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PLOS ONE: Variación genética y expresión de genes de respuesta antioxidante en el epitelio bronquial de las vías respiratorias de los fumadores en riesgo de pulmón Cancer

2014/5/19


Extracto

estudios de microarrays anteriores de los fumadores con alto riesgo de cáncer de pulmón han demostrado que la heterogeneidad en las vías aéreas bronquiales epitelial gen celular respuesta a la expresión de fumar puede servir como un biomarcador de diagnóstico precoz del cáncer de pulmón. Como un primer paso en la aplicación de análisis genómico funcional de los estudios de población, hemos examinado la relación entre la variación de la expresión génica y la variación genética en una vía molecular central (respuesta antioxidante NRF2 mediada) asociado con la exposición de fumar y cáncer de pulmón. Se evaluó la expresión génica global en las células epiteliales de las vías respiratorias histológicamente normal obtenidas en la broncoscopia de los fumadores que desarrollaron cáncer de pulmón (SC, n = 20), los fumadores sin cáncer de pulmón (SNC, n = 24), y nunca fumadores (NS, n = 8) . análisis funcional de enriquecimiento mostró que el, elemento de respuesta antioxidante NRF2 mediada (ARE) genes -regulated, fueron significativamente menores en SC, en comparación con los niveles de expresión en SNC. Es importante el descubrimiento de que la expresión de MAFG (una pareja de unión de NRF2) se correlacionó con la expresión de los genes son, lo que sugiere niveles MAFG pueden limitar la inducción de genes diana. Bioinformatically que hemos identificado polimorfismos de nucleótido único (SNP) en putativos genes y para probar el impacto de la variación genética, genotipo estos SNPs putativo de reglamentación y otros etiqueta SNPs en genes de la vía NRF2 seleccionados. La secuenciación MAFG locus, se identificaron 30 SNPs novedosos y dos se asociaron ni con la expresión de genes o el estado de cáncer de pulmón entre los fumadores. Este trabajo demuestra un enfoque de análisis que integra la bioinformática vía y análisis de sitio de unión del factor de transcripción con el genotipo, expresión génica y estado de la enfermedad para identificar SNPs que pueden estar asociados con las diferencias individuales en la expresión génica y /o el estado del cáncer en fumadores. Estos polimorfismos podrían en última instancia, contribuir al riesgo de cáncer de pulmón a través de su efecto sobre la respuesta de la expresión génica de las vías respiratorias a la exposición al humo de tabaco

Visto:. Wang X, Chorley BN, Pittman GS, Kleeberger SR, Hermanos J II, Liu G , et al. (2010) la variación genética y la expresión de genes de respuesta antioxidante en el epitelio bronquial de las vías respiratorias de los fumadores en riesgo de cáncer de pulmón. PLoS ONE 5 (8): e11934. doi: 10.1371 /journal.pone.0011934

Editor: Oliver Eickelberg, Helmholtz de Múnich /Ludwig-Maximilians-Universidad de Munich, Alemania |
Recibido: 23 de febrero, 2010; Aceptado: May 6, 2010; Publicado: 3 Agosto 2010

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito

Financiación:. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental, Institutos Nacionales de Salud (Z01 ES100475) y donaciones a Avrum Spira del Instituto Nacional de Salud (U01ES016035, R01CA124640)
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Compitiendo intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Aproximadamente 1,3 millones de personas fuman cigarrillos en todo el mundo, contribuyendo a casi 5 millones de muertes cada año [1].. El tabaquismo es un factor de riesgo importante para el cáncer de pulmón, la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos, y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la cuarta causa principal de muerte en general [2]. Incluso con los altos riesgos atribuibles debido a la exposición a humo de cigarrillo, sólo el 10-15% de todos los fumadores desarrollan cáncer de pulmón [3], lo que sugiere la variabilidad genética puede jugar un papel en la susceptibilidad a cáncer de pulmón. La falta de conocimiento de las bases genéticas del cáncer de pulmón impide la predicción exacta de los fumadores con mayor riesgo. Sin embargo, los rápidos avances en las técnicas de genómica de alto rendimiento, especialmente de perfiles de expresión génica y polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) genotipo, son prometedores para la caracterización del riesgo. La comprensión de cómo la variación genética influye en la expresión génica inducida por el tabaco en los pulmones y las vías respiratorias podría revelar los factores de susceptibilidad.

Estudios previos han demostrado que la exposición al humo del cigarrillo crea un "campo de la lesión" en las células epiteliales de las vías respiratorias (revisado en [4 ]). Spira
et al
[5] han medido todo el genoma de los perfiles de expresión génica en células epiteliales cepillados recogidos en la broncoscopia de las bronquio principal de los fumadores sanos y nunca fumadores ,. Se observó la expresión génica inducida por el hábito de fumar de los genes implicados en la regulación de estrés oxidante, el metabolismo xenobiótico, y oncogénesis, mientras que los genes implicados en la inflamación y la supresión de tumores vías estaban regulados hacia abajo. Recientemente, el uso de un enfoque similar, un biomarcador de 80 genes fue desarrollado para ayudar a diagnosticar individuos con cáncer de pulmón entre un grupo de fumadores que tienen una broncoscopia por sospecha de cáncer de pulmón [6], [7]. Los perfiles de las células normales histológicamente a gran vías respiratorias epiteliales obtenidas en broncoscopia se utilizaron eficazmente como un biomarcador de diagnóstico del cáncer de pulmón temprano, con una precisión de 83%. Estas observaciones revelan las vías respiratorias de expresión de genes diferencias entre los individuos en respuesta al consumo de tabaco, pero no apuntan a los mecanismos moleculares que contribuyen a la heterogeneidad en esta respuesta la expresión de genes
.
variabilidad genética humana en la respuesta a la exposición ambiental generalmente se acepta como un determinante importante en la susceptibilidad al cáncer [8]. Sin embargo, un problema difícil en estudios de asociación es interpretar si la evidencia estadística de correlación /enfermedad genotipo-fenotipo es biológicamente plausible. A menudo, la relación entre los polimorfismos específicos de nucleótido único (SNP) y la expresión génica o la actividad ha sido difícil de estudiar
in vivo
. El examen de los SNP en el factor de transcripción y vías específicamente, en sitios de unión de factores de transcripción, en relación a la expresión génica es un enfoque que puede proporcionar información funcional [9]. Recientemente,
cis-actuando
SNPs reguladoras han sido descubiertos usando un enfoque regional asociación [10], [11]. Para comprender mejor estas relaciones funcionales que contribuyen a
in vivo
diferencias en la expresión génica y, posiblemente, a la susceptibilidad al cáncer de pulmón, hemos utilizado un enfoque de tres partes para probar las asociaciones entre: (1) la expresión de genes y el estado de cáncer de pulmón , (2) SNP genotipo y la expresión de genes, y (3) SNP genotipo y el estado de cáncer de pulmón.

Utilizando el enfoque descrito por Spira
et al
[7], se evaluó la expresión génica global en las células epiteliales de las vías respiratorias citológicamente normales obtenidas por broncoscopia de los fumadores con sospecha de cáncer de pulmón y de un grupo de control de los fumadores nunca. Identificamos que la vía de respuesta antioxidante regulada por la NRF2 factor de transcripción (factor nuclear eritroide-derivado 2-como 2 o NFE2L2) fue diferente entre estos grupos de sujetos. Hemos encontrado que la expresión de MAFG (una pareja de unión de NRF2) se correlacionó con la expresión de genes de la vía NRF2. Utilizamos estrategias de bioinformática para identificar SNPs putativo de reglamentación en NRF2 sitios de unión [9], [12], [13] y para seleccionar etiqueta SNPs de genes mediada Nrf2. Además, hemos secuenciado el locus MAFG en nuestros sujetos de estudio. La expresión de genes, genotipo y el cáncer de pulmón de estado se integró y se compara, y se identificaron los SNP que se asociaron con diferencias individuales en la expresión génica y /o el estado del cáncer.

Resultados

El consumo de cigarrillo, el cáncer de pulmón y la vía aérea bronquial transcriptoma

con el objetivo de identificar posibles SNPs funcionales y /o haplotipos en las vías de respuesta antioxidantes asociados con el cáncer de pulmón inducida por el tabaco, se utilizó un enfoque de tres partes para analizar las asociaciones entre: 1) la expresión génica y cáncer de pulmón de estado; 2) la expresión de genes y el genotipo de SNPs seleccionados por varias estrategias de bioinformática, y 3) SNP genotipos y cáncer de pulmón de estado. El flujo de trabajo general de nuestro enfoque se describe en la Figura 1.

(A) Se evaluó microarrays perfiles de expresión génica de las células epiteliales de las vías respiratorias histológicamente normal obtenidas mediante broncoscopia de los fumadores con sospecha de cáncer de pulmón y de un grupo control de no los fumadores. (B) Se identificó que la vía de respuesta antioxidante regulada por el factor de transcripción NRF2 fue diferente entre estos grupos de sujetos. Hemos encontrado que la expresión de MAFG (una pareja de unión de NRF2) se correlacionó con la expresión de genes de la vía NRF2. Se utilizaron las estrategias (C) bioinformática para identificar SNPs putativo de reglamentación en los sitios de unión NRF2 y para seleccionar marcado SNPs de genes mediada Nrf2. (D) El locus MAFG fue secuenciado en nuestros sujetos de estudio. Se identificaron los SNP que se asociaron con diferencias individuales en: (E) la expresión génica y /o (F) Estado del cáncer mediante la integración de la expresión génica, el genotipo y el cáncer de pulmón de estado

Se obtuvieron células epiteliales de las vías aéreas bronquiales. por la broncoscopia flexible de 8 sanas que nunca habían fumado (NS) y de los fumadores inscritos en un estudio de diagnóstico de sospecha clínica de cáncer de pulmón incluyendo 20 fumadores con cáncer de pulmón (SC), y 24 fumadores sin cáncer de pulmón (SNC) (Tabla 1). Estos sujetos fueron un subconjunto dos proyectos más grandes de la expresión génica [5], [7] para los que podrían obtener suficiente ADN genómico para el genotipado. Expresión de datos de 31 sujetos de estos proyectos [5], [7] y se utilizaron los datos para un período adicional de 21 pacientes de nuevo ingreso. Utilizando microarrays de Affymetrix HG-U133A, encontramos 11285 sonda de conjuntos expresan en niveles medibles (detección de valor de p & lt; = 0,05 en al menos 20% de los individuos en cualquiera de SC, SNC, o NS), que correspondía a 8.159 en proteínas codificación de los genes RefSeq basado en la anotación de Affymetrix (HG-U133A.na28.annot.csv, marzo de 2009).

Para examinar las respuestas diferenciales a los efectos del tabaquismo sobre el transcriptoma de las vías respiratorias bronquiales, se utilizó los perfiles de los no fumadores como base de referencia y comparación de los valores log 2-expresión promedio de SC o SNC con la de NS de t-test, seguido de múltiples pruebas de corrección (Benjamini-Hochberg falso descubrimiento, FDR [14]). En comparación con los no fumadores, encontramos la expresión diferencial (FDR 0,1) para 846 sonda fija (774 genes) en los fumadores sin cáncer, y 919 sonda fija (834 genes) en los fumadores con cáncer. A continuación se clasificaron los genes fumadores dependientes en sobreexpresado (cambio & gt veces; 1,2) y bajo-expresada (doble cambio & lt; 0,8) los genes. En los fumadores sin cáncer, había 210 sonda fija sobre-expresado y 628 sonda fija insuficientemente expresado; en los fumadores con cáncer, había 263 sonda fija sobre-expresado y 644 sonda fija insuficientemente expresadas, en comparación con los no fumadores. La lista de sonda fija, registro de valores promedio
2-expresión y los valores estadísticos están incluidos en la información de apoyo S1.

enriquecimiento de análisis funcional de fumar afectado a la expresión de genes firmas

Para identificar grupos de genes relacionados con la función biológica común, se analizaron los perfiles de expresión génica utilizando Conjunto de análisis de enriquecimiento (GSEA) [15], la vía de análisis Ingenuity (IPA), y el análisis de enriquecimiento de ontología de genes (GOEA). GSEA probado si alguna
a priori
vías canónicas definidas fueron enriquecidos entre los genes expresados ​​diferencialmente en los grupos. Estamos particularmente interesados ​​en las diferencias entre el cáncer y no hay grupos de cáncer. Se encontró que dos conjuntos de genes fueron enriquecidos en SNC frente NS, al 0,1 FDR nivel. El primer conjunto de genes fueron los "genes elemento de respuesta antioxidante" (curada y publicado anteriormente [9]), con una puntuación de enriquecimiento normalizado (NES) de 2,04 y un valor de q FDR de 0,021; el segundo conjunto de genes fue la "Y actina vía" (NES = 1.87, q-valor = 0,077). Dos conjuntos de genes fueron enriquecidos en NS, incluyendo "el metabolismo de la histidina" (NES = 1.93, q-valor = 0,082) y "RAR /RXR vía" (NES = 1.84, q-valor = 0,093). No existe un conjunto de genes se enriqueció en el FDR 0,1 o 0,25 nivel de SC en comparación con NS. También se observó ningún gen enriquecido establecido en la comparación de SNC frente al SC a nivel FDR 0,1, sin embargo, encontramos 4 conjuntos de genes enriquecido en el FDR nivel 0,25, el conjunto de genes más significativo fue "genes elemento de respuesta antioxidante" (NES = 1,86, q- valor = 0,120). Estos resultados sugieren que el conjunto de genes "elemento de respuesta antioxidante" se enriquecieron significativamente en SNC pero no en Carolina del Sur.

También utiliza la API para la prueba de las vías canónicas enriquecidos utilizando listas de sonda sobre-expresado o bajo-expresado : establece y determinar el peso relativo de las vías identificadas en los diferentes grupos de fenotipo. Para los 210 sobreexpresados ​​sonda fija entre SNC y NS, seis vías fueron significativas (Figura 2A), incluyendo "Nrf2 mediada oxidativo respuesta al estrés", "la señalización de la hipoxia en el sistema cardiovascular", "inserción TR /RXR", "arilo hidrocarburos señalización del receptor "," integrina señalización ", y" señalización de eicosanoides ". GSEA e IPA representan dos métodos de enriquecimiento funcionales distintos que se basan en las bases de datos de conocimiento independientes y diferentes pruebas estadísticas. Ambos identifican la vía NRF2 como la vía más enriquecido, lo que demuestra la coherencia entre estos métodos. Lo más importante, utilizando IPA, por exceso de genes expresados ​​se observó una diferencia muy pronunciada en el nivel de significación de "oxidativo vía estrés NRF2 mediada" entre SNC y SC (Figura 2A). Además, el análisis de ontología de genes también apoyó el papel de los genes de estrés oxidativo entre los genes sobreexpresados ​​en SNC. Hubo 15 GO términos enriquecidos de exceso de genes expresados ​​a nivel FDR 0.1 en SNC y todos ellos fueron términos de función molecular de los genes de respuesta antioxidante (información de apoyo S1); Sin embargo, no hay GO términos fueron enriquecidos entre exceso de genes expresados ​​en SC. De este modo los tres bioinformático analiza apoyan el papel de genes de la vía NRF2 en el grupo sin cáncer pero no en el grupo de cáncer de pulmón.

(A) Ingenuity Pathway Analysis reveló efectos diferenciales de consumo de cigarrillos en los fumadores sin cáncer (SNC) y los fumadores con cáncer (SC) en relación con los no fumadores (NS). Seis vías canónicas fueron significativos enriquecido en los 210 sobreexpresados ​​sonda de conjuntos SNC cuando se comparan con NS (barras azules). Tres vías fueron significativamente enriquecido en los 263 sobreexpresados ​​sonda fija al comparar SC frente NS (barras rojas). Se observó una diferencia muy pronunciada en el nivel de significación de "estrés oxidativo vía Nrf2 mediada" entre SNC y SC. (B) Los niveles de mRNA de la interactuando, componentes reguladores de la vía NRF2 muestran como diagramas de caja. Un diagrama de caja representa un conjunto de datos a través de resúmenes de cinco números: la observación más pequeña, menor cuartil, la mediana, el cuartil superior, y la observación más grande. En comparación con NS, el regulador maestro NRF2 no mostró diferencias entre SNC y SC. Sin embargo, la pareja de unión MAFG fue significativamente menor en SC, y el competidor NRF1 fue significativamente mayor en SC. NRF3, KEAP1, y el ARNm BACH1 no mostraron cambios significativos. (C) Se observó que 22 genes con sitios de unión NRF2 conocidos mostraron diferencias significativas entre los grupos en el FDR nivel 0.1. Consistentemente, la expresión de estos genes en SNC fue mayor que en NS; y la mayoría de estos genes tienen menor expresión en SC de aquel en el SNC. Este patrón fue similar al MAFG patrón de expresión.

Correlación de MAFG con la expresión de genes de respuesta antioxidantes

métodos de enriquecimiento funcionales implicados fuertemente la importancia de la vía de NRF2 (definido por los genes que contienen antioxidante elementos de respuesta (Ares) en las regiones de aguas arriba). Como resultado de ello, hemos examinado este grupo de genes más de cerca. Bajo estrés oxidativo o electrófila, NRF2 se libera de su interacción con KEAP1 y se transloca al núcleo, donde se heterodimeriza con pequeñas proteínas MAF como MAFG, y luego se une son secuencias aguas arriba de NRF2 genes diana [16]. NRF1, NRF3, y BACH1 pueden competir con NRF2 para enlazar con MAFG en sitios, que podría dar lugar a una disminución de la expresión génica mediada por ARE [17], [18], [19]. La figura 2B muestra los niveles de mRNA de los componentes que interactúan proteínas reguladoras de la vía NRF2. En comparación con NS, no se encontraron diferencias significativas en la NRF2 regulador maestro entre cualquiera SNC o SC. Sin embargo, encontramos diferencias significativas en el competidor NRF1 y la unión MAFG socio que son compatibles con un papel en la regulación de los genes diana aguas abajo (Figura 2B). NRF1 fue significativamente mayor (cambio = 1,23, p = 0,0115 para SC frente a SNC veces; y doble cambio = 1,54, p = 0,0084 para SC verso NS, por t-test). El cambio en la expresión NRF1 en este proceso apoya el papel para NRF1 propuesto por Wang
et al
[20] y Ohtsuji
et al
[16], que demostró que NRF1 unión a ARE
in vivo
reprimida la expresión de genes dependiente de ARE y la respuesta modulada al estrés oxidativo. Es decir, se observó NRF1 ser anti-correlacionada con la expresión de los genes de la vía NRF2. MAFG fue menor en comparación con SC NS o SNC (cambio = 0,55, p = 0,0022 para SC frente a SNC, y doble cambio = 0,60, p = 0,0076 para SC frente NS, por t-test). No se encontraron cambios significativos en NRF3, KEAP1, y el ARNm BACH1 (Figura 2B). Como era de esperar sobre la base de los resultados del IPA y GSEA, se encontró que 22 genes regulados por ARE fueron diferentes entre los grupos, y se correlacionó con los niveles más bajos en MAFG (SC pero mayor en SNC, la Figura 2C). genes diana NRF2 que se muestran en la Figura 2C (AKR1C1, AKR1C2, ALDH3A1, CBR1, FTH1, FTL, GCLM, GCLC, GPX2, NQO1, PIR, Prdx1, PSMA3, SAT1, SLC7A11, SOD1, SQSTM1, TALDO1, TKT, TXN, TXNRD1, y UGT1A6) fueron inducidos entre SNC pero fueron consistentemente más bajos en los pacientes SC. Esta novela de observación sugiere que los niveles reducidos de MAFG y mayores niveles de NRF1 (regulador negativo) pueden ser la supresión de la transcripción de estos son los genes regulados entre los fumadores que van a desarrollar cáncer de pulmón.

Nos volvió a examinar una más grande, el conjunto de datos publicados anteriormente [7], y también encontró niveles MAFG significativamente más bajos en los fumadores con cáncer de pulmón (n = 90) en comparación con la de los fumadores sin cáncer (n = 97) (información de apoyo S1). Está surgiendo una prueba más de un papel regulador para MAFG en las células epiteliales de las vías respiratorias. En un proyecto relacionado, la expresión de las vías respiratorias inducida por el humo del cigarrillo de MAFG se ha observado que se rige por el microARN miR-218 [21]. Exploramos el impacto del nivel de expresión de los genes MAFG vía Nrf2 aguas abajo. La figura 3A muestra MAFG siRNA desmontables en la línea celular A549. Figura 3B muestra que MAFG silenciamiento conduce a atenuada expresión de GCLC, NQO1, SLC7A11, TXNRD1 (todos son genes). Nuestra hipótesis es que la reducción de los niveles de MAFG y la consiguiente reducción en la respuesta protectora del estrés oxidativo pueden representar un sello distintivo de la expresión génica en las células epiteliales bronquiales de los fumadores que desarrollan cáncer de pulmón. Sin embargo, el patrón de expresión génica en el tiempo (duración del tabaquismo) podría ser importante y reciente fumar entre los fumadores actuales podrían influir en algunos de los patrones que se observan en las células epiteliales bronquiales.

Después de la transfección transitoria con MAFG siRNA en la línea celular A549 de las vías respiratorias, la expresión génica se midió utilizando qPCR en tiempo real. La transfección con el control revueltos siRNA produce un aumento general de genes de la vía NRF2 (barras negras) con relación a las células no transfectadas (fijado en 100%). la expresión de genes (A) MAFG se redujo significativamente (55%) en comparación con el control de siRNA no específica. (B) GCLC, NQO1, SLC7A11, y la expresión génica TXNRD1 se redujo significativamente con MAFG silenciar comparación con los controles siRNA no específicos. * (P = 0.05, t-test). Todos los datos se presentan como media ± SEM (n = 3).

SNP selección, genotipificación y MAFG secuenciación

Con el fin de examinar si la variación genética de las vías respiratorias estaba contribuyendo a las diferencias de expresión génica, se utilizó una estrategia de bioinformática para identificar SNPs en los posibles sitios de unión NRF2 [9], [13] y también identificar los SNP marcadores de etiquetas de varios genes implicados en la ruta de respuesta antioxidante Nrf2 mediada. El gen y la lista de SNP está incluido en la información de apoyo S1. Después de genotipificación, alrededor del 77% (348 SNPs) de los SNPs identificados aprobó los criterios iniciales de control de calidad (velocidad de genotipado = 90%, umbral de MAF = 0,01 y Hardy-Weinberg umbral de equilibrio p-valor = 0,001, GenTrain puntuación de 0,25), pero sólo examinó 312 SNPs con frecuencias de los alelos ≥ 0,05 en los 52 sujetos.
análisis
la expresión sugiere que los niveles MAFG podrían ser potencialmente limitante de la velocidad en la expresión de genes de respuesta antioxidante. Para evaluar mejor si la variabilidad de secuencia en la expresión génica de genes afectados MAFG, secuenciado una región genómica de 16,5 kb (Chr17: 77,467,438-77,483,879) en nuestros sujetos de estudio. Esta región era de 5000 nt aguas arriba del sitio de inicio de transcripción a 2000-nt aguas abajo del sitio de la transcripción final de MAFG, cubriendo intrones, exones y regiones no traducidas. Descubrimos 33 SNPs en esta región, incluyendo 1 SNP codificante, 16 SNPs en 3 'UTR, y 3 SNPs en intrones, y 13 SNPs en aguas arriba. La ubicación, la frecuencia del alelo y el desequilibrio de ligamiento (LD) se incluye en la información de apoyo S1. Al comparar esta información con el NCBI dbSNP construir 130 (mayo de 2009), se encontró que sólo 3 de estos SNP se había informado anteriormente.

Asociación análisis de SNP genotipo y la expresión de genes

Se realizó lineal regresión entre registro normalizado la expresión génica valores
2-transformado y genotipos de SNP que estaban cerca de cada gen (SNP posición dentro de los 10 kb de un gen de aguas arriba, codificación y las regiones aguas abajo). La significación estadística se evaluó utilizando 10.000 permutaciones de expresión en relación con los valores de los genotipos anteriormente descritos por Extraño
et al
[22] con un corregida
p
valor umbral de 0,05. En 44 fumadores, de entre 338 sonda fija detectables (213 genes) cercanos a nuestros seleccionados 312 SNPs, encontramos una asociación significativa entre 26 y 29 SNPs sonda de conjuntos (25 genes, que se enumeran en la Tabla 2). Entre ellas se encuentran 21 SNPs putativos y 6 son los genes conocidos, incluyendo AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, EPHX1, FTL, y HMOX1. Hemos encontrado un grupo de SNPs asociados con la expresión de 3 genes Nrf2 regulado adyacentes, AKR1C1, AKR1C2 y AKR1C3 (Figura 4). Estamos genotipo 25 SNPs etiqueta en esta región genómica. SNP rs12414884 se encuentra aguas arriba -3792-nt de AKR1C2 y se asoció con la expresión de los 3 genes. Dos SNPs, rs17134158 y rs10904392, que son 1768 nt y 4715 nt-lejos de rs12414884 respectivamente, estaban asociados con la expresión de AKR1C1 y AKR1C2. Los análisis adicionales de desequilibrio de ligamiento indicado estos 3 SNP estaban en el ligamiento genético (r
2 & gt; 0,8). También probamos la asociación entre los SNPs identificados recientemente en la expresión génica y MAFG MAFG. El SNP promotor en Chr17: 77482956 (-4077, A /C, alelo menor frec = 0,09) se asoció con la expresión MAFG (p_corrected = 0,0038)

Estamos genotipo 25 SNPs en la región genómica que contiene AKR1C1, AKR1C2. y AKR1C3. En cada parcela de genetype expresión verso, círculos eran la expresión log 2, y las líneas eran las líneas de tendencia de regresión lineal. Los genotipos de rs1241488 SNP asociados con los niveles de expresión de los 3 genes. Los genotipos de SNP rs1090439 asociados con los niveles de expresión de AKR1C1 y AKR1C2. Nota: El SNP rs17134158 sólo tenía 2 genotipos AG y GG en los fumadores, pero no tienen el genotipo AA en la SN y su frecuencia total del alelo menor & gt; 0,05. Los análisis de desequilibrio de ligamiento indicado estos 3 SNP estaban en el ligamiento genético (r
2 & gt; 0,88).

A pesar de que nuestro enfoque fue la asociación entre el genotipo y de expresión en todos los fumadores en el estudio, que también examinó la diferencia en las asociaciones entre los grupos SC y SNC. Este tipo de análisis exploratorio podría revelar efectos SNP, que podrían estar relacionados con la susceptibilidad diferencial en los fumadores. Se encontró una asociación entre la expresión y un putativo SNP rs3753660 ARE en -199-nt de epóxido hidrolasa 1 (EPHX1) gen (Figura 5A). La asociación fue más fuerte entre SNC y el efecto del SNP parece ser bastante diferente entre los dos grupos (Figura 5A y Tabla 2). EPHX1 humano tiene dos ARE putativos (incluyendo el polimórficos son), pero la expresión EPHX1 no siguió el patrón que aparece por muchos otros genes en la Figura 2C. El alelo C de rs3753660 se predice que tienen unión NRF2 inferior y se observó que se asoció con una menor expresión en el SNC. Esto sugiere una posible interacción entre la variante genética, la expresión y el fenotipo grupo. Dusp1 también tenía un putativo SON SNP rs17658295 asociado con su expresión (Figura 5B). El alelo menor se asoció significativamente con una mayor expresión y el nivel de significación fue más pronunciada en el grupo de cáncer.

En cada parcela, Carolina del Sur, SNC y NS se colorean de rojo, azul y negro, respectivamente. (A) La asociación de un putativo SNP rs3753660 ARE en el promotor del gen EPHX1 muestra tendencias distintas en SC y SNC; (B) dusp1 putativos SNP rs17658295 asociado con su expresión. El alelo menor se asoció significativamente con una mayor expresión y el nivel de significación fue más pronunciada en el grupo de cáncer; C) GCLC intrónica SNP rs670548 menor alelo asociado con la expresión más baja entre todos los sujetos; rs2397146 SNP aguas abajo (D) GCLC 3 'alelo menor asociadas con una expresión más alta entre todos los sujetos.

A pocos SNPs se asociaron con la expresión de los genes son conocidos entre los 52 sujetos, pero no dentro de todos los fumadores. Por ejemplo, dos SNPs (rs2397146 y rs670548) en el gen de la ligasa glutamato-cisteína subunidad catalítica (GCLC) que no estaban en LD (r
2 = 0,28), se asociaron de forma independiente con la expresión (Figura 5C). Curiosamente, el alelo menor de rs670548 (en el intrón) se asoció con una baja expresión mientras que el alelo menor de rs2397146 en 5 'región aguas arriba se asoció con una alta expresión (Figura 5D), sugiriendo la posibilidad de dos fenotipos alélicas distintas. La variación en GCLC previamente se ha asociado con un bajo nivel de la función pulmonar en dos poblaciones independientes [23].

SNPs que puede contribuir a la condición de cáncer a través de la expresión génica

Para identificar SNPs que podrían afectar a los pulmones el cáncer a través de la expresión de genes que utilizó por primera vez la regresión logística para probar la relación entre el cáncer o el estado de no-cáncer y los niveles de expresión génica log2-transformado. Esto identificó 34 sonda fija (31 genes) en la ruta de respuesta antioxidante que se asocia con el estado del cáncer de fumadores en un valor de p & lt corregido; = 0.05. Cabe destacar que el 204970_s_at configuración sonda MAFG se asoció con el estado de "sin cáncer" (p = 0,0014) (Figura 6A). Como se indica en la Figura 6, razonó que un SNP que afectó a la expresión génica puede ser diferente de la frecuencia entre los grupos. Mientras que el poder estadístico para tal comparación es baja, lo hicimos observar tal efecto para el MAFG 3'UTR SNP se ha mencionado anteriormente (Chr17: 77469864; p = 0,058) (Figura 6B-C). Como se muestra en la Figura 6, el genotipo GG se asoció con el estado "sin cáncer" de los fumadores (p = 0,0199), y también marginalmente con el nivel de expresión más alto de MAFG. Si estas diferencias de frecuencia podrían ser justificadas o en grupos más grandes de pacientes, que podrían indicar alelos protectores o de riesgo y podría ser útil para predecir el riesgo

El MAFG 3'UTR SNP en Chr17:. 77469864 potencialmente pueden contribuir a fenotipo ( pulmón estado de cáncer) a través de la expresión de genes, en base a: (a) expresión de MAFG fue mayor en los fumadores sin cáncer que en los fumadores con cáncer; (B) El genotipo GG muestra una tendencia hacia mayores niveles de expresión de MAFG (#, línea negro); laderas del genotipo de parcelas de expresión difieren entre los grupos (* línea roja punteada vs línea punteada azul); (C) El genotipo GG, asociado con una mayor expresión, era más común en los fumadores sin cáncer; (D) Hipótesis. Los individuos con pantalla genotipo GG mayor expresión MAFG en células epiteliales bronquiales; MAFG expresión mayor en los fumadores sin cáncer sugiere que es protector contra el cáncer de pulmón; genotipo GG es menos frecuente entre grupo de cáncer, de acuerdo con un efecto protector.

Discusión

Hay un importante componente hereditario de cáncer de pulmón [24] y la comprensión de cómo la variación genética altera fumar la expresión génica inducida podría proporcionar biomarcadores genéticos para el diagnóstico y revelar alelos de susceptibilidad genética. Numerosos estudios de las vías respiratorias humanas [5], [7], [25], [26] pulmón de ratón [27] o
in vitro
cultivo celular en [28] han informado sobre la expresión génica firmas relacionadas con el tabaquismo. Spira
et al
identificados los perfiles de expresión génica en las células epiteliales de las vías respiratorias grandes-citológicamente normales que pueden servir como un biomarcador de diagnóstico para el cáncer de pulmón [7]. El presente trabajo identifica las características moleculares y genéticas de la vía Nrf2 regulados que son esenciales para esta vía de respuesta de la expresión génica. El uso de herramientas de análisis de ruta, se identificaron diferencias en los perfiles de transcripción Nrf2 mediada de las células epiteliales de las vías aéreas bronquiales obtenidas de los no fumadores, los fumadores de cigarrillos con sospecha de cáncer de pulmón, y los que tienen un diagnóstico posterior de cáncer de pulmón. También hemos revelado un papel potencial para MAFG (una pareja de unión Nrf2) en la modulación de la expresión génica inducida por el tabaco.

NRF2 se activa por el estrés oxidativo y se transloca al núcleo donde se heterodimeriza con pequeñas proteínas MAF para formar una transactivación complejo que se une a regiones específicas de ADN denominados elementos de respuesta antioxidante (ARE) [29] y hasta regula las enzimas de desintoxicación antioxidantes y fase II. Se examinó la expresión de NRF2 y sus socios que interactúan (por ejemplo MAFG, NRF1, NRF3, y BACH1) e hicimos una nueva observación de que MAFG expresión fue fuertemente correlacionada con la expresión de los genes diana NRF2 aguas abajo. En la actualidad, hay 42 genes diana NRF2 descubiertos en diversos tejidos humanos, y nos pareció que 22 de ellos se correlacionó con MAFG nivel de expresión génica en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas. Además, NRF1, un factor regulador negativo y competitivo, se anti-correlacionada con la expresión de genes aguas abajo antioxidante. La posibilidad de que la expresión MAFG podría limitar la expresión de genes aguas abajo antioxidante fue explorada más. Silenciando MAFG con siRNA en las células A549 atenuadas la expresión de los genes conocidos son (Figura 3B) y esto era consistente con los experimentos publicados en ratones knockout MAFG [29]. Se encontró un patrón similar para la expresión MAFG en relación con otros genes antioxidantes cuando se realizó un análisis retrospectivo de los datos de expresión de un publicadas con anterioridad, estudio relacionado, a mayor escala [7].

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