 ° C las células, P388 se cosecharon y se lisaron con tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100) para 30 min en el hielo, se centrifugó a 12.000 g durante 20 min a 4 ° C. Se añadió un volumen igual de tampón de carga (trisbase 50 mM, 30% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol) a sobrenadante. Las muestras fueron separados en un 8% nativo-PAGE, y la tira fue cortada de acuerdo con el color de la UP. Las proteínas de unión con UP fueron analizados por LC-ESI-LTQ (Thermo Finnigan LTQ) contra la base de datos NCBI proteína de ratón [15].

gradiente de densidad de sacarosa fraccionamiento

Para preparar el extracto citoplásmico para el fraccionamiento ribosomal , las células P388 fueron tratados con 0,05 M durante 1 h, después se lavó con PBS enfriado en hielo dos veces y se lisaron en helado RIPA durante 30 min, luego se centrifugó a 10.000 × g durante 15 min para eliminar el sobrenadante resultante de núcleos, mitocondrias y escombros. solución de proteína de lisado se depositó más de 9 ml de solución de gradiente de sacarosa lineal (10 a 50%) en un tubo de centrífuga Sorvall 11,5 ml y se centrifugó a 35.000 × g durante 3 horas a 4 ° C en ultracentrífuga (Beckman Optima TM L-100 XP). Sólo sin lisado en la parte superior de la solución de gradiente lineal de sacarosa se utilizó como control [16].

La tinción de inmunofluorescencia

P388 células se inocularon en una placa de seis pocillos y se cultivaron durante la noche. Las células se expusieron a UP (0,05 M) durante 1 h. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron durante 10 min con 4% de formaldehído. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS y después se permeabilizaron durante 10 minutos con 0,1% Triton X-100, las células se pre-incubaron con PBS que contenía 1% de BSA durante 20 a 30 min y se tiñeron con anticuerpo S3 proteína ribosomal durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con anti-IgG de ratón-FITC durante 30 min. Después, las células se lavaron con PBS y se examinaron usando microscopios confocal de barrido láser [17].

Resultados

UP inhibe el crecimiento de células P388

Para determinar el efecto citotóxico de UP en las células P388, se utilizó un ensayo con SRB para evaluar la proliferación celular después del tratamiento de 72 h. En un intervalo de concentración de 0,0048 a 15
μ
Μ, el tratamiento UP resultó en una inhibición dependiente de la concentración en el crecimiento celular de células P388. El IC
20 e IC
50 sobre las células P388 fueron 0,0049
μ
Μ y 0,042
μ
Μ respectivamente (Fig. 2).

Las células se tratado con la concentración indicada de UP y PG por 72 h. Los datos mostrados representan los porcentajes de viabilidad celular de tres experimentos independientes con tres determinaciones en cada uno. **,
p Hotel & lt; 0,01 y ***, p. & Lt; 0,001 frente a control

UP induce la fase G2 /M detención y la apoptosis en células P388

La supresión del crecimiento de células de cáncer ha sido conocido por ser mediada principalmente por apoptosis y detención del ciclo celular. Aplicamos siguiente citometría de flujo para analizar la distribución de fase del ciclo celular y la apoptosis tras el tratamiento UP. células P388 tratados con UP (0,05 M) durante 24 h mostraron acumulación en G2 /M (40,73%), con una disminución concomitante en las células en fase G1 G0 /, sugiriendo una detención del ciclo celular en fase G2 /M. UP también indujo un mayor porcentaje de población sub G0 /G1, indicativo de que se produzca apoptosis. Acerca de 8,23% de células apoptóticas fue cuando se tratan con UP para 24 h en contraste a & lt (Fig 3A.); 1% de células apoptóticas en el grupo de control no tratado. Además, se examinaron UP poli inducida (ADP-ribosa) polimerasa de escisión, una característica de la apoptosis que indica la activación de las caspasas. Los resultados mostraron que la hidrólisis de la proteína polimerasa de 116 KD poli (ADP-ribosa) al 85 KD se detectó en UP células tratadas después de la exposición de 24 horas a 0,05 M. Para examinar si las caspasas estaban involucrados en la apoptosis inducida por la UP, Western blot se llevó a cabo para confirmar aún más la participación de la caspasa-3, caspasa-8 y la caspasa-9. Se detectaron las bandas cleavaged de procaspasa-3, la procaspasa 8 y la procaspasa-9 después del tratamiento con UP para 24 h, lo que indica la activación de la caspasa-3, caspasa-8 y la caspasa-9.

A. histogramas de ADN de células P388 cultivadas en medio solo, o en DMSO (1:1000) o en presencia de PG 0,05 M y UP para 24 h. B. Expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis se determinó por inmunotransferencia con anticuerpos específicos después de la exposición a UP durante 24 horas. La expresión se cuantificó utilizando el sistema informático ImageQuant análisis de imágenes. Cada columna representa los escaneada por duplicado de tres pozos, expresado como porcentaje de control de ± desviación estándar. *,
P Hotel & lt; 0,05, frente a UP en blanco. C. Representante citometría de flujo perfiles por Rodamina 123 tinción, después de que las células se incubaron con 0,05 M de UP para 24 h. a, DMSO; b, 0,05 M PG; c, 0,05 μΜ UP.

A continuación examinó la liberación mitocondrial de Cyt C, aguas arriba de la vía de la caspasa 9. Después de 24 h de tratamiento con UP, la liberación de Cit C en el citosol fue considerablemente aumentado, mientras que Cyt C en la mitocondria disminuye obviamente (Fig. 3B). Ha sido sabe que la liberación de proteínas de la intermembrana como Cyt C se produce después de que se deteriora la integridad de la membrana mitocondrial, lo que conduce a una interrupción del potencial transmembrana interior (ΔΨm). El impacto de la UP en el potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨm) fue evaluado utilizando rodamina 123, una sonda fluorescente específica. La intensidad de fluorescencia se redujo significativamente en las células UP tratados, en comparación con el grupo control (Fig. 3C). Estos resultados en conjunto sugieren que la vía apoptótica mitocondrial esencial, que implica la caspasa-9 y -3, está implicado en la apoptosis inducida en las células P388.

UP localiza predominantemente en el citoplasma

UP emite roja fluorescencia a 488 nm de excitación, que se puede visualizar en las células vivas. Las células P388 fueron teñidas con colorante de unión al ADN DAPI después de 1 h de exposición a 0,05 M para examinar la localización subcelular de la UP. Las células fueron imágenes con microscopía láser confocal. Como se muestra en la Fig. 4, UP fue localizado predominantemente en el citoplasma, pero no de la membrana o en el núcleo.

El azul representa la tinción núcleo y el rojo representa UP.

UP Activa MAPK, pero no AKT señalización

para determinar la posible participación de las vías de la proteína quinasa en G2 /M detención y la apoptosis inducida por UP, que probaron el estado de fosforilación de las cuatro principales proteínas quinasas que se refieren a la proliferación celular en las células P388 después expuestas a UP durante 1 h. Como se muestra en la Fig. 5A, UP, obviamente, aumenta los niveles de fosfato ERK1 /2, fosfo-p38MAPK, y fosfo-JNK1 /2, mientras que el estado de fosforilación de AKT apenas se ve afectada. El contenido total de proteínas de las respectivas proteínas quinasas no se ha modificado.

A. Efectos de la exposición de las células P388 a 0,05 M durante 1 h en el estado de fosforilación y el nivel de expresión de las proteínas quinasas. La expresión se cuantificó utilizando el sistema informático ImageQuant análisis de imágenes. Cada columna representa los escaneada por duplicado de tres pozos, expresado como porcentaje de control de ± desviación estándar. ***,
P Hotel & lt; 0,001, UP vs. Control. B. Efectos de inhibidores de MAPK en la inhibición del crecimiento inducida P388-UP, las células fueron pretratadas con U0126 (10 mM), SP60012 (20 M) o SB203580 (20 M) durante 1 h, a continuación, co-tratados con UP para 72 h. U0126, un inhibidor de ERK; SP60012 (SP), inhibidor de la JNK; SB203580 (SB), inhibidor de P38. **, P & lt; 0,01, frente a PG (PG + inhibidor), UP vs. (UP + inhibidor) guía empresas
Para abordar más a fondo si ERK1 /2, JNK1 /2 o P38 estaba involucrado en la UP. crecimiento celular -inhibited, las células se incubaron con o sin el inhibidor de ERK1 /2, JNK1 /2 y p38, respectivamente, y luego cotreated con 0,05 M UP para 72 h. Las células de proliferación se estimó por el método SRB. Como se muestra en la Fig. 5B, ninguno de estos inhibidores afectada la proliferación de células per se. SP y SB pero no U0126 obviamente revirtió el efecto inhibidor de UP en la proliferación de las células P388, lo que indica que /2 y P38 activación JNK1 estaba involucrado en la apoptosis inducida por UP. Sólo se encontró la activación P38 estar relacionado con la apoptosis inducida por PG, que estaba de acuerdo con informes de la literatura [18].

NAC no protege las UP produjo inhibición de la proliferación celular

se informa que PGs podrían inducir la producción de ROS en células [19]. Para examinar la posible la participación de ROS en la apoptosis inducida en marcha y detención en la fase G2 /M en células P388, que en primer lugar medimos la generación de ROS en las células. Los resultados mostraron que la generación de ROS se aumentó tan pronto como 1 h después del tratamiento (Fig. 6A). Para revelar si las cuentas de generación de ROS para la apoptosis inducida por UP, un eliminador de ROS NAC se utilizó antes del tratamiento UP. Como se muestra en la Fig. 6A, la NAC no para rescatar a la inhibición del crecimiento inducida por UP y PG, donde en contraste H
2O proliferación celular
2 suprimida estaba claramente revertida por tratamiento con NAC. Estos hallazgos sugieren que la generación de ROS es más probable que no participan en la apoptosis inducida por la UP.

A. células P388 se trataron con 0,05 M durante 1 h, y se tiñeron con DCFH (10 M). Se midió la fluorescencia por citometría de flujo. a, DMSO + DCFH; b, 0,05 M PG; c, 0,05 M PG + DCFH; d, 0,05 M UP; E, 0,05 M UP + DCFH. células B. P388 eran pretratamiento con o sin NAC (0,5 mM) durante 1 h, a continuación, las células se co-incubaron con PG (0,05 M), UP (0,05 M) y H
2O
2 (0,4 mM) por 72 h. *, P & lt;. 0,05, H
2O
2 vs (H
2O
2 + NAC) guía empresas
La acidificación no participa en marcha ha causado la inhibición del crecimiento

la naranja de acridina es un "ácido trópico" base débil, que ha sido tomado por las células vivas y se acumula en los compartimentos acidificadas tales como lisosomas [17], [20]. La fluorescencia de la naranja de acridina es verde en concentraciones bajas, mientras que a altas concentraciones de los cambios de fluorescencia a naranja [17]. Hemos observado la desaparición obvia en gránulos de color naranja en las células después del tratamiento corto (1 h) con 0,05 M de PG y UP (Fig. 7A). Los cambios de pHi también se analizaron por citometría de flujo con BCECF-AM, un indicador fluorescente de membrana permeable para la medición de pH citoplasmático. Se encontró que el pHi se redujo considerablemente en PG o células tratadas-UP (Fig. 7B) en comparación con las células no tratadas.

A. La naranja de acridina tinción de las células P388, PG y MP fueron 0,05 M, AO era 5 mg /ml. gránulos de color naranja fueron acidificadas compartimentos. B. representar los datos de citometría de flujo análisis pHi usando 10 M BCECF-AM tinción después de que las células se incubaron con 0,05 M de PG o UP durante 24 h con o sin imidazol (0,5 mM) de pretratamiento para 1 h. un control; b, PG; c, PG + imidazol; d, UP; e, UP + imidazol C. Efecto del inhibidor de la acidificación en la inhibición del crecimiento P388 inducida-UP, las células fueron pretratadas con imidazol (0,5 mM) durante 1 h, a continuación, co-tratado con PG (0,05 M) y UP (0,05 M) de 72 h.

por el contrario, las bases permeables a las células de tratamiento imidazol impedido notablemente la disminución de la phi. A continuación, prueba si la inhibición del crecimiento causado-UP podría ser rescatado por imidazol. Paralelamente a la exposición UP, que no fueron capaces de identificar diferencias significativas en comparación con las células tratadas, aproximadamente sólo el 3% de recuperación (Fig. 7C), lo que sugiere que la acidificación del citoplasma no debe ser la razón principal de la apoptosis inducida por la UP. PG fue notado para tener resultados similares a UP.

UP está unido al ribosoma en células P388

Se procedió a identificar las dianas moleculares de UP en las células P388 mediante la identificación de las proteínas de unión utilizando la espectrometría de masas análisis. UP migración se puede observar fácilmente con un simple vista como una banda de color naranja en PAGE nativa (Fig. 8A). La banda de gel se cortó y se sometió a análisis de espectrometría de masas. Se detectaron un total de 951 proteínas, entre las que 171 proteínas, para nuestra sorpresa, eran proteínas ribosomales con mayor CoverPercent (Tabla 1), lo que sugiere que puede unirse UP principalmente a ribosoma.

A. La tira de UP en nativo-PAGE. B. La sacarosa fraccionamiento en gradiente de densidad de células P388 tratados con más o más solo. C y D. localización subcelular de Rps3 y UP en las células P388 (C) y células A549 (D) detectados por confocal. fluorescencia UP se muestra en rojo, la fluorescencia Rps3 en verde y la colocalización (fusionar) en amarillo.

Para una validación adicional, las células P388 fueron incubadas con UP en 0,05 M durante 1 hy ribosoma se aisló por fraccionamiento en gradiente de densidad de sacarosa. La comparación con el grupo control en el que hasta se enriqueció en la parte superior de la solución de densidad de sacarosa, se encontraron evidentes de color-bandas en capas en la UP células tratadas (Fig. 8B), apoyando la idea de que UP se une al ribosoma. También se detectó la colocalización entre la UP y el ribosoma mediante microscopio confocal tanto en las células P388 (Fig. 8C) y células A549 (Fig. 8D). La tinción de inmunofluorescencia mostró que hasta colocalizó al ribosoma indentified por endógena Rps3 en las dos líneas celulares.

Discusión

Hasta la fecha, el mecanismo contra el cáncer de PGs todavía no se han aclarado en detalles. Por ejemplo, Francisco R informó PG impactado mitocondrias, ejerce un efecto de desacoplamiento de la cadena electrónica, el núcleo de la célula fue preservada de prodigiosina acceso [17]. Sin embargo, los resultados de Montaner B indican que la apoptosis inducida por PGs fue la escisión de ADN [21] de cobre mediada. Jing Zhang et al. También informó que las PGs aumentó intercelular ROS, lo que llevó a los efectos citotóxicos [19]. Las dianas moleculares de PGs son reportados de manera incompatible incluyendo JAK3, mTOR y NAG-1 [7], [8], [22]. En nuestro estudio, creemos que la apoptosis inducida en las células P388 se asocia con la unión del ribosoma-UP.

Hemos encontrado que UP inhibió la proliferación celular, detenido el ciclo celular en la fase G2 /M, dio lugar a la activación de la caspasa 3, 8, 9, alteraciones del potencial de membrana mitocondrial, la liberación de Cyt C y la escisión de PARP. Estos resultados indican que hasta tiene citotoxicidad para P388 y P388 induce la apoptosis de células participación en las mitocondrias ruta apoptótica por lo menos. Con el fin de dilucidar el mecanismo de apoptosis subyacente inducida por UP, se evaluó primero la distribución de células de UP con su auto-fluorescencia, el resultado mostró que hasta distribuye en el citoplasma, pero no de la membrana o núcleo, lo que nos sugiere que UP puede interactuar con moléculas en citoplasma para inducir la apoptosis.

La PI3K /Akt regula las funciones celulares fundamentales, tales como el crecimiento celular, la supervivencia y el movimiento. activación extravagante de la vía PI3K /Akt se ha informado que se asocia con el desarrollo de cáncer. Akt también puede regular directamente la maquinaria apoptótica mediante la fosforilación e inactivación de proteínas pro-apoptóticas tales como el mal, además, se requiere la actividad de Akt para la transición de la fase G2 /M y la inhibición de AKT menudo induce G2-M detención [23]. Sin embargo, en nuestros experimentos, UP no se encontró para influir en la activación de AKT de P388.

MAP quinasas se componen de proteínas quinasas serina /treonina, que incluye las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), la MAPK p38, las quinasas c-Jun-NH2-terminal (JNK) y MAP quinasas vías de señalización regulan prácticamente todos los aspectos de la conducta maligna celular, la proliferación, la supervivencia, la migración y la invasión [24]. Nuestros resultados mostraron que UP activa P38, ERK y JNK notablemente. Los inhibidores selectivos de p38 y JNK en lugar de inhibidor de ERK, evita que las células de cáncer de P388 de la citotoxicidad inducida por UP. Estos resultados indican que la apoptosis inducida por UP está relacionada con la activación de p38 y JNK, que es diferente de PG por que sólo la fosforilación de p38 implica en su actividad.

ROS se genera intracelularmente como subproductos del metabolismo aeróbico normal o como segundos mensajeros en diversos caminos de transducción de señal o en respuesta al estrés ambiental [25], [26]. Como segundos mensajeros específicos en cascadas implicados en la proliferación y la diferenciación celular, ROS ha sido implicado en la regulación de diversas funciones celulares incluyendo la señalización intracelular de activación transcripcional, la proliferación y la apoptosis [27]. En los últimos años, muchos investigación se centran en la relación entre ROS y la proteína quinasa activada por mitógeno-MA
PK
vías de señalización. Ling Liu et al informaron de que la apoptosis inducida-NG de células HepG2 era característica de la generación de ROS intracelular. Simultáneamente NG tratamiento podría llevar a la activación de la fosforilación de JNK y p38, pero no ERK1 /2. Nuestros datos demostraron que UP indujo la producción de ROS intracelular en células P388. Sin embargo, un eliminador de ROS NAC no pudo revertir la inhibición de la proliferación causada por UP, aunque, obviamente, antagoniza la producción de ROS por H
2O
2. Estos resultados indican que la generación de ROS no está implicado en la apoptosis inducida por UP
.
El pHi en orgánulos ácidos son responsables de una amplia variedad de importantes funciones celulares, tales como endocitosis, exocitosis y el tráfico intracelular, así como la diferenciación celular, el crecimiento celular y la muerte celular. El pHi en células transformadas o cancerosas generalmente permanece neutral o incluso ligeramente más alcalino que las células normales [28], regulada por una variedad de mecanismos homeostáticos Phi, incluyendo Na
+ /H
+, Na
+ - Cl dependientes e independientes
- /HCO
3
- intercambiadores, tipo vacuolar H
+ - ATPasa (V-ATPasa) y otros. informó Daigo Ya mamoto que la acidificación intracelular de KPL-1 por la apoptosis inducida y el ciclo de detención tratamiento cPrG.HCl, que fue fuertemente suprimida por imidazol, una base de células permeable. Se ha demostrado que bafilomicina A1, un potente inhibidor selectivo de vacuolar H
+ - ATPasa [29] también induce una disminución en el pH intracelular e inhibe el crecimiento de diferentes líneas de células de cáncer [30]. También hemos encontrado que hasta podría disminuir intracelular pHi detectada por confocal y citometría de flujo, respectivamente. Sin embargo, imidazol, un inhibidor de la acidificación no para rescatar a la inhibición del crecimiento de UP. Estos resultados descartan la posibilidad de que la acidificación en la apoptosis inducida por la UP.

Aprovechando su función autofluorescencia, nos dimos cuenta de que la UP se distribuye principalmente en el citoplasma. Se aislaron aún más las proteínas de unión a la UP en gel PAGE nativa y se sometió a análisis de espectrometría de masas. 171 proteínas a partir de 951 proteínas detectables se relacionan-ribosoma, lo que sugiere que probablemente UP se puede unir a ribosoma. Hemos validado la hipótesis mediante el método de fraccionamiento en gradiente de densidad de sacarosa, un enfoque convencional para aislar y estudiar ribosoma y por tinción de inmunofluorescencia para observar colocalización de UP y ribosomas en las células P388 y A549. ribosomal proteínas desempeñan múltiples funciones en la coordinación de la biosíntesis de proteínas para mantener la homeostasis celular y la supervivencia. La evidencia reciente sugiere que una serie de proteínas ribosómicas tienen funciones secundarias independientes de su participación en la biosíntesis de proteínas. Estas proteínas funcionan como reguladores de la proliferación celular y en algunos casos como inductores de la muerte celular [31], [32]. Johnson CR encontró que la interferencia con 28S-rRNA por BCS inicia la apoptosis en células REH a través del reclutamiento de SAPK-JNK señalización [33]. Bae HK SG informó que interactuaba específicamente con 40S y 60S ribosomal subunidades ya en 5 min en las células RAW 264.7 y se indujo la fosforilación de p38 y JNK [16]. Teniendo en cuenta que la UP podría inducir a las células P388 apoptosis que implica la activación de p38 y JNK en nuestro estudio anterior, se especula que la apoptosis de las inducida por UP puede estar relacionado con UP-unión al ribosoma, que a su vez afecta a la función de algunas proteínas del ribosoma y conduce a apoptosis. También ha merecido la pena mencionar que sólo dos de las mitocondrias se detectaron proteínas mediante espectrometría de masas con coverprecent de la proteína. & Lt; 10%, lo que excluye en gran medida la posibilidad de apuntar directamente a las proteínas mitocondriales en hasta

En resumen, nuestros resultados presentan en este estudio no incluyen la participación de ROS y la acidificación en la apoptosis inducida UP, a pesar de enormes literaturas. Nuestros datos sugieren que en lugar UP se une al ribosoma, que puede, al menos parcialmente, activar el P38, la señalización de JNK y la apoptosis vía mitocondrial, que finalmente llevan a la inhibición de las células proliferation.The dirigida moléculas ribosomales necesita ser más estudiado. Sin embargo, ribosoma podría abrir una nueva vía para explorar el mecanismo contra el cáncer de PGs en el futuro.

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