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PLOS ONE: VEGFA regula al alza FLJ10540 y modula la migración y la invasión de cáncer de pulmón a través de PI3K /AKT Pathway


Extracto

Antecedentes

adenocarcinoma de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer entre los hombres y las mujeres en el mundo. A pesar de los últimos avances en el diagnóstico y el tratamiento, las tasas de mortalidad con una supervivencia global a los 5 años de sólo el 15%. Esta alta mortalidad se debe probablemente a la metástasis temprana. Aunque se informó de varios marcadores conocidos correlacionados con mal pronóstico /metástasis en pacientes con adenocarcinoma de pulmón mediante inmunohistoquímica, los mecanismos moleculares del desarrollo de adenocarcinoma de pulmón todavía no están claras. Para explorar nuevos marcadores moleculares y sus vías de señalización serán cruciales para ayudar en el tratamiento de pacientes con adenocarcinoma de pulmón.

Metodología /Principales conclusiones

Para identificar nuevos genes de pulmón adenocarcinoma asociada a /metástasis y para aclarar los mecanismos moleculares subyacentes de estos objetivos en la progresión del cáncer de pulmón, hemos creado un sistema de bioinformática que consiste en la integración de tres conjuntos de datos de perfil de expresión génica, incluyendo adenocarcinoma de pulmón por parejas, los tumores metastásicos secundarios frente a los tumores benignos, y una serie de líneas de células invasoras. Entre los nuevos objetivos identificados, FLJ10540 se sobreexpresa en tejidos de cáncer de pulmón y se asocia con la migración celular y la invasión. Además, se empleó dos estrategias de co-expresión para identificar en qué vía FLJ10540 estaba involucrado. Pulmón perfiles de matriz adenocarcinoma y los datos de tinción IHC de microarrays de tejidos mostraron que FLJ10540 y VEGF-A, así como FLJ10540 y muestran correlaciones positivas fosfo-AKT, respectivamente. La estimulación de las células de cáncer de pulmón con resultados VEGF-A en un aumento de la expresión de la proteína FLJ10540 y mejora la formación de complejos con PI3K. El tratamiento con inhibidores de PI3K VEGFR2 y afecta a la migración celular y la invasión mediante la activación de la vía PI3K /AKT. Por otra parte, desmontables de FLJ10540 desestabiliza formación de la P110-α /P85-α- (PI3K) compleja, más el apoyo a la participación de FLJ10540 en la vía VEGF-A /PI3K /AKT.

Conclusiones /Importancia

Este hallazgo preparó el escenario para la prueba adicional de FLJ10540 como una nueva diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de pulmón y puede contribuir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que son capaces de bloquear la vía PI3K /AKT en las células de cáncer de pulmón.

Visto: Chen CH, Lai JM, Chou TY, Chen CY, Su LJ, Lee YC, et al. (2009) VEGFA regula al alza FLJ10540 y modula la migración y la invasión de cáncer de pulmón a través de PI3K /Akt. PLoS ONE 4 (4): E5052. doi: 10.1371 /journal.pone.0005052

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América

Recibido: Diciembre 22, 2008; Aceptado: 12 de febrero de 2009; Publicado: 1 Abril 2009

Derechos de Autor © 2009 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones de la Gung del hospital Chang (CMRPD140211) y NSC (94-2752-B-010-002-PAE) a Chen Kung-Chou, NSC (Programa para el Proyecto de Investigación interdisciplinaria: NSC97-2627-B-010 -011 a Chi-Ying Huang, NSC97-2627-B-030-001 a J.-M. Lai), y NSC97-3112-B-010-025-CC1, el hospital general de Taichung Veteran (TCVGH-957326D), y el Programa para la Promoción de la Excelencia Académica de Universidades (Universidad Nacional Yang Ming) en Chi-Ying Huang y NSC (95-3112-B-075-002 y 96-3112-B-075-001) con Yu-Chung Wu. El Fondo para la Expresión Génica Análisis Core es apoyado por el Programa Nacional de Investigación de Medicina Genómica (NRPGM), Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer entre los hombres y las mujeres en el mundo [1] - [2]. A pesar de los últimos avances en el diagnóstico y el tratamiento, las tasas de mortalidad siguen siendo elevadas, con una supervivencia global a los 5 años de sólo el 15%. La cirugía es la primera opción de tratamiento para el cáncer localizado no microcítico de pulmón de células y proporciona la mejor oportunidad para la curación. Sin embargo, cuando se diagnostica por primera vez, la mayoría de los pacientes que ya tienen la enfermedad avanzada, y sólo el 35% de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) son elegibles para la resección [3]. marcadores moleculares nuevas metas o ayudar en el diagnóstico y el tratamiento serán cruciales para la mejora de la tasa de mortalidad
.
La invasión tumoral y la metástasis son áreas importantes para el estudio a fin de determinar el fenotipo agresivo de los cánceres humanos y son las principales causas de muertes por cáncer [4]. El proceso de la metástasis es muy compleja y se considera un evento tardío en la tumorigénesis, es decir, células proliferan, perder el contacto con las células vecinas, migrar a través de la matriz intersticial, invaden la sangre y los vasos linfáticos, y depositar en los ganglios linfáticos. La migración y la invasión de células parecen ser el resultado de una compleja interacción entre las numerosas familias de proteínas que participan en este proceso. Mecanismos de movimiento de las células son importantes no sólo como parte de los procesos celulares y de desarrollo básicos, sino también en la patogénesis de diversas enfermedades [5]. Para llegar a ser metastásico, las células tumorales deben aumentar la expresión de varios genes de metástasis de promoción. Sin embargo, en el cáncer de pulmón, las moléculas y los mecanismos implicados en la migración celular o la invasión siguen siendo en gran medida desconocido.

producción y secreción de VEGF-A se observa comúnmente en los tumores más agresivos, y la expresión de VEGF-A profundamente influye en el pronóstico de los pacientes de cáncer, incluyendo aquellos con cáncer de pulmón [6] - [8]. VEGF-A es uno de los más potentes estimuladores de la angiogénesis identificado hasta el momento, que afecta a las células endoteliales vasculares de la permeabilidad, la proliferación y la motilidad [7]. Aunque se han propuesto diversas vías de señalización intracelular para mediar en las actividades biológicas de VEGF-A en las células endoteliales, los eventos de señalización implicadas en la migración celular y la invasión en respuesta a VEGF-A estimulación en cáncer de pulmón no se entienden completamente.

FLJ10540 tiene varios nombres, incluyendo CEP55 [9], C10orf3 [10], y URCC6. CEP55 etiquetado con GFP-C se localiza en el centrosoma en células en interfase, a la zona media del huso durante la anafase, y a la mitad del cuerpo durante la citocinesis [9], [11] - [12]. Además, Cdk1, ERK2, y Plk1 cooperan en la fosforilación de CEP55 durante la mitosis, que se requiere para la localización correcta de mitótico CEP55 y su función durante la citocinesis [9]. FLJ10540 se sobreexpresa durante colon humano [10] y carcinoma hepatocelular [13] tumorigénesis, lo que sugiere que puede funcionar como un oncogén en el desarrollo tumoral. Además, que anteriormente mostró que la sobreexpresión de FLJ10540 contribuye a la transformación celular mediante la activación de PI3K /AKT [13]. Sin embargo, se ha realizado ningún análisis a gran escala de la expresión FLJ10540 y su significado clínico patológica y funcional en el cáncer de pulmón humano.

El comportamiento agresivo de las células malignas del cáncer está determinado por una compleja variedad de vías de señalización que regulan las funciones clave , tales como el crecimiento, la supervivencia, la migración y la invasión. La vía de señalización PI3K /AKT está ligado causalmente a los cuatro de estas respuestas. [14] - [17]. Otra prueba de la importancia de la señalización en el cáncer de PI3K /AKT proviene de estudios que han detectado la sobreexpresión y la hiperactivación de PI3K /AKT en una amplia gama de tumores humanos, incluyendo el cáncer de pulmón, y esto a menudo está vinculada con mal pronóstico [18]. La acumulación de pruebas de los informes anteriores sugiere un posible papel de PI3K /AKT en la migración y la invasión de diversos tipos de células, incluyendo el cáncer de pulmón [19], cáncer de hígado [20], cáncer de mama [21], y cáncer de páncreas [22].

en este estudio, mostramos que FLJ10540 se sobreexpresa en el adenocarcinoma de pulmón y que la expresión ectópica de FLJ10540 promueve la migración celular y la invasión. En las muestras de adenocarcinoma de pulmón humano, FLJ10540 correlacionó positivamente con VEGF-A expresión, como se determina por perfiles de expresión génica y la tinción IHC de micromatrices de tejido. Además, la estimulación con VEGF-A resultó en un aumento de la expresión de la proteína FLJ10540 en una forma dependiente de la dosis en CL
1-0 células de cáncer de pulmón. Además, FLJ10540 transloca parcialmente desde el citoplasma a la membrana plasmática y aumenta la formación de complejos con PI3K bajo VEGF-A estimulación. Finalmente, el VEGF-A afecta a la migración celular y la invasión mediante la activación de la vía de FLJ10540 /PI3K /AKT. Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión FLJ10540 se asocia con un mayor potencial metastásico y puede servir como una posible nueva diana terapéutica para el adenocarcinoma de pulmón.

Resultados

La expresión elevada FLJ10540 en adenocarcinomas de pulmón y cáncer de pulmón de células invasoras líneas

Un reto importante en la era post-genómica es determinar cómo dar prioridad a los objetivos expresados ​​diferencialmente y mal caracterizado en estudios de microarrays de perfiles relacionados con el cáncer. Aquí, hemos creado una plataforma bioinformática mediante la integración de tres diferentes conjuntos de datos de microarrays para revelar los principales reguladores implicados en la metástasis de cáncer de pulmón. La Figura 1 muestra los enfoques de integración de datos esquemáticos y los datos de expresión FLJ10540 en diferentes categorías. En primer lugar, las muestras de 26 pacientes con adenocarcinoma de pulmón, confirmada por histopatología, fueron sometidos a Affymetrix microarrays de perfiles. Sobre la base de las 26 muestras de adenocarcinoma de pulmón primarios, 826 de cada 22.283 transcritos expresados ​​diferencialmente entre las zonas no tumorales y tumores adyacentes se agruparon por la prueba de los rangos con signos de Wilcoxon (
p Hotel & lt; 0,01), basado en dos aspectos diferencias y probado usando el falso descubrimiento tasa de correlación Benjamini y Hochberg (
p Hotel & lt; 0,01). Estos retratos moleculares, que contienen 192 hasta reguladas y 634 transcripciones-regulado, podían distinguir con éxito las zonas no tumorales y tumores adyacentes de los pacientes por la agrupación jerárquica (Figura S1 A). En segundo lugar, se utilizaron los datos de microarrays de acceso público (descargados de GEO) para adquirir diferentes conjuntos de datos de microarrays, que se normalizaron cuantil normalización se usa R para establecer una plataforma potencial metastásico identificación de biomarcadores. Se compararon 225 tumores secundarios metastásico (incluyendo 20 metástasis tumorales a los ganglios linfáticos y 200 tumores metastásicos) y 30 tumores benignos para obtener conjuntos de potenciales metastásicos oncogenes (871) y los genes supresores metastásico (1042). Por último, para dar prioridad a los objetivos y para validar nuestros genes relacionados con metástasis en líneas celulares, una serie de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón, incluyendo CL
1-0, CL
1-1, CL
1-5 y CL
1-5-F4, con crecientes grados de invasividad [23], fue también sometido a los microarrays de perfiles. Un total de 6.238 transcripciones tenían mayores niveles de expresión en la línea celular de alta capacidad de invasión CL
1-5-F4 que el parental CL
1-0 células. La intersección de estos tres conjuntos de datos revela muchas nuevas dianas. Hemos caracterizado los genes que se conservan sólo en los vertebrados, pero no en los invertebrados, que revelan algunas nuevas anomalías específicas del cáncer humano. Como resultado de ello, nos centramos en el gen mal caracterizado
FLJ10540
.

(A, panel izquierdo) Los patrones de expresión de microarrays de
FLJ10540
en pacientes con adenocarcinoma de pulmón se normalizaron en contra los patrones de expresión en los chips HG_U133A. N: tejidos no tumorales adyacentes; tejidos tumorales: T. El diagrama de caja muestra la distribución de datos como una clasificación y agrupación indica que hay una diferencia estadísticamente significativa (
p
& lt; 0,0001) entre los tejidos tumorales y de los tejidos Nont-umor adyacentes de un mismo paciente de cáncer de pulmón. (A, panel derecho) Los niveles de mRNA de
FLJ10540 Hoteles en muestras de pacientes con cáncer de pulmón 16 se determinaron por Q-RT-PCR. Los resultados se normalizaron contra los niveles de expresión de
GAPDH
ARNm en cada muestra se combina y se representan con el diagrama de caja. (B) Los microarrays de expresión patrones de
FLJ10540
se compararon entre los 30 tumores benignos, 20 metástasis tumorales a los ganglios linfáticos, y 200 tumores metastásicos, y se demostró con el diagrama de caja. (C, panel izquierdo) Los niveles de mRNA de
FLJ10540
se determinaron por Q-RT-PCR en líneas celulares de cáncer de pulmón. Los resultados se normalizaron con respecto al nivel de
GAPDH
mRNA en cada línea celular. Los experimentos se realizaron por triplicado. (C, panel derecho) de proteína total fue extraído de CL
1-0 y CL células
1-5-F4 y se sometió a análisis de inmunotransferencia con anti-FLJ10540. β-actina se utilizó control interno de carga.


FLJ10540
exposiciones hasta reguladas patrones de expresión en los adenocarcinomas de pulmón (Figura 1, panel izquierdo) y firmas metastásicos (Figura 1B). Para validar la expresión de genes de perfiles de datos para
FLJ10540
, Q-RT-PCR se realizó en tumor de adenocarcinoma de pulmón 16-pairwise y las muestras no tumorales adyacentes. Figura S1B muestra que la sobreexpresión de
FLJ10540
era observable en nuestras muestras de los pacientes de pulmón, con 15 fuera de 16 tumores de pacientes pulmonares (94%) que muestra una señal más alta después de la normalización a
GAPDH
para la igualdad de plantilla cargando. El nivel medio de expresión de
FLJ10540
en adenocarcinomas de pulmón fue 8 veces mayor que en las muestras de tejido de pulmón no tumorales adyacentes, tal como se analizó por diagrama de caja (Figura 1A, panel derecho). A continuación verificó la expresión de FLJ10540 en el adenocarcinoma de pulmón representante y recién congelado y las muestras no tumorales adyacentes mediante tinción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-FLJ10540 humanos. Nuestros datos indican que el nivel de FLJ10540 se aumentó en las muestras tumorales, en comparación a la de los tejidos no tumorales adyacentes (datos no mostrados).

Expresión de FLJ10540 en una serie de cáncer de adenocarcinoma de pulmón humano invasivo líneas celulares

Durante el desarrollo de tumores de pulmón, una de las transiciones más críticos es la progresión de
In situ
a carcinoma invasivo. Para explorar el posible papel de FLJ10540 en el invasividad de las células de adenocarcinoma de pulmón, lo primero que examinó la expresión de
FLJ10540
en un panel de líneas celulares, CL
1-0, CL
1-1 , CL
1-5, y CL
1-5-F4, ya sea con características invasivas bajas o altas, como se describe anteriormente [23] por Q-RT-PCR. Los datos indicaron que los niveles de
FLJ10540
ARNm fueron altas en CL
1-5 y CL
células 1-5-F4 que tienen altas capacidades invasivas y metastásicas, pero fueron más bajos en el bajo invasivo CL
1-0 células (Figura 1C, panel izquierdo). los niveles de proteína FLJ10540 también fueron claramente superiores en el altamente invasiva CL
1-5 células que en el bajo CL invasiva
1-0 células, como se muestra por Western blot (Figura 1C, panel derecho). Los resultados indicaron que la regulación al alza de FLJ10540 ARNm y la expresión de proteínas se correlacionó positivamente con la capacidad invasiva de las células del cáncer de pulmón, aumentando la posibilidad de que la regulación positiva de
FLJ10540
podría dar lugar a algunas de las anomalías que se encuentra en el adenocarcinoma de pulmón humano .

la sobreexpresión de FLJ10540 promueve la migración celular y la invasión

Desde FLJ10540 se sobreexpresa en el adenocarcinoma de pulmón y una línea celular de cáncer de pulmón altamente invasivo, parecía posible que su expresión podría afectar la motilidad celular. Para aclarar el papel de FLJ10540 en la motilidad de las células de mamíferos, se examinó si la sobreexpresión de FLJ10540 era capaz de afectar a la migración celular y la invasión. Se emplearon dos tipos de células diferentes para evaluar esta posibilidad. En primer lugar, CL
1-0 células que expresan establemente la hemaglutinina (HA)-etiquetados FLJ10540 se establecieron. Varios transfectantes estables con niveles crecientes de la proteína de FLJ10540 fueron seleccionados (Figura 2A, panel izquierdo) para estudios posteriores. Curiosamente, FLJ10540 sobreexpresión en CL
1-0 células se asoció con la morfología celular alterada notablemente. FLJ10540 clones sobreexpresados ​​se redujeron en el tamaño celular y parecían ser más en forma de huso y habían aumentado separación intercelular en comparación con clones de control del vehículo, que fueron de forma redonda (Figura 2A, panel central). Sin embargo, la tasa de proliferación, tal como se determina mediante el ensayo de MTT, no fue significativamente diferente de la del control del vehículo o las células que expresan FLJ10540 durante 24 horas (Figura 2A, panel derecho). Para examinar el efecto de FLJ10540 en la migración de células de cáncer de pulmón humano, las líneas celulares estables que expresan HA-FLJ10540 o vehículo de control fueron sembradas en Transwell cámaras. Los resultados mostraron que FLJ10540 CL
1-0-estable transfectantes podrían aumentar su migración, medido por el ensayo de migración Transwell; Esto se comparó con el control del vehículo, donde muy pocas células migraron (Figura 2B, panel superior izquierdo). Cuantitativamente hablando, la capacidad de migración de FLJ10540 CL
transfectantes estables 1-0-fue de aproximadamente 6-7 veces mayor que la del control del vehículo (Figura 2B, panel superior derecho). A continuación llevó a cabo un ensayo de invasión in vitro
en
utilizando un filtro de barrera Matrigel recubierto. Después de una incubación de 24 horas en una cámara Transwell recubierta con Matrigel, FLJ10540 CL
transfectantes estables 1-0-habían invadido el material de la membrana basal y pasa a través de los poros para alcanzar la parte inferior del filtro (Figura 2B, panel inferior izquierdo) . Del mismo modo, FLJ10540 CL
1-0 células que expresan mostró un pliegue mayor capacidad de invasión 10-12 que las células de control del vehículo (Figura 2B, panel inferior derecho).

(A, panel izquierdo) HA-etiquetado -FLJ10540 clones estables de CL
se establecieron 1-0 células. Los lisados ​​celulares se sometieron a análisis de inmunoblot con anticuerpo anti-HA. (A, panel central) imágenes de contraste de fase de cultivos monocapa de células CL se muestra
1-0 que expresan FLJ10540 y control del vehículo. (A, panel derecho) para medir las tasas de crecimiento celular, 5 × 10
3 células del vehículo CL-
1-0 y CL
1-0-FLJ10540 clones estables se sembraron en el día 0 en 96- así placas con 10% de FBS. Se contaron las células en los puntos de tiempo indicados por el ensayo MTT (OD
570) para cuantificar el crecimiento celular. Los datos se normalizaron en contra de la DO
570 valor en el día 0. La tasa de crecimiento de CL
1-0 células se muestran como la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. (B, panel superior) Para el ensayo de migración, 5 × 10
3 células del vehículo CL-
1-0 y CL
1-0-FLJ10540 clones estables fueron sembradas en la parte superior de un inserto de Transwell . Después de 24 horas, se rasparon las células en la parte superior, y las células que migraron a la parte inferior se fijaron y se tiñeron con Giemsa. La migración relativa veces de vehículo-CL
1-0 y CL
1-0-FLJ10540 clones estables se normalizó con el control del vehículo y se presenta en forma de diagrama. (B, panel inferior) Para el ensayo de invasión, 1 × 10
4 células fueron sembradas después se añadió Matrigel. La invasión relativa veces de clon estable se normalizó contra las células del vehículo y representado esquemáticamente. Todos los datos representan la media ± S.D.. de tres experimentos independientes.

En segundo lugar, para evitar efectos clonales, un FLJ10540 Bandera de etiquetado basado en retroviral fue infectado en una línea celular RK3E (Figura S2A) que previamente había sido utilizado con éxito para evaluar la migración o inducida por la invasión por diferentes genes y vías de señalización, como el factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9) [24], K-ras [25], y el caracol [26]. células RK3E exhiben características múltiples de epitelio, tales como un cariotipo casi normal y un fondo bajo de la migración celular y la invasión. piscinas mixta de células RK3E infectados se utilizaron para los ensayos de migración y la invasión. Una vez más, las células que expresan FLJ10540 mostraron una capacidad de migración veces superior 4-5 que las células control de vehículo (Figura S2B) y un pliegue superior capacidad invasión 7 que las células control de vehículo (Figura S2C). Tomados en conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que FLJ10540 puede promover la migración celular y la invasión en células de mamífero.

Knock-down de FLJ10540 endógena de siRNA inhibe la migración de células de cáncer de pulmón y la invasión

Para confirmar que FLJ10540 afecta a la migración celular y la invasión en las células de cáncer de pulmón humano, se utilizó un enfoque de siRNA para inhibir la expresión endógena de FLJ10540 y después se ensayó la capacidad de migración y la invasión de CL
1-5 y células H1299. En primer lugar, para examinar la especificidad de siRNAs, una construcción de expresión FLJ10540 marcada con HA fue co-transfectadas con tres diferentes siRNAs; Estos consistían en dos siRNAs sintetizados químicamente específicos para FLJ10540 (siFLJ10540-1 y siFLJ10540-2) y un control negativo siRNA, que cada uno se transfectaron en células HEK293T. Ambos FLJ10540 siRNAs mostraron una inhibición casi completa de la expresión de FLJ10540 marcada con HA, tal como se muestra por análisis de transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA, mientras que el nivel de FLJ10540 marcada con HA se mantuvo alta con el control negativo siRNA (datos no presentados). En segundo lugar, para examinar si los FLJ10540 siRNAs específicos podrían inhibir la expresión endógena en FLJ10540 CL
1-5 y H1299 células, transfectadas siRNAs en CL
1-5 y H1299 células durante 24 horas, seguido de Western blot utilizando un anticuerpo contra FLJ10540. Los datos mostraron una reducción dramática en los niveles de proteína FLJ10540 tanto con FLJ10540 siRNAs, y no hubo reducción significativa de FLJ10540 cuando se utilizó el siRNA negativo (Figura 3A y B, panel izquierdo). Sin embargo, la tasa de proliferación, tal como se determina mediante el ensayo de MTT, no fue significativamente diferente entre las células y las células de control negativo que expresan FLJ10540 siRNAs durante 24 horas (Figura 3A y B, panel central). En tercer lugar, para estudiar el efecto de ARNsi FLJ10540 transfección sobre la migración, control negativo y transfectadas con siRNA FLJ10540 CL
1-5 o H1299 células fueron sembradas por separado en cámaras Transwell con filtros no recubiertos. Después de horas de incubación 24, se encontró que el potencial de motilidad de las células siRNA FLJ10540 haber sido fuertemente inhibida por los siRNAs (Figura 3A y B, panel derecho). Por último, los mismos paneles de células transfectadas negativos o FLJ10540 siRNA se sembraron en una cámara Transwell recubierta con Matrigel. Después de 24 horas de incubación, el potencial invasivo de las células siRNA FLJ10540 pareció reducirse significativamente (Figura 3A y B, panel derecho). Estos resultados apoyan firmemente la idea de que FLJ10540 juega un papel en la migración celular y la invasión en las células de cáncer de pulmón humano.

(A y B, panel izquierdo) Un siRNA control negativo con dos diferentes FLJ10540 siRNAs (siFLJ10540-1 y siFLJ10540-2) se transfectaron en células CL
1-5 y H1299 durante 24 horas. Después de la transfección, el Western Blot se realizó con anti-FLJ10540 y los anticuerpos anti-beta-actina. (A y B, panel central) Para medir las tasas de crecimiento de las células, 5 × 10
3 células de control negativo-CL
1-5, CL
1-5-FLJ10540 siRNAs, control negativo-H1299, y H1299-FLJ10540 siRNAs se sembraron en el día 0 en placas de 96 pocillos con 10% de SFB. Se contaron las células en los puntos de tiempo indicados por el ensayo MTT (OD
570) para cuantificar el crecimiento celular. Los datos se normalizaron en contra de la DO
570 valor en el día 0 de cada tratamiento. La tasa de crecimiento de CL
1-5 y células H1299 se muestran como la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. (A y B, panel derecho) La migración relativa veces y la invasión relativa veces de CL
1-5 y H1299 se normalizaron frente a las células de control negativo y representados esquemáticamente. Los resultados representan la media ± S.D.. de tres experimentos independientes.

Utilizando el concepto de syn-expresión de descubrir VEGF-A, pero no de VEGF-B, como el regulador aguas arriba de FLJ10540

Los genes pertenecientes a la misma vía a menudo muestran los mismos perfiles de expresión, que se conoce como syn-expresión [27]. Por lo tanto, para trazar la ruta de señalización potencial o regulador de aguas arriba (s) que participan en las características de migración y la invasión provocados-FLJ10540, hemos empleado nuestro conjunto de datos de microarrays cáncer de pulmón, como se ha descrito anteriormente, para comprender mejor la concordancia funcional de los genes co-expresó. Para probar esta hipótesis, se analizó en primer lugar si el perfil de expresión de ARNm de
FLJ10540
se correlaciona con cualquier ligando o receptor en nuestra base de datos de microarrays cáncer de pulmón (Figura 1). De estos genes co-expresados, el principal candidato es
VEGF-A
, que fue altamente correlacionado positivamente con el nivel de expresión de ARNm de
FLJ10540
en pacientes con cáncer de pulmón emparejados (r = 0,7 P & lt; 0,001) (Figura 4A). VEGF-A es conocido por ser un factor pro-angiogénico crítico, con capacidad para regular muchos pasos en el proceso angiogénico, incluyendo la proliferación, migración, invasión, y la supervivencia [28], [29]. De hecho, el VEGF-A es altamente expresado en muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer de pulmón [30], [31], [32], y la expresión de VEGF-A está asociada con mal pronóstico [33], [34] y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos [35], aumentando la posibilidad de que las funciones biológicas de FLJ10540 y VEGF-a pueden ser vinculadas funcionalmente en el adenocarcinoma de pulmón.

(a) los patrones de expresión de microarrays de
VEGF-a Opiniones y
FLJ10540 Hoteles en pacientes con adenocarcinoma de pulmón se muestra. Los resultados se normalizaron frente a los patrones de expresión de 56 chips (HG_U133A). N: tejidos no tumorales adyacentes; tejidos tumorales: T. (B, panel izquierdo) VEGF-A induce un aumento en los niveles de proteína FLJ10540 en una forma dependiente de la dosis. Después del tratamiento con diversas concentraciones de VEGF-A (panel izquierdo) o VEGF-B (panel derecho) durante 10 minutos en CL
1-0 células, las proteínas totales se extrajeron de CL
1-0 células y se sondearon con anticuerpo contra FLJ10540. (B, panel central) privadas de suero CL
1-0 células fueron tratadas previamente con o sin varias concentraciones de SU5416 de 2 horas; las células se estimularon con 20 ng /ml VEGF-A de 10 min. β-actina se utilizó como control interno de carga. (C) privadas de suero-CL
1-0 células fueron tratadas previamente con o sin SU5416 durante 2 horas; las células se estimularon con VEGF-A (a la concentración de 20 ng /ml) durante 3 horas. La migración y la invasión relativos pliegues se normalizaron contra las células del vehículo. (D, izquierda, panel superior) Para el ensayo de migración, 5 × 10
3 células del vehículo CL-
1-0 y CL
1-0-FLJ10540 clones estables se sembraron en la parte superior de una transwell insertar y se dejaron adherir durante 12 horas, y luego se incubaron con o sin VEGF-a (20 ng /ml) durante 3 horas. Al final del ensayo, se rasparon las células en la parte superior, y las células que migraron a la parte inferior se fijaron y se tiñeron con Giemsa. (D, izquierda, panel inferior) Para el ensayo de invasión, 1 × 10
se sembraron 4 células después se añadió Matrigel, y luego se incubaron con o sin VEGF-A (20 ng /ml) durante 3 horas. Todos los datos representan la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. (E) Un análisis de inmunofluorescencia indirecta de FLJ10540 en las células VEGF-A-tratada. La expresión de la proteína y la localización subcelular de FLJ10540 se analizaron en presencia o ausencia de VEGF-A (20 ng /ml) en células CL
1-0 utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Después de ser incubado con o sin VEGF-A de 30 min o 180 min, las células se fijaron con 3,7% de formaldehído y se procesaron para microscopía de inmunofluorescencia indirecta. FLJ10540 transloca a la membrana celular a VEGF-A de tratamiento (punta de flecha). Bar:. 10 micras

Dado el importante papel de VEGF-A en la regulación de la migración y la invasión, fuimos los primeros interesados ​​en saber si el VEGF-A podría modular la expresión de la proteína FLJ10540. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de la proteína de FLJ10540 se upregulated en un VEGF-A de manera dependiente de la dosis en células CL
1-0 de cáncer de pulmón (Figura 4B, panel izquierdo). A continuación pregunta si el efecto antagonista de SU5416, un inhibidor de tirosina quinasa VEGFR-2, en actividades biológicas de VEGF-A podría atribuirse a la inhibición de la sobreexpresión de la proteína FLJ10540 inducida por VEGF-A en células de cáncer de pulmón. Los resultados demostraron que la regulación positiva de FLJ10540 en presencia de VEGF-A fue inhibida por la adición simultánea de SU5416 de una manera dependiente de la dosis (Figura 4B, panel central). Por el contrario, el nivel de proteína de FLJ10540 no se vio afectada por el tratamiento con VEGF-B (Figura 4B, panel derecho). De hecho,
FLJ10540
no comparte patrones de expresión similares con
VEGF-B Opiniones, al menos no en nuestro microarrays cáncer de pulmón, apoyando la idea de que los patrones synexpression podrían utilizarse para inferir la función de genes desconocidos [27].

VEGF-A inducida por la sobreexpresión FLJ10540 y translocación mejora la migración de células de cáncer de pulmón y la invasión a través de una vía independiente de EMT

Para probar la importancia biológica de VEGF-A- la regulación positiva inducida de FLJ10540, hemos examinado la influencia de FLJ10540 sobre la migración y la invasión en presencia o ausencia de VEGF-a. En primer lugar, se examinó si los padres CL
1-0 células podrían mostrar la motilidad celular después de la estimulación por VEGF-A. En la figura 4C, CL
1-0 células exhiben una mayor migración y la capacidad invasiva en presencia de VEGF-A solo que el VEGF-A combinar con SU5416 o vehículo solo, lo que sugiere que la adición de VEGF-A aumentó significativamente la migración y invasión de CL
1-0 células, lo que fue acompañado por un aumento en los niveles de FLJ10540. Resultados similares fueron encontrados en FLJ10540 CL
transfectantes 1-0-estables, con o sin estimulación de VEGF-A (Figura 4D).

Para probar si la localización subcelular de FLJ10540 podría ser alterado en las células de cáncer de pulmón a VEGF-a de estimulación, adoptamos el enfoque de inmunofluorescencia indirecta para observar FLJ10540 localización en células CL
1-0 de cáncer de pulmón, ya sea con o sin VEGF-a estimulación. Como se muestra en la figura 4E, VEGF-A tratamiento no sólo dio lugar a un aumento de la expresión de la proteína FLJ10540, sino que también promueve la translocación de una fracción de FLJ10540 a la membrana celular. Además, las diferencias en la morfología celular fueron más evidentes, destacando la extensión de VEGF-A las células tratadas (Figura 4E, 30 min y 180 min) en comparación con el redondeado CL
1-0 células (Figura 4E, 0 min ). Estos cambios morfológicos nos llevó a examinar el fenómeno de la transición epitelio-mesenquimal (EMT). Durante la tumorigénesis, EMT puede aumentar la motilidad e invasividad de las células cancerosas, y la transformación maligna puede estar asociada con las vías de señalización promover EMT [36]. Un estudio previo también indicó que las señales extracelulares inducidas por el VEGF-A están fuertemente implicados en la EMT en células de carcinoma pancreático humano [37]. Para examinar si FLJ10540 podría mediar EMT inducida por VEGF-A, mejorando de este modo la migración celular y la invasión, se utilizó células
1-0 de cáncer de pulmón H1299 y CL, con o sin VEGF-A de estimulación, para hacer frente a esta cuestión. Sin embargo, a pesar del aumento de la motilidad celular mediante la sobreexpresión FLJ10540 o la disminución de la motilidad celular mediante siRNAs mediadas por FLJ10540, las diferencias en FLJ10540 niveles no lo hicieron de cualquier forma alterar los niveles de expresión de cualquiera de las proteínas marcadoras asociadas con la EMT, tales como E-cadherina y vimentina ( datos no mostrados).

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