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PLOS ONE: Utilización de los cuantitativa in vivo Farmacología modelos para evaluar la combinación de efectos de everolimus y irinotecan en xenoinjertos de ratón Modelos de Cancer

colorrectal
Extracto

Aplicaciones

El AKT vía mTOR PI3K //es desregula con frecuencia en los cánceres y la inhibición de mTOR ha demostrado la capacidad de modular las vías pro-supervivencia. Como tal, hemos tratado de determinar la capacidad del everolimus inhibidor de mTOR para potenciar los efectos antitumorales de irinotecan en el cáncer colorrectal (CCR).

Diseño Experimental

Los efectos combinatorios de everolimus e irinotecán eran evaluado

e in vitro
in vivo
en líneas celulares de CRC que albergan mutaciones que se encuentran comúnmente en
PIK3CA
,
KRAS
y /o
BRAF
. Farmacocinético dirigida protocolos de dosis de everolimus e irinotecan se establecieron y se utiliza para evaluar los efectos antitumorales in vivo de los agentes. Al final del tratamiento, 3-6 tumores por grupo de tratamiento se recogieron para el análisis de biomarcadores de la metabolómica RMN.

Resultados

El everolimus e irinotecan /SN38 demostraron efectos antiproliferativos sinérgicos en múltiples células CRC líneas
in vitro
. Efectos de la combinación de everolimus e irinotecan se determinaron en modelos de xenoinjertos CRC utilizando protocolos de dosis clínicamente relevantes. Everolimus demostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral solo y cuando se combina con irinotecan en HT29 y xenoinjertos tumorales HCT116. análisis metabolómico mostró que los tumores HT29 fueron metabólicamente más sensible que los tumores HCT116. Everolimus causó una disminución en la glucólisis en ambos tipos de tumores, mientras que el tratamiento con irinotecan como resultado una profunda acumulación de lípidos en los tumores HT29 que indica un efecto citotóxico.

Conclusiones

El análisis cuantitativo del crecimiento tumoral y de datos metabolómicos mostró que la combinación de everolimus e irinotecán era más beneficioso en el
BRAF /PIK3CA
xenoinjertos tumorales HT29 mutantes, que tuvieron un efecto aditivo, que los
KRAS /PIK3CA
xenoinjertos de tumores HCT116 mutantes, que había menos de un efecto aditivo

Visto:. Bradshaw-EL Pierce, Pitts TM, Kulikowski G, H Selby, Merz aL, DL Gustafson, et al. (2013) Utilización de los cuantitativa in vivo Farmacología Métodos para evaluar los efectos de la combinación de everolimus y irinotecan en modelos de ratón con xenoinjerto de cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (3): e58089. doi: 10.1371 /journal.pone.0058089

Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América

Recibido: Septiembre 4, 2012; Aceptado: 31 Enero 2013; Publicado: 8 Marzo 2013

Derechos de Autor © 2013 Bradshaw-Pierce et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por Novartis International AG y Universidad de Colorado Cancer Center de Grant P30 CA046934. Novartis tenía alguna entrada en el diseño del estudio, pero no jugó un papel en el análisis de la recopilación de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. He leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos . A parte del coste de los estudios fue proporcionado por Novartis. Novartis también proporcionó toda everolimus para los estudios. Esto no altera nuestra adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

Hay actualmente enfoque significativo en el desarrollo de nuevos agentes diseñados para perturbar las vías de transducción de señales importantes en la progresión del cáncer. El uso clínico de estos agentes dirigidos molecularmente implica con frecuencia combinaciones con otras modalidades terapéuticas y varios estudios clínicos han demostrado el beneficio de la adición de moduladores de transducción de señal (STM) a la quimioterapia o la radiación [1] - [5]. El desarrollo exitoso de las terapias con medicamentos y estrategias de tratamiento requiere el uso reflexivo de los modelos preclínicos y una cuidadosa interpretación de los datos.

El uso de enfoques cuantitativos, incluyendo el uso de los datos farmacocinéticos y medidas cuantitativas de la respuesta, es fundamental para dilucidar mecanismos de acción y mejorar la investigación farmacológica de traducción [6]. Una deficiencia común de los
in vivo
estudios de farmacología es el uso de dosis y /u horarios que no son clínicamente factible que puede conducir a resultados engañosos de la eficacia y /o el desarrollo de biomarcadores que a menudo no se traducen en la clínica ajuste. Aquí presentamos un estudio en el que se determinó cuantitativamente el beneficio de la adición de una pequeña STM molécula, everolimus (Novartis, East Hanover, Nueva Jersey), a la quimioterapia estándar, irinotecan (Pfizer Inc., Nueva York, Nueva York), el uso de dosis y horarios en nuestra preclínica modelos predijeron para producir la exposición a medicamentos que se aproximan a los observados en pacientes

el everolimus (40-
O CD - (2-hidroxietil) rapamicina, RAD001 /Afinitor®). es un inhibidor biodisponible por vía oral de la mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR), que está actualmente aprobado para el tratamiento del carcinoma avanzado de células renales y tumores neuroendocrinos progresivos de origen pancreático (PNET) [7], [8]. mTOR, una serina /treonina quinasa, es un regulador central de las vías de que la señal de crecimiento, la proliferación, la supervivencia, el metabolismo y la angiogénesis [7], [9]. actividad mTOR es mediada por el factor de crecimiento de señalización, los nutrientes y los estados de energía así como el estrés hipóxico. Además, mTOR desempeña un papel clave en la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) vía /AKT que con frecuencia se dysregulated e implicado en el crecimiento y la progresión en varios tipos de cáncer, lo que es una diana terapéutica atractiva [10], [11]. Estudios recientes sugieren que las mutaciones PIK3CA o actividad AKT confieren sensibilidad a la terapia mTOR [12] - [15].
PIK3CA
es el gen que codifica la subunidad catalítica de PI3K de p110 y las mutaciones (exón 9 y el exón 20) se puede encontrar en el 10-30% de CRC [11], [16], [17].

CRC es el tercer tipo de cáncer más común, representa casi el 10% de todas las muertes relacionadas con el cáncer en los EE.UU. [18]. Si bien las primeras etapas CRC tiene una tasa de supervivencia a 5 años favorables, la enfermedad en etapa tardía con metástasis a distancia tiene una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo el 10%, lo que indica la necesidad de mejorar los regímenes de tratamiento del CCR metastásico (CCRm). Irinotecan (Camptosar®) es un estándar de agente de atención quimioterapéutico usado para el tratamiento de cáncer colorrectal metastásico. La hipótesis de que el everolimus mejoraría tratamiento con irinotecán debido a la modulación de los efectores sobre las vías pro-supervivencia y tuvo como objetivo evaluar la combinación de modelos de xenoinjertos de ratón de CRC que alberga el difícil tratamiento concurrente
PIK3CA
y
KRAS
o
BRAF
mutaciones. Además, debido a los efectos metabólicos conocidos de la inhibición vía mTOR, se evaluó cuantitativamente los perfiles metabólicos de los tumores tratados con dosis clínicamente relevantes de la espectroscopia de everolimus y irinotecan por resonancia magnética nuclear (NMR).

Materiales y Métodos

Productos químicos y Reactivos

el irinotecan para
in vivo
estudios se obtuvo de la Universidad de Colorado Farmacia Hospitalaria (Aurora, CO) y SN38 para
in vitro
Los estudios se adquirió de laboratorios de LKT (St. Paul, MN). Everolimus se ofrece como una suspensión por Novartis. SN38 soluciones madre de
in vitro
experimentos se hicieron en DMSO (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Todos los demás materiales utilizados fueron adquiridos de cualquiera de Fisher Scientific o Sigma (St. Louis, MO) a menos que se especifique lo contrario.

Cell Cultura y
líneas de células tumorales de colon, HCT8, HT29, LS180 y HCT116, eran comprado de la American Type Culture Collection, (Manassas, VA), y se mantuvieron en placas de cultivo de tejido (BD Falcon, San Jose, CA) en medio RPMI (Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco) y penicilina (100 unidades /ml) -streptomycin (100 mg /ml; Life Technologies). Las células fueron rutinariamente para detectar mycoplsma usando MycoAlert (Lonza). Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2. Todos los
in vitro
tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo en el uso de medio de crecimiento completo.

La citotoxicidad y la combinación de efectos

efectos citotóxicos se determinaron utilizando el ensayo de sulforodamina B (SRB). Brevemente, 5000 células viables se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche antes de la exposición con diferentes concentraciones de fármacos. Las células fueron expuestas a concentraciones crecientes de everolimus (0-200 nM), SN38 (0-8 nM), y combinaciones de los dos. Tras una incubación de 72 horas, se retiró de los medios y las células se fijaron con ácido tricloroacético al 10% frío durante 30 minutos a 4 ° C. Las células se lavaron con agua y se tiñeron con 0,4% SRB durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo con 1% de ácido acético y la mancha se solubilizó con Tris 10 mM a temperatura ambiente y se leyó a una DO de 565 nm. Los resultados del tratamiento combinado se analizaron de acuerdo con el método isobolográfico de Chou y Talalay, utilizando el programa de software Calcusyn (Biosoft, Cambride, UK). La combinación resultante Index (CI) se utilizó como una medida cuantitativa del grado de interacción entre diferentes fármacos. Un valor de CI igual a 1 indica aditividad; CI mayor que 1, el antagonismo; CI de menos de 1, sinergismo.

Immunoblotting

Las células se sembraron en placas de 6 pocillos 24 horas antes del tratamiento con cada fármaco solo o en combinación durante 24 horas. Las células se raspó en inhibidores de la proteasa que contienen tampón RIPA, EDTA, NaF, y ortovanadato de sodio. La proteína total se determinó utilizando el ensayo Pierce 660 nm Protein (Pierce, Rockford, IL). Treinta microgramos de proteína total se cargaron en un gel de gradiente 4 a 12%, a electroforesis y se transfirieron a nitrocelulosa usando el sistema de iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las membranas se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con Licor tampón de bloqueo (Licor, Lincoln, NE) antes de la incubación durante la noche a 4 ° C con uno de los siguientes anticuerpos: pS6RP, tS6RP, pAKT, Takt, Perk, TERK, p21, PARP , actina y α-tubulina (Señalización celular, Beverly, MA). Todos los anticuerpos se utilizaron a una dilución 1:1000 excepción de pERK, que fue utilizado en 1:2000. Después de la incubación del anticuerpo primario, las transferencias se lavaron en TBS-Tween (0,1%), después se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado en 1:15,000 (Licor, Lincoln, NE) durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales, las transferencias se desarrollaron usando el Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE).

Animales

ratones desnudos atímicos hembra, de 5 a 10 semanas de edad, fueron adquiridos de la Nacional del Cáncer Instituto. Los animales fueron alojados 3-5 por jaula en jaulas de policarbonato y se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz /oscuridad. Los alimentos y el agua se les dio
ad libitum
. Todos los estudios fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) y llevado a cabo de acuerdo con las directrices del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y los animales fueron alojados en un centro acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care .

Para los estudios de portadores de tumores, se recogieron las células y se resuspendió en una mezcla 01:01 de RPMI libre de suero y Matrigel (BD Bioscience). Un millón de células se inyectaron subcutáneamente en cada flanco trasero de ratones. Los volúmenes del tumor, medido por calibradores digitales, fueron calculadas por
V gratis (mm
3) = longitud x (anchura)
2 x 0.5236.

Estudio farmacocinético

Un estudio de farmacocinética de everolimus se llevó a cabo en ratones portadores de tumores HT29 (volumen promedio de ~ 300 mm
3). Los ratones fueron tratados con 2,5 o 10 mg /kg everolimus al día durante 7 días por sonda oral. Tres ratones por nivel de dosis se sacrificaron por desangrado palo cardíaca a los 30 minutos, 2, 4, 6 y 24 horas después de la administración del fármaco en el día 7. El plasma y el tejido tumoral se congelaron en N líquido
2 y se almacena a -70 ° C hasta el análisis.

Everolimus se midió en el plasma y los tumores por el ensayo LC /MS /MS. estándares analíticos, control de calidad (QC) e incógnitas se preparan todas por la adición de 200 l de plasma en blanco desconocido o pinchos o homogeneizado de tumor (100 mg /ml en agua) muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Las muestras se extrajeron por la adición de 1 ml de metil terc-butil éter (MTBE) seguido de 10 min utilizando un mezclador vortex. Las muestras se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se recogieron y 900 l transfirieron a un tubo de ensayo de vidrio limpio. Las muestras se evaporaron a sequedad usando un evaporador rotatorio seguido de la resuspensión en 100 l de 50% de acetonitrilo /50% acetato de amonio 10 mM y se transfirieron a viales de muestreador automático para su análisis. se obtuvo espectros de masas de muestras extraídas en un 3200 Q-TRAP espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Sciex MDS (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) con una fuente de turbo ionspray interfaz con un sistema de bomba binaria Serie SL HPLC Agilent 1200 (Santa Clara , CA) .Los límites inferior y superior de cuantificación para el ensayo era 1 nM y 5000, respectivamente. La exactitud y precisión (% RSD) basado en el análisis de las normas y las muestras de QC para este ensayo fueron del 90,7% y del 5,5% para el plasma y el 93,0% y el 4,2% para el tumor. Detalles adicionales se pueden encontrar en el suplemento S1 (sección SA.1.).

Estudio Terapéutico

Cuando los tumores HT29 y HCT116 alcanzaron un volumen promedio de ~325 mm
3 animales fueron asignados al azar en cuatro grupos de tratamiento (n = 9 a 10 ratones por grupo): (i) vehículos, (ii) 5 mg /kg everolimus (RAD) por sonda oral (PO) al día, (iii) 10 mg /kg de irinotecan (IRI) una vez por semana por vía intravenosa (iv) la inyección en vena de cola, y (iv) una combinación de RAD y IRI. Everolimus, se diluyó en agua estéril, y irinotecan, se diluye en solución salina estéril al 0,9%, se administraron a 4 ml /kg. Los animales fueron tratados durante 28 días. volúmenes de los tumores y los pesos corporales se midieron 2-3 veces a la semana. En el día 28 del ciclo 3-6 animales por grupo fueron sacrificados, aproximadamente 24 horas después del tratamiento con everolimus, y los tumores cosechadas para el análisis metabolómica.

RMN basados ​​en metabolómica

Para el análisis metabolómica, los animales se en ayunas durante 4 horas y luego recibieron 250 mg /kg de glucosa [1-
13C] (Cambridge isótopos, Cambridge, MA) mediante inyección IV 60 minutos antes de la recolección tumor. muestras de tumor Snap-congeladas se sometieron a un procedimiento de extracción de ácido de dos fases (utilizando ácido perclórico 8%) previamente establecido y ampliamente publicado [19] - [22]. Más detalles se pueden también encontrar en el suplemento S1 (sección SA.2.).

Análisis de Datos

plasma y los parámetros farmacocinéticos tumorales se calcularon mediante análisis no compartimental con WinNonlin. los datos de plasma de everolimus se ajustaron a un modelo bicompartimental con absorción de primer orden y las simulaciones de las concentraciones plasmáticas en una dosis de 5 mg /kg de everolimus se realizaron por SAAM II versión 2.1 (El Epsilon Group, Charlottesville, VA /Universidad de Washington) .

una forma de análisis de ANOVA se utilizó con un post-test de Tukey para determinar la significación estadística entre varios grupos. Los análisis se realizaron con Prism versión 4.02.
Los valores P Restaurant & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los conjuntos de datos metabolómicos cuantitativos fueron incluidos en los mapas de calor metabólico hecha a la medida metabólica flujos analizadores e interfaces de datos y se presenta como [23].

Los datos del estudio in vivo fue el modelo para evaluar el beneficio terapéutico de la adición de everolimus a irinotecan. El modelo utilizado era similar a un modelo publicado previamente para la evaluación de la terapia de combinación [24]. Algunas modificaciones fueron hechas y detalles del modelo se pueden encontrar en el suplemento S1 (sección SA.3.) Y del suplemento S2. Todo el modelado se realizó sobre los datos del volumen tumoral en animales individuales y modelada con SAAM II versión 2.1.

Resultados

Actividad in vitro

Los efectos sinérgicos de everolimus (RAD) y SN38 fueron evaluados en líneas celulares de CRC, HT29 (
BRAF
MT;
PIK3CA
MT; p53 MT), HCT116 (
KRAS
MT,
PIK3CA
MT ), HCT8 (
KRAS
MT) y LS180 (
KRAS
MT;
PIK3CA
MT). Para todos los
in vitro
experimentos SN38 se utilizó en lugar de irinotecan desde SN38 es el metabolito activo de irinotecan. células HT29 fueron las más sensibles a la SN38 y everolimus y la adición de everolimus a SN38 generalmente proporciona un efecto fuertemente sinérgico en HT29, HCT8 y células HCT116 con valores de CI que van desde & lt; 0,1 a 0,7 (Figura 1). La adición de everolimus para el tratamiento SN38 en las células LS180 fue menos claro como valores de CI variaron ampliamente de 0,3-1,4. Western blot análisis muestran que a concentraciones bajas, everolimus (20 nM) es capaz de inhibir ribosomal fosfo-S6 quinasa (pS6RP) en todas las líneas celulares y SN38 (4 nM) causa un aumento de p21 en las células HCT116 y HCT8 (Figura 2) . Sin p21 era medible en células HT29 a dosis de everolimus usado e irinotecán. Una pequeña cantidad de PARP escindido (MW 89) se observó en SN38 tratada HCT8 células, pero no en HT29 o HCT116.

Los efectos anti-proliferativos combinatorias se evaluaron en HT29, HCT116, HCT8 y células LS180 para evaluar aditivo potencial de interacciones sinérgicas. La inhibición del crecimiento se midió mediante el ensayo de sulforhodmine B (SRB) después de una incubación de 72 horas con SN38 (0, 2, 4 o 8 nM) y RAD (0, 2, 20 o 200 nM - indicada por las triangels bajo los gráficos). Los datos en los gráficos representa la media ± la desviación estándar de al menos 3 experimentos separados. El índice de combinación valores (IC) se calcularon para todas las combinaciones y los valores ± la desviación estándar se presentan en las tablas de colores debajo de cada gráfico .. El CV% para repeticiones osciló entre 5-40% y un promedio de ~ 20%, por lo tanto, nos determinado que los valores de CI & gt; 1,2 son considerados antagónicos, 1,2 & gt; CI & gt; 0,8 son aditivos, y CI & lt; 0,8 son sinérgicos. Tenga en cuenta que se utiliza en SN38
in vitro
ensayos en lugar de irinotecán ya que es el metabolito activo.

Akt, p-Akt, PARP, PARP escindida, ribosomal S6 quinasa total de ( S6), ribosomal fosfo-S6 quinasa (PS6), ERK, p-ERK, p21 y α-tubulina se midieron en todas las líneas después de 24 horas de tratamiento con RAD (20 nM), SN38 (4 nM) o la combinación de la dos. Los pesos moleculares se presentan junto al nombre de la proteína entre paréntesis. Tenga en cuenta que se utiliza en SN38
in vitro
ensayos en lugar de irinotecán ya que es el metabolito activo.

farmacocinético-Directed Dosificación de everolimus y irinotecan

En
in vivo
estudios, establecimos dosis de everolimus e irinotecán para administrar a los ratones que producirían exposiciones en o por debajo de los niveles clínicamente alcanzables. información farmacocinética humana de everolimus [25], [26] e irinotecan /SN38 [27] - [30]. fue obtenida de las publicaciones y se presenta en las Tablas 1 y 2 respectivamente

para determinar la dosis apropiada de everolimus en ratones, se realizó un estudio de farmacocinética de everolimus en ratones portadores de tumores HT29. perfiles de plasma y el tumor de concentración-tiempo en estado estacionario se presentan en las Figuras Suplemento S3 SC.2. A & amp; B y los parámetros farmacocinéticos no compartimentales presentan en la Tabla 1 y la Tabla C.1 en S3 Suplemento. Los datos mostraron que una dosis de 10 mg /kg en ratones resulta en la exposición de plasma libre en estado estacionario (AUC
ss, libre = 116 ng * h /ml), que está en el intervalo de la observada en humanos a la clínicamente el uso de dosis de 5 a 10 mg /kg por día (AUC
ss, libre = 60 a 178 ng * h /ml). los valores de unión a proteínas de plasma de 99% y 75% se utilizaron para calcular las concentraciones en plasma libres en ratones y seres humanos, respectivamente [31], [32]. Sin embargo, para los estudios de eficacia in vivo, se optó por utilizar una dosis de 5 mg /kg (AUC
ss, libre = 37 ng * h /ml) teniendo cuidado de lograr el exceso de actividad como agente único, que podría hacer difícil evaluar los efectos de combinación. Los estudios previos de everolimus en ratones portadores de xenoinjertos de tumores HCT116 demostraron actividad como fármaco único (inhibición del crecimiento tumoral 45-55%) de everolimus a 10-12 mg /kg [33], [34].


En se evaluó datos vivo
SN38 para definir la dosis de irinotecán que se utilizará, ya que es el metabolito activo de irinotecan conversión y la carboxilesterasa de irinotecan a SN38 varía entre ratones y seres humanos. En base a los datos farmacocinéticos humanos y de ratón obtenidos de datos de la literatura [27] - [30], [35] - [40], se seleccionó una dosis de 10 mg /kg de irinotecan se administra por vía intravenosa una vez por semana (Tabla 2). Una dosis /kg iv de 10 mg fue estimado para producir una exposición libre de SN38 en el rango de la observada en los seres humanos (los ratones: AUC
libre = 7,5 a 25,8 ng * h /ml; los seres humanos: AUC
libre = 4,4 a 18,6 ng * h /ml para la dosis que varían entre 125-350 mg /m
2). Los valores de unión a proteínas plasmáticas SN38 de 96,6 a 98,6% para los ratones y el 98% para los seres humanos se utilizaron para calcular la fracción libre de las concentraciones totales [37].

xenoinjertos de tumores Respuesta a everolimus y el tratamiento con irinotecán

la eficacia de everolimus, irinotecán y combinación de los dos se determinó en HT29 y tumorales HCT116 xenoinjertos. La Figura 3A muestra los perfiles de crecimiento de tumores de todos los grupos de tratamiento para ambos tipos de tumores. Everolimus causada similar y estadísticamente significativa (p & lt; 0,05 vs. control) de inhibición del crecimiento en tanto HT29 (inhibición del crecimiento tumoral promedio, TGI = 40%) y HCT116 (promedio TGI = 44%) tumores mientras que irinotecan causaron la inhibición del crecimiento significativa en sólo HT29 tumores (promedio TGI = 39%; p & lt; 0,05). La adición de everolimus al irinotecan redujo significativamente el volumen de HT29 (promedio TGI = 64%) y HCT116 (promedio TGI = 61%) xenoinjertos de tumores (P & lt; 0,05 frente a control).

(A) HT29 y HCT116 curvas de crecimiento de xenoinjertos tumorales. Los animales fueron tratados durante 28 días con vehículos, RAD, IRI, o la combinación de RAD + IRI. Los datos representan la media ± SEM de 9-12 tumores por grupo.
* P & lt; 0,05 frente al vehículo. (B) de modelado farmacocinético-farmacodinámico se realizó en evaluar cuantitativamente la intensidad de la combinación RAD + IRI en HT29 y tumorales HCT116 xenoinjertos. Esta es una representación gráfica del término de interacción (ψ) para la combinación RAD + IRI. Cada barra representa el valor ψ para un tumor individual. Psi valores & gt; 1.3 son sinérgicos, 1,3 & gt; ψ & gt; 0,7 son aditivos, 0,7 & gt; ψ & gt; 0 son menos que aditivo, y ψ & lt; 0 son antagónicos

Modelado de los perfiles de crecimiento tumoral y el efecto del tratamiento reveló que la combinación de everolimus y irinotecan estaba en aditivo medio (ψ promedio =. 0.9) en los tumores HT29 (Figura 3B). Cada tumor se modeló de forma individual y de los 10 tumores HT29, 1 mostró una respuesta sinérgica, 8 mostraron una respuesta aditiva y 1 fue menos que aditivo, pero no antagónicos. ψ representa el término utilizado en el modelo matemático para describir el efecto combinatorio, donde ψ & gt; 1.3 es sinérgica; 1,3 & gt; ψ & gt; 0,7 representa una interacción aditiva, 0,7 & gt; ψ & gt; 0 es un menos de un efecto aditivo y ψ & lt; 0 es antagónica. Los detalles de los datos individuales del tumor y los ajustes de modelado y se pueden encontrar en el Suplemento S1, la sección SA.3., Y del suplemento S2. Los perfiles de crecimiento de los xenoinjertos HCT116 fueron mucho más variables que los tumores HT29. Por lo tanto, aunque la inhibición media de crecimiento del tumor del tratamiento de combinación es similar en los dos tipos de tumores (TGI = 64% frente a 61%), en tumores HCT116 el beneficio fue, en promedio, menos de aditivo (ψ media = 0,5). Una vez más, cada perfil de crecimiento del tumor se modeló individualmente y 3 tumores mostró un efecto aditivo, 5 eran menos de aditivo y 2 eran antagonistas.

Se midieron los efectos de everolimus, irinotecan y la combinación de los dos en el metabolismo del tumor en un subconjunto de animales al final del estudio. perfiles metabólicos se determinaron mediante
1H,
13C y
31P- RMN. La figura 4 muestra de calor mapas metabólicos para representar cambios metabólicos entre los grupos de tratamiento en relación con el grupo control en HT29 y HCT116 xenoinjertos. Los efectos de everolimus en el metabolismo de la glucosa, lactato y disminuyen en la glucólisis, fueron similares en los tumores HT29 y HCT116, en consonancia con la respuesta de crecimiento del tumor observada en los dos tipos de tumores. tumores HT29 mostraron una respuesta más profunda al tratamiento con irinotecán, que se relaciona principalmente con la acumulación de lípidos, especialmente poli-insaturados y fosfolípidos, que puede estar relacionado con aumento de la degradación celular y necrosis. Una vez más, esto es consistente con los perfiles de crecimiento de tumor HT29 y tumores HCT116 que mostraron que HT29 tumores respondieron al tratamiento con irinotecán mientras que los tumores HCT116 no lo hicieron. La combinación de everolimus con irinotecan se asoció con un aumento de la acumulación de lípidos, degradación de la membrana (aumento de la GPC y la disminución de PC /GPC) y en cierto grado disminuyó la glucólisis en los tumores HT29. La misma respuesta no se observó en tumores HCT116, a pesar de la inhibición media del crecimiento tumoral del tratamiento de combinación produciendo más o menos el mismo resultado. En general, los tumores HT29 eran metabólicamente más sensible a todo tratamiento de tumores HCT116.


1H,
13C, y los datos
31P-RMN se representan como media ± SEM de 3- 6 mediciones. Los metabolitos, sus relaciones y flujos metabólicos se agruparon en función de su relevancia bioquímica. Para el grupo de control, todos los niveles de metabolitos intracelulares se dan como mol por gramo de células de peso húmedo y los ratios de metabolitos son sin unidades. Las vías metabólicas que fueron alterados por las de tratamiento se presentan como mapas de color amarillo. Una disminución en el metabolismo de punto final se indica por el rojo, mientras que un aumento de los puntos verdes. La significación estadística de los cambios de metabolitos se basa en el análisis multivariante de los flujos metabólicos con p & lt; 0,02. La base de datos de perfil de la matriz metabólica interactiva fue basada en la costumbre [23].

Discusión

El desarrollo de nuevas terapias y estrategias terapéuticas requiere el uso de modelos preclínicos. Con frecuencia, la impresionante actividad preclínica de nuevos agentes prometedores y combinaciones de agentes no se traduce en tratamientos clínicos viables. diseño del estudio racional con puntos finales cuantitativos es crítico para la traducción eficaz de las estrategias y los biomarcadores de eficacia [6] de combinación, [41]. El objetivo general del estudio descrito en este documento es establecer cuantitativamente el efecto de la terapia combinatoria everolimus e irinotecán en modelos murinos de CRC, la acogida difíciles de tratar genotipos, la utilización de regímenes de dosificación farmacocinéticos guiada. Basado en información farmacocinético humano y de ratón, establecimos dosis de everolimus y irinotecan a utilizar en
in vivo
estudios preclínicos que producen las exposiciones en el rango de los observados en los seres humanos. Es importante señalar que hemos corregido las concentraciones totales de las fracciones libres o no ligados al hacer comparaciones de los datos farmacocinéticos entre los ratones y los seres humanos. Esto es fundamental, ya que la unión a proteínas plasmáticas a menudo varía entre las especies y, en teoría, solamente la fracción libre de la droga está disponible para la interacción con la diana de interés.

Hemos probado el everolimus y la combinación de irinotecán
in vivo
en dos modelos de xenoinjertos línea celular de CRC, HT29 y HCT116. La combinación fue bien tolerada como cambios significativos del peso del cuerpo no se observaron (Suplemento S3 Figura SC.2.). Evaluación de la final de los datos tumor estudio de cada tipo de tumor muestra que el tratamiento con el plomo y everolimus irinotecán a una inhibición estadísticamente significativa del crecimiento tumoral y el grado de respuesta parece similar en los dos tipos. Sin embargo, aquí se muestra que mediante la evaluación de perfil de crecimiento de cada tumor, el volumen como una función del tiempo, que son capaces de dilucidar las diferencias en el crecimiento y la respuesta entre los dos tipos de tumores. A través de la modelación matemática del control, y de la combinación de agentes individuales brazos del estudio se pudieron evaluar cuantitativamente la interacción de los dos compuestos y encontraron que en los tumores HT29,
BRAF
y
PIK3CA
mutante, la combinación fue tumores HCT116 y aditivos en,
KRAS
y
PIK3CA
mutante, la combinación fue bastante variable, pero menos que aditivo en promedio. Además de evaluar cuantitativamente el crecimiento del tumor que evaluaron los efectos de los tratamientos sobre el metabolismo del tumor usando metabolómica basada en RMN.

metabólicamente, HT29 xenoinjertos fueron más sensibles que los xenoinjertos HCT116. tumores HT29, pero no tumores HCT116, en el grupo de irinotecan muestran una firma metabólico típico para la terapia citotóxica, la acumulación de lípidos y fosfolípidos, una indicación de citotoxicidad /necrosis [42]. Este resultado es consistente con los perfiles de crecimiento del tumor, lo que demuestra tumores HT29 que responden al tratamiento irinotecan (TGI = 39%, p & lt; 0,05), pero no tumores HCT116 (TGI = 17%). Estos resultados también están de acuerdo con los
in vitro
datos, que muestran las células HT29 (IC50 = 3 nM) son más sensibles que las células HCT116 (IC50 & gt; 300 nm) para el tratamiento SN38. Según nuestras simulaciones (Suplemento S2), las concentraciones libres de SN38 en el plasma variaron de 1300 a 7.25e-4 nM en un período de 24 horas con una concentración media de 4-18 nm, que es muy inferior a la estimada para IC50 HCT116 Células. A pesar de la similitud en los perfiles de inhibición del crecimiento de tumores de everolimus tratada HT29 tumores y tumores HCT116 (TGI = 41% vs 44%, respectivamente), HT29 tumores aparecieron ligeramente más metabólicamente sensibles que los tumores HCT116. Algunos disminución de la glucólisis se midió en ambos tumores HT29 y HCT116, pero un aumento en GPC y algunos acumulación de lípidos también se observó en tumores HT29. In vitro, las células HT29 fueron más sensibles al tratamiento everolimus que las células HCT116, ya que el IC50 para la proliferación fue menor (1,2 nM vs. 25 nM) y se observó una mayor inhibición p-S6RP a 20 nM.
In vivo,
respuestas similares en la inhibición de la p-S6RP y ciclina D1 fueron observados en los tumores HT29 y HCT116 (Suplemento S3 Figura SC3 y SC4); Sin embargo, las medidas de p-S6RP no puede ser una medida útil para evaluar la eficacia. Un estudio publicado anteriormente mostró que el tratamiento everolimus en ambas líneas sensibles y resistentes puede resultar en la desfosforilación total de S6K1 y S6 [33].

Especulamos que algunos de la eficacia de everolimus observado en tumores HCT116 pueden estar relacionados con efectos antiangiogénicos de everolimus. efectos antiangiogénicos de everolimus se ha informado anteriormente [33], [43] y los efectos antiangiogénicos sería mucho más difícil de detectar por la metabolómica todo el tumor, tal como se realizó aquí, ya que la fracción de las células endoteliales en comparación con tejido tumoral total es bastante pequeña. Más pruebas para apoyar esto puede derivar de los datos farmacocinéticos de everolimus. Las concentraciones plasmáticas libres producidos en la dosis de 5 mg /kg en nuestros animales variaron desde 0,2 hasta 6 nM (C
min a C
max) con una concentración libre media (C
ss, avg) de alrededor de 1,5 nM, lo que sería suficiente para inhibir el crecimiento de HT29, pero no HCT116 y, informan de los datos anteriores actividad antiproliferativa potente de everolimus contra VEGF y bFGF estimuló las células endoteliales (HUVEC) con valores de IC50 0,1-0,8 nM [33].

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