humano
Extracto
FBXW7
actúa como un supresor de tumores a través de la ubiquitinación y degradación de los múltiples oncoproteínas. La pérdida de expresión FBXW7, lo que podría ser parcialmente atribuido por la deleción o mutación genómica del locus FBXW7, se observa con frecuencia en diversos cánceres humanos. Sin embargo, los mecanismos que regulan la expresión FBXW7 todavía siguen siendo poco conocidos. Aquí examinamos la región 5 'de
FBXW7
gen para investigar la regulación de la expresión FBXW7. Se identificaron siete formas de corte y empalme alternativo (AS) 5'-UTR de FBXW7α que se componen de varios nuevos exones no codificantes. Una diferencia significativa en la eficiencia de traducción entre estos 5'-UTRs variantes se observó mediante un ensayo reportero de luciferasa in vivo y Western blot. Además, se encontró que el nivel de mRNA de la forma AS con alta eficiencia de traducción se redujo específicamente en más de 80% de las líneas celulares de cáncer de mama y en más de 50% de los cánceres primarios humanos de diversos tejidos. Además, también hemos identificado mutaciones de FBXW7 en los cánceres de próstata (5,6%), el cáncer de riñón (16,7%), y los cánceres de vejiga (18,8%). Nuestros resultados sugieren que, además de la mutación, la expresión diferencial de FBXW7α como formas con diferentes propiedades de la traducción pueden servir como un nuevo mecanismo para la inactivación de FBXW7 en el cáncer humano
Visto:. Liu Y, Ren S, Castellanos-Martin A, Pérez-Losada J, Kwon YW, Huang Y, et al. (2012) Las múltiples formas novedosas splicing alternativo de FBXW7α tienen una función moduladora y traslacional Mostrar alteración específica en el cáncer humano. PLoS ONE 7 (11): e49453. doi: 10.1371 /journal.pone.0049453
Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Agosto, 2012; Aceptado: 9 Octubre 2012; Publicado: 14 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. JPL es parcialmente financiado por el FEDER y el MICINN (PLE2009-119), FIS (PI10 /00328) "Fundación Eugenio Rodríguez Pascual", y la Fundación Inbiomed (Instituto Oncológico Obra Social de la Caja Guipozcoa-San Sebastián, Kutxa). YS es apoyado por el Programa Nacional de Investigación Básica de China (2012CB518300) y el Ministerio de Ciencia & amp; Tecnología de Shanghai (08410701500). JHM es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer de subvención R01 CA116481, el enfoque científico de la zona de baja dosis, Oficina of Biological & amp; Investigación del Medio Ambiente, Departamento de Energía (DE-AC02-05CH11231) de Estados Unidos, Laboratorio de Investigación Dirigida & amp; Programa de Desarrollo (LDRD), y el Centro de Investigación de la NASA especializado para efectos en la salud de la radiación (NNX09AM52G). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El gen
FBXW7
es un objetivo transcripcional de p53, cuya expresión está aumentada en un p53-dependiente de la forma después de la radioterapia [1]. El
FBXW7
gen codifica una proteína F-box, que es esencial para la ubiquitinación de diferentes oncoproteínas, incluyendo c-Myc [2], [3], c-Jun [4], ciclina E [5] , [6], los diferentes miembros de la familia Notch [7], [8], Aurora-A [1], [9], mTor [10], [11], y KLF5 [12], [13]. La sobreexpresión de varios de estos objetivos, tales como la ciclina E [14], c-Myc [15] y Aurora-A [16] ha sido implicado para inducir inestabilidad genómica. Estas observaciones demostraron que
FBXW7
es un gen supresor de tumor humano, una conclusión que también es apoyado por el descubrimiento de
FBXW7
mutaciones genéticas en el cáncer de una amplia gama de tejidos humanos, tales como la bilis conducto, sangre, huesos, cerebro, mama, colon, endometrio, estómago, pulmón, ovario, páncreas y próstata, con una frecuencia de mutación puntual global del 6% [17].
la supresión de la
FBXW7
génica en ratones conduce a la letalidad embrionaria, pero los ratones heterocigotos desarrolla normalmente [18], [19]. A pesar de que no se desarrollan tumores espontáneos, exposición a la radiación da lugar a diferentes tipos de tumores, incluyendo una variedad de cánceres epiteliales [1]. Los ratones que portan alelos inactivados de ambos
FBXW7
y
p53
programa de aceleración del desarrollo de tumores. haploinsufficient pérdida de
FBXW7
se observa en la mayoría de los linfomas en este modelo de ratón, incluso las derivadas de
FBXW7 /p53
ratones heterocigotos dobles, es decir, la pérdida de una sola copia del gen puede generar una impacto biológico sustancial [1]. Observaciones similares de mutaciones heterocigotas se encontraron posteriormente en tumores humanos [20]. Por tanto, es probable que el impacto global de este gen supresor de tumores en el cáncer humano es mayor que la frecuencia de mutación puntual 6% antes mencionado, ya que la pérdida de sólo una copia del gen puede tener un efecto sustancial en el desarrollo de tumores. Las deleciones del cromosoma 4q31, en el que
FBXW7
se encuentra, son comunes en muchos tipos de cánceres humanos [21] - [25], lo que sugiere que la interrupción de esta vía puede ser una característica importante de muchos, o incluso una la mayoría, de los cánceres humanos.
la región no traducida 5 '(5'-UTR) juega un papel importante en el control de la expresión de genes eucariotas [26]. Estudios recientes sobre el transcriptoma de mamíferos sugieren que la mayoría de los genes que expresan múltiples empalme alternativo (AS) 5'-UTR, y la heterogeneidad UTR de un gen específico es probable que tenga un efecto diferencial sobre la expresión de la proteína [27], [28]. En particular, muchos oncogenes y genes supresores de tumores también son propensos a expresar atípicamente complejos 5'-UTRs [29], [30]. Además, está quedando claro que la expresión inapropiada de 5'-UTR como se ha demostrado que contribuyen al desarrollo del cáncer [31], [32].
En el presente estudio, se investigó la región 5 ' de
FBXW7
para entender sus mecanismos de regulación, e identificaron varios nuevos exones no codificantes en FBXW7α isoforma, que produjo múltiples 5'-UTR como formas. El impacto funcional de estos 5 'UTRs en la eficiencia de la traducción fue mostrado para regular posteriormente expresión FBXW7α. FBXW7α 5 'UTRs se expresan diferencialmente entre diversos tejidos normales y tumorales, lo que resulta en el cambio en los niveles de expresión FBXW7α durante la carcinogénesis probable. Nuestros hallazgos de este estudio sugieren que la expresión diferencial de FBXW7α como formas sirve un nuevo mecanismo de inactivación de
FBXW7
en el cáncer humano.
Resultados
Múltiples formas novedosas de splicing alternativo identificados en
gen FBXW7
Tres FBXW7 isoformas (α, ß y?) se han reportado hasta el momento. Se diferencian en el primer exón y comparten las siguientes 2-11 exones. Con el fin de examinar la regulación de los
FBXW7
expresión, que se caracteriza por «región de FBXW7α, β y γ isoforma utilizando los 5 'de la técnica de RACE 5 con ADNc a partir de la célula epitelial mamaria humana (HMEC) 184A1. El análisis de secuenciación de 115 clones RACE reveló cinco nuevos exones no codificantes dentro de
FBXW7α
5'-UTR cuando se alinea con la secuencia genómica humana, mientras que no se detectaron exones adicionales de
FBXW7β
y
FBXW7γ fotos: por secuenciación 27 y 31 clones de RACE, respectivamente (Figura 1). La
FBXW7α
5'-UTR se somete a corte y empalme alternativo (AS) para producir siete transcritos de ARNm con el mismo sitio de traducción primario de iniciación (Figura 1, Tabla S2). Estos resultados se confirmaron adicionalmente por chorro de las secuencias de la base de datos de etiquetas de secuencia expresada (dbEST). Las secuencias de siete formas de splicing alternativo se depositaron en el banco genético con el número de acceso HQ873864-HQ873870.
ilustración estructural de las múltiples formas de empalme de FBXW7α. Siete formas de empalme diferentes de FBXW7α fueron identificados por 5'-RACE utilizando el cebador específico de gen (GSP) y el cebador nido (Rs1). Se muestra el número de colonias para cada forma de empalme encontrado durante la investigación. La secuencia N-terminal de β isoforma y γ también fue investigado por 5'-RACE utilizando los cebadores correspondientes GSPβ, GSPγ, Nestβ y Nestγ. Las flechas representan los cebadores utilizados en este estudio y su posición en la secuencia correspondiente.
Entre estos exones, 1αa y 1αc aparecen en la mayoría de las formas de AS, mientras que 1αd es sólo en uno de cada siete de empalme formas (Figura 1). Curiosamente, 1αb y 1αd parecen a diferencia de coexistir en la misma medida que se forman. Con el fin de confirmar esto, hemos diseñado cebadores de PCR específicos correspondientes a las secuencias en 1αb y 1αd, respectivamente (Figura S1) y fueron incapaces de detectar cualquier banda a partir de ARNm de tejidos utilizados en este estudio por RT-PCR (datos no mostrados). Además, no hay nuevas ORF encontrado en los siete como formas de FBXW7α, lo que indica que estos nuevos exones sólo se forman diferentes regiones 5'-UTR de diferentes formas AS.
Las diferencias en la eficiencia de traducción de diferentes
FBXW7α
como formas
para investigar el efecto funcional de estos 5'-UTRs en la eficiencia de traducción de la posterior FBXW7α ORF, se utilizó por primera vez un ensayo indicador de luciferasa de comparar los siete secuencias 5'-UTR. Con este fin, hemos clonado aguas arriba de cada 5'-UTR del gen de la luciferasa de luciérnaga (LUC) en el vector informador promotor pGL3 (Promega), y los transfectados en células HeLa. Empty pGL3-promotor se utilizó como control (LUC-ctrl). la actividad de luciferasa Renilla normalizada para cada construcción se comparó con el LUC-ctrl. Los resultados de estos ensayos mostraron consistentemente las diferencias significativas en las actividades LUC entre estos siete 5'-UTR variantes (Figura 2A). Spli2-UTR siempre mostró la mayor actividad LUC, mientras que el nivel de actividad de LUC en Spli1-UTR, Spli4-UTR, y Spli5-UTR fue intermedia, pero significativamente más alto que LUC-ctrl; la actividad LUC de Spli3-UTR, Spli6-UTR, y Spli7-UTR no fue estadísticamente significativo en comparación con LUC-ctrl (Figura 2A). Con el fin de corroborar que estas diferencias en la actividad LUC no se deben a las variaciones en la transcripción LUC, se realizó en tiempo real RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR). Como se muestra en la Figura 2B, no hubo diferencias significativas en los niveles de transcripción entre LUC diferente 5'-UTR variantes en comparación con LUC-ctrl. Este resultado indica claramente que los 5'-UTR de FBXW7α regula la eficiencia de traducción de la ORF aguas abajo.
(A) Efecto de
FBXW7α
5'-UTR variantes en la actividad LUC. LUC reportero construcciones, que contenían cada
FBXW7α
5'-UTR aguas arriba del gen informador de LUC en el vector pGL3, se transfectaron en células HeLa. La actividad LUC se midió como la relación de la luciérnaga /Renilla. Los resultados representan los datos de tres experimentos independientes. Cada experimento se realizó por triplicado. Se muestran datos de la media y las desviaciones estándar. * P & lt; 0,05 en comparación con Luc-ctr. los niveles de transcripción (B) LUC fueron examinados por QRT-PCR. El contenido LUC mRNA se normalizaron al contenido de Renilla de ARNm para todas las muestras y el ARNm LUC relativa para pGL3p (vector vacío, Promega) se consideró arbitrariamente que ser 1 (control). (C) Efecto de la 5'-UTRs en los niveles de proteína FBXW7α. Inmunotransferencia se desarrolló con anticuerpo anti-HA a partir de extractos con constructo indicado. Se consideró que la intensidad de pcDNA3.1 (+) que contiene el gen FBXW7α (control) como 1. constructo GFP se usó como control de la eficiencia de la transfección, y β-actina como control de carga. Todas las transfecciones se realizaron por triplicado, y las barras indican la desviación estándar. * P & lt; 0,05 en comparación con el control. (D) frangments cDNA para FBXW7 (panel superior), GFP (panel central) y GAPDH (panel inferior) fueron amplificados específicamente por RT-PCR a partir de células HeLa transfectadas con las construcciones indicadas.
A fin de verificar el impacto de la 5'-UTR en la regulación de la traducción, hemos clonado siete 5'-UTR en aguas arriba de la ORF FBXW7α en pcDNA3.1 etiquetadas con epítopo HA y posteriormente los transfectadas en células HeLa. análisis de transferencia Western mostró el nivel de expresión del constructo Spli2 fue consistentemente mayor que la observada con los otros UTRs y construcciones de control cuando se normalizó al nivel de la transfección de proteínas de control de la eficiencia de GFP (Figura 2C), que es consistente con los resultados del ensayo de indicador de luciferasa . Se confirmó que la diferencia de expresión no es debido a los efectos de la transcripción desde los niveles de ARNm no son significativamente diferentes (Figura 2D). Tomados en conjunto, hemos llegado a la conclusión de que las variantes 5'-UTR de FBXW7α tienen la función moduladora de traslación.
Perfiles de expresión de
FBXW7α
como formas en tejidos normales humanos
Dado que el 5 "-UTR puede regular la traducción de ORF aguas abajo, el próximo tratado de investigar el patrón de expresión de
FBXW7α
como formas en los tejidos humanos. Para este propósito, semi-cantidad RT-PCR se realizó en 21 tejidos normales humanos con diferentes conjuntos de cebadores correspondientes a exones recientemente identificados (Figura 1, Tabla S1). RT-PCR se realizó inicialmente con un par de cebadores (F2 /Rs1) que podría detectar todos como formas. Como era de esperar, como formas múltiples se expresaron en todos los tejidos humanos (Figura 3A, panel superior). Los medida que se forman Spli5, Spli4 y Spli2, que corresponde a la banda de los tamaños de 386 pb, 435 pb, 478 pb respectivamente, mostraron alto nivel de expresión de ARNm (Figura 3A, panel superior), en consonancia con nuestros hallazgos en 5 'estudios de raza, donde el número de clones correspondientes a estos como formas fueron encontrados frecuencia mucho más alta (Figura 1). El nivel de expresión de diferentes FBXW7α como formas variaron entre los tejidos. Por ejemplo, el Spli4 es la forma dominante en los testículos (carril 12 en la Figura 3A, panel superior), mientras que la Spli2 es el más expresado una en otros tejidos (Figura 3A, panel superior), lo que sugiere un patrón de distribución asociado de tejidos.
(A)
FBXW7α
como formas niveles de expresión se detectaron por semi-cuantitativos RT-PCR utilizando diferentes pares de cebadores. (B) Los niveles de Spli1 & amp; 2 y la expresión Spli3-5 se cuantificaron a partir del experimento se muestra en (A) del panel inferior. Los tejidos normales incluyen: 1-esófago, 2-adiposo, 3-corazón, 4-vejiga, 5-riñón, 6-cerebro, 7-hígado, 8-pulmón, 9-cuello uterino, 10-colon, 11-bazo, 12- testículos, 13-timo, 14-thyraoid, 15-tráquea, 16-intestino delgado, músculo-esquelético 17, 18 de la próstata, 19-placentaria, 20-ovario, 21-de mama. "M" representa marcador escalera de ADN.
A medida que el siete como formas contienen cruce de varios exones en 5 'UTR, es difícil distinguir estas variantes. Por lo tanto, diseñamos los cebadores F2 /R2 situado en 1αa exón y 1αc para comparar el nivel de expresión del Spli1 & amp; 2 (una suma de expresión Spli1 y Spli2) con las formas Spli3-5 (una suma de Spli3, Spli4 y expresión Spli5) . Se encontró que Spli1 & amp; 2 expresan predominantemente en la mayoría de los tejidos (Figura 3A, panel inferior, y la Figura 3B). Sin embargo, algunos tejidos, tales como el bazo, el timo y el intestino delgado mostraron iguales niveles de expresión de Spli1 & Amp; 2 y Spli3-5 (carriles 11, 13 y 16 en la Figura 3A, panel inferior, y la Figura 3B), mientras que Spli3-5 es sólo de alta se expresa en los testículos (carril 12 en la Figura 3A, panel inferior, y la Figura 3B).
expresión alternada de
FBXW7α
específica como formas de cánceres humanos
Dado que la expresión diferencial de 5'-UTR como formas se ha relacionado con la progresión tumoral, se investigó el perfil de expresión de la FBXW7α identificado como formas de cáncer humano por semi-cuantitativos RT-PCR utilizando el mismo conjunto de cebadores descritos anteriormente. El resultado en un panel de líneas celulares de cáncer de mama 20 mostró que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama han disminuido los niveles de expresión de FBXW7α específica como formas en comparación con las células normales humanos epiteliales mamarias (HMEC) (184A1 y 184B5) (Figura 4A). Casi todas las líneas celulares de cáncer de mama mostró una notable reducción en la expresión de Spli1 & amp; 2, mientras que no hay cambios en la expresión de Spli3-5 en comparación con los niveles en HMECs (Figura 4A, panel inferior, Figura 4B). Estas observaciones se confirmaron posteriormente en un conjunto de 92 cánceres de mama primarios humanos. En comparación con los tejidos normales de mama agrupados, Spli1 & amp; 2 niveles de expresión mostraron una reducción significativa en más de 50% de los tumores. Sorprendentemente, se encontró que los niveles de expresión Spli3-5 mostraron aumento significativo en más de 30% de los tumores (Figura 4C y D).
(A) Perfil de expresión del ARNm de FBXW7α como formas de cáncer de mama humano y HMEC líneas celulares se determinó por semi-cuantitativos RT-PCR utilizando diferentes conjuntos de cebadores. "B1 a B20" representa 20 líneas celulares de cáncer de mama diferentes, "A1" significa 184A1, "B5" para 184B5. (B) Los niveles de Spli1 & amp; 2 y la expresión Spli3-5 se cuantificaron a partir del experimento se muestra en (A) del panel inferior. (C) El perfil de expresión de mRNA representante de FBXW7α como formas de 92 cánceres de mama primarios humanos por semi-cuantitativos RT-PCR utilizando diferentes conjuntos de cebadores. (D) La cuantificación de Spli1 & amp; 2 y de expresión Spli3-5 niveles en 92 cánceres de mama primarios humanos. (E) El perfil de expresión de ARNm de FBXW7α como formas en 24 cánceres renales humanas primarias por semi-cuantitativos RT-PCR utilizando diferentes conjuntos de cebadores. (F) La cuantificación de Spli1 & amp; 2 y la expresión Spli3-5 niveles en 24 cánceres renales humanas primarias. "N" para los ARN agrupados de tejidos normales, "M" para el marcador escalera de ADN.
A continuación se determinó si la expresión diferencial de los
FBXW7α
específica AS también ocurrió en otros tipos de humanos cáncer. De hecho, la
FBXW7α
expresión se conmuta de Spli1 & amp; 2 a Spli3-5 en el riñón humano, cáncer de próstata y vejiga (Figura 4E y F, Figura S2A y S2B). Este patrón de expresión diferencial de FBXW7α como formas en varios cánceres humanos apoya sustancialmente nuestra hipótesis de que las formas FBXW7α AS involucran en la regulación de FBXW7α durante la tumorigénesis. En conjunto, nuestros resultados sugieren que los niveles de proteína total FBXW7 pueden reducirse en las células tumorales a través de la expresión diferencial de FBXW7α como formas, y la disminución de FBXW7 abundancia afecta sustancialmente a su función en la ubiquitinación y la degradación de sus objetivos (oncoproteínas), trayendo como consecuencia el desarrollo de tumores y la progresión.
El análisis mutacional de
FBXW7 Hoteles en cánceres urológicos humanos
a pesar de que rara vez se detectan mutaciones están en los cánceres de mama, alteraciones genéticas todavía se encuentran en los cánceres de próstata [35], y no hay ningún informe acerca de las alteraciones genéticas en los tumores de vejiga y riñón. Además, las disparidades del cáncer se han encontrado entre los diferentes grupos étnicos. También hay ningún informe relativo a la
FBXW7
espectro de mutaciones en el cáncer entre los pacientes chinos. Esto nos intriga para examinar si hay mutaciones y cuál es la frecuencia de las mutaciones en pacientes con cáncer chinos. Por lo tanto, se realizó el análisis de la mutación de
FBXW7
gen en el 18 de la próstata, riñón 24, y 16 tejidos tumorales de vejiga de los pacientes chinos. Ambas mutaciones y deleciones fueron encontrados en estos tumores, como se muestra por electroforesis en gel o mapa de secuenciación en la Figura 5. La secuenciación de fragmentos de RT-PCR acortados confirmados dos muestras de la vejiga y una muestra de riñón tener deleciones. De las deleciones de tumor de vejiga, un tumor tiene una deleción de una parte del exón 8, más todo el exón 9, mientras que en el otro tumor de vejiga todo el exón 2 y 3 secuencias que faltan. El cáncer de riñón tiene una deleción de una parte de los exones 8 y 10 junto con todo el exón 9 (Figura 5B-D, Tabla 1). La tasa de mutación general de FBXW7 en los cánceres de próstata es de 5,6%, 16,7% en los cánceres de riñón, y el 18,8% de los cánceres de vejiga de los pacientes chinos que se resumen en la Tabla 1.
(A) Análisis de RT-PCR de
FBXW7
, productos de RT-PCR que contienen supresiones se indican con asterisco. (B-D) secuenciación confirmó la supresión en dos tipos de cáncer de vejiga (B y C), y un cáncer de riñón (D). (E) secuencia Representante traza que muestra las mutaciones de
FBXW7
.
Discusión
Este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos que regulan la expresión a través FBXW7α una novela patrón de empalme. Hemos identificado siete novela como formas de
FBXW7α fotos: por "técnica de RACE 5. A pesar de que producen esencialmente la misma proteína, la
FBXW7α
como formas parecen controlar la expresión de proteínas a través de la regulación de la eficacia de la traducción de estos como formas ya que hemos demostrado que las variantes FBXW7α 5'-UTR tienen una función moduladora de la traducción. Múltiples formas AS solamente se encontraron en
FBXW7α
, no en
FBXW7β
o
FBXW7γ
. Sin embargo, encontramos que
FBXW7
α predominantemente expresado en casi todos los tejidos humanos examinados, mientras que
FBXW7
β mRNA se enriquece en el cerebro y el timo y está ausente o en cantidades traza en otros tejidos, y
FBXW7
γ mRNA se encontró que restringirse en corazón y músculo esquelético (Figura S3), que pone de relieve la importancia potencial de
FBXW7
α a la función de FBXW7. Así, el múltiple como formas presentada en FBXW7α puede permitir la regulación precisa de su expresión durante los procesos biológicos.
por primera vez descubrimos que los niveles de proteína de FBXW7α están regulados a través de control de la traducción mediante la demostración de la eficacia diferencial de traslación de diferentes formas FBXW7α AS. El
in vivo
experimentos usando ensayos de reportero LUC consistentemente mostraron que la forma Spli2 tiene la más alta eficiencia de traducción en comparación con otros. Se conocen varios factores para determinar la eficacia de la traducción [33]. Se encontró que las diferencias en la eficiencia de traducción entre FBXW7α 5'-UTR variantes es poco probable debido a su longitud, la secuencia alrededor del sitio de inicio de la traducción, y el número de codones de inicio dentro de ellos como el mismo número de codones de inicio y la misma secuencia alrededor del sitio de inicio de la traducción en todas las variantes FBXW7α 5'-UTR. La longitud de Spli2-UTR es claramente más largo que el Spli6-UTR y Spli7-UTR, más corto que Spli3-UTR, pero Spli2 exhibió una mayor eficiencia de la traducción. Además, se examinaron las diferencias en las estructuras secundarias y energía libre de cada
FBXW7α
5'-UTR variantes de ARN utilizando el software de plegado en línea (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi- bin /RNAfold.cgi.). No hay diferencias significativas en el valor de la energía libre después de la normalización a la longitud entre estos 5'-UTR (datos no mostrados). Se otorgarán los futuros estudios para investigar los posibles mecanismos por los cuales los 5'-UTR regular la eficacia de la traducción.
FBXW7
ha convertido en un importante gen supresor de tumor humano. Varios mecanismos se han reportado para la inactivación de FBXW7 en el cáncer humano incluyendo la mutación, deleción y la hipermetilación [17], [21] - [25], [34]. Una gran cantidad de esfuerzos se han centrado en el hallazgo de FBXW7 mutación en varios tipos de cáncer humano y han demostrado que la frecuencia global de mutación puntual es sólo el 6% en los cánceres humanos [17], pero no había una variación sustancial en todos los tipos de tumores. Aproximadamente el 30% la frecuencia de mutación se encontró en colangiocarcinoma y de células T leukamias linfoblásticas agudas, mientras que las frecuencias de mutación en la próstata, cáncer de endometrio, así como cáncer gastrointestinal ordenar del 4% al 15% [35]. Constan con estos resultados, se informó aquí por primera vez las mutaciones de FBXW7 detectan en los tumores de riñón y vejiga humanos con la frecuencia de 16,7% (4/24) y el 18,8% (3/16) (Tabla 1), respectivamente. La frecuencia de tumores de próstata de la población china es de 5,6%, similar a un estudio previo llevado a cabo en los caucásicos [36].
hallazgo más importante de este estudio es que el
FBXW7
gen está desregulado a través de la expresión diferencial de las formas como en los cánceres humanos. La conexión entre el desarrollo del tumor y la desregulación de la EA se han convertido en un aspecto novedoso e importante de la biología del cáncer. Nuestros resultados muestran que el patrón de transcripción de
FBXW7
como formas de cánceres humanos es diferente de compartimento de tejido normal. Como se muestra en la Figura 4, la
FBXW7α
patrones de expresión en la mayoría de los cánceres humanos son conmutados de Spli1 & amp; 2 a Spli3-5 en comparación con su tejido normal. La consecuencia de este parámetro hace que la reducción de los
FBXW7
nivel de proteínas, y a su vez conduce a la pérdida parcial de su función. Este resultado sugiere que la desregulación de
FBXW7α
gen puede ser un mecanismo adicional para inactivar
FBXW7
en los cánceres humanos. Dado que la expresión diferencial de los
FBXW7α
como formas se ha encontrado en más del 50% de los cánceres, hemos propuesto que este nuevo mecanismo juega un papel importante en el desarrollo del cáncer humano.
En conclusión, mediante el análisis
FBXW7 página 5 'zona extrema, identificamos la novela
FBXW7α
variantes 5'-UTR que regulan
FBXW7α
la expresión de genes a través del mecanismo de participación de la eficiencia de traducción. Estos se expresan como formas de una manera asociada tejido con niveles variados entre los diferentes tejidos. Nuestro estudio proporciona una nueva visión de la alteración de
FBXW7α
expresión durante el desarrollo del cáncer humano.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El primario de mama humano los tumores se recogieron en el momento de la resección quirúrgica en el hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, España. Recolección y el uso de muestras de pacientes fueron aprobados por el comité de ética de revisión institucional del Hospital Universitario de Salamanca. Los tumores de próstata primario, vejiga y riñón humanos se recogieron en el momento de la resección quirúrgica en el Hospital Changhai, China. La recopilación y el uso de muestras de pacientes fueron aprobados en el marco del Comité de Ética de revisión institucional del Hospital Changhai, Segunda Universidad Médica Militar. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes para la investigación con estas muestras tumorales.
Las muestras de pacientes
En ambos hospitales, los muestras de tejido tumoral frescas se obtuvieron en el momento de la resección quirúrgica de tumores de pacientes. Las muestras fueron inmediatamente se congelaron rápidamente hacia abajo en nitrógeno líquido y después del almacenamiento a -80 ° C congelador antes de uso. H & amp; E (hematoxilina y eosina) diapositivas de tejidos tumorales humanas congeladas fueron examinados por los patólogos de este estudio para asegurar que los tejidos tumorales seleccionados tenían focos de cáncer de alta densidad. (& Gt; 80%)
Cell líneas
líneas celulares de cáncer de mama se cultivaron en DMEM o en RMPI1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y estreptomicina 100 mM y penicilina; detalles se describen en nuestro estudio anterior [37]. Las células HeLa se cultivaron en MEM con suero bovino fetal al 10% y estreptomicina y penicilina 100 mM. Las células se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2.
extracción de ARN total a partir de células y tejido
Total de ARN se prepararon a partir cultivo confluente 80% de cáncer de mama líneas celulares de cáncer, células HeLa 36 horas después de la transfección y de mama humano congelado, riñón, próstata y los tejidos tumorales de vejiga utilizando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. muestras de ARN extraído se trataron con el kit de ADN libre (Ambion) antes de un análisis posterior, con el fin de eliminar cualquier cantidad residual de ADN genómico. concentración de ARN y la calidad se determinaron con un espectrofotómetro Nanovue (GE Healthcare). ARN total humano de diferentes tejidos normales fue adquirido de Ambion.
5 'rápida amplificación de cDNA extremos (RACE) guía
La caracterización de
FBXW7
terminal del gen N se llevó a cabo usando 'kit RACE 5 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ARN total fue aislado de la célula humana epiteliales mamarias (HMEC) 184A1 células con Trizol (Invitrogen), y el ADNc fue generado usando el cebador específico (GSP) enumerados en la Tabla S1. El cDNA fue atado con dCTP utilizando el terminal desoxi-transferasa, y un cebador poli-G (Invitrogen) se combinó con cada
FBXW7
ADNc para PCR. Una segunda PCR se llevó a cabo con una dilución de la primera PCR, utilizando cada nido cebador Nestα (Rs1), Nestβ o Nestγ (Tabla S1), y un cebador adaptamer proporcionado por Invitrogen. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel y se clonaron en vector pCR4. Cada clon se secuenció.
transcripción inversa y amplificación por PCR de cDNA
cDNA de la primera cadena se sintetizó usando el kit de síntesis de ADNc Superscript III (Invitrogen). 1 g de ARN se sometió a transcripción inversa siguiendo las condiciones de reacción especificadas por el fabricante. Las reacciones se cebaron con 50 ng de hexámeros aleatorios. Los ADNc de líneas celulares de cáncer de mama, el panel de tejidos normales humanos, y de mama primario, el riñón, la próstata y los tumores de vejiga se analizaron para AS transcripciones de
FBXW7
α usando PCR con pares de cebadores F2 /RS1, F2 /R2 y F1 /Rs1 (Tabla S1). El gen GAPDH ama de llaves se amplificó como el control por el par de cebadores GAPF /GAPR (Tabla S1). El protocolo para la reacción de PCR era 26-35 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, hibridación a 56 ° C durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 30 s.
Para detectar mutaciones FBXW7 en la próstata primario, la vejiga y los tumores de riñón, la secuencia de codificación de
FBXW7
se amplificó por RT-PCR utilizando tres pares de cebadores P1F /R, P2F /R y P3F /R (Tabla S1), y la amplifica productos fueron secuenciados y comparados en la base de datos Genebank. Para los diferentes productos de PCR de tamaño, las bandas se escindieron del gel y purificada, y luego verificada por secuenciación del ADN.
Construcciones de plásmidos
de siete diferentes FBXW7α 5'-UTR (Spli1 a 7) se amplificó a partir de los los clones positivos en pCR4 RACE utilizando el siguiente par de cebadores GL3F /GL3R (Tabla S1). Los productos de PCR se purificaron en gel, se digirió y después se ligó en el vector del promotor pGL3 (Promega) a través de los sitios de restricción HindIII /NcoI inmediatamente adyacentes al gen de la luciferasa aguas abajo. Las construcciones generadas fueron designados como Spli1-UTR, Spli2-UTR, Spli3-UTR, Spli4-UTR, Spli5-UTR, Spli6-UTR, y Spli7-UTR. Del mismo modo, siete 5'-UTRs amplificadas por el par de cebadores GL3F /GL3R2 se introdujeron en aguas arriba del gen FBXW7α fusionado con HA epítopo en pcDNA3.1 (+) vectores (guardado en este laboratorio) a través de HindIII /EcoRI. Todas las construcciones se verificaron por secuenciación de ADN.
Transfección transitoria
transfecciones transitorias se realizaron en células HeLa aproximadamente el 70% confluentes usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Veinticuatro horas antes de la transfección, se tripsinizaron las células y se transfirieron a cualquiera de las placas de 96 pocillos (para ensayo de luciferasa) o platos 60 mM (para el aislamiento de ARN). La transfección se realizó con el reactivo después de la fabricación del protocolo. Brevemente, 0,2 mg de ADN experimental a partir de preparaciones de plásmidos a gran escala fue entregado a la cada pocillo en las placas de 96 pocillos en presencia de phRL-TK
Renilla
plásmido de control de luciferasa (Promega, 0,01 g) o 4 ug de ADN experimental y 0,2 g de
Renilla
plásmido de control de luciferasa de las células sembradas en placa de 60 mm, y las células se incubaron a 37 ° C.