Extracto
Antecedentes
Hemos informado anteriormente de aumento de los niveles de fucosilación proteína ligada con el desarrollo de cáncer de hígado e identificamos muchas de las proteínas que contienen las estructuras de glicano alterados. Una de estas proteínas es la alfa-1-antitripsina (A1AT). Para avanzar en estos estudios, se realizó un análisis de N-ligado glicanos en los cinco principales isoformas de A1AT y completó un estudio exhaustivo de la glicosilación de A1AT que se encuentra en los controles sanos, pacientes con hepatitis C (VHC) cirrosis hepática inducida, y en pacientes infectados por el VHC con un diagnóstico de carcinoma hepatocelular (HCC).
Metodología /Principales conclusiones
Los pacientes con cirrosis hepática y cáncer de hígado ha aumentado los niveles de triantenario brazo-glicano que contiene externa (α-1, 3) fucosilación. Los aumentos en la central se observaron (α-1,6) fucosilación sólo en A1AT a partir de pacientes con cáncer. Se realizó una lectina fluoróforo ensayo de inmunoabsorción ligado utilizando
Aleuria Aurantia
lectina (AAL), específico para el núcleo y fucosilación brazo exterior en más de 400 pacientes con enfermedad hepática. A1AT AAL-reactiva fue capaz de detectar HCC con una sensibilidad de 70% y una especificidad del 86%, que era mayor que la observada con el marcador actual de HCC, alfa-fetoproteína. Se realizó un análisis de glicosilación de los falsos positivos; Los resultados indicaron que estos pacientes tenían aumentos en fucosilación brazo exterior pero no en fucosilación núcleo, lo que sugiere que fucosilación núcleo es el cáncer específico.
Conclusiones /Importancia
Este informe detalla el cambio gradual en la glicosilación de A1AT con la progresión de la cirrosis hepática con el cáncer e identifica fucosilación núcleo de A1AT como una modificación específica HCC
Visto:. Comunale MA, Rodemich-Betesh L, J Hafner, Wang M, P Norton, Di Bisceglie AM, et al. (2010) Vinculación fucosilación específico de alfa-1-antitripsina en cirrosis hepática y pacientes con cáncer: Implicaciones para un marcador biológico del carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 5 (8): e12419. doi: 10.1371 /journal.pone.0012419
Editor: Wang-Shick Ryu, Universidad de Yonsei, República de Corea
Recibido: 15 de Junio, 2010; Aceptado: July 22, 2010; Publicado: 25 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Comunale et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de subvención R01 CA120206-01 del Instituto Nacional del cáncer (NCI), otorgar UO1 CA084951-06 de la Red de Investigación de Detección temprana del NCI (EDRN), la Fundación de la hepatitis B, y una apropiación de la ciudadanía de Pensilvania. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) o el virus de la hepatitis C (VHC) es la principal etiología del cáncer hepatocelular (HCC) [1] - [4]. Tanto el VHB y las infecciones hepáticas agudas y crónicas VHC causa, y lo más crónicamente individuos infectados permanecen asintomáticos durante muchos años [5]. Alrededor del 10% al 40% de todos los portadores del VHB crónica eventualmente desarrollan cáncer de hígado, y se estima que más de mil millones de personas en todo el mundo mueren a causa de cáncer de hígado HBV y HCV-asociado [2], [6], [7]. De hecho, las infecciones por VHB y VHC están asociados con más de 80% de todos los casos de HCC en todo el mundo y puede ser tan alta como 96% en las regiones donde HBV es endémica [3].
La progresión de la enfermedad hepática con el cáncer de hígado se controla principalmente por los niveles séricos de la glicoproteína oncofetal, alfa-fetoproteína (AFP), o la glicoforma núcleo fucosilado de AFP, AFP-L3. AFP puede, sin embargo, se produce en muchas circunstancias, incluso en relación con otras enfermedades del hígado [8] - [10] y no está presente en todas las personas con HCC [11]. Por lo tanto el uso de la AFP como pantalla principal para el CHC ha sido cuestionado [12], y se necesitan biomarcadores séricos más sensibles para el CHC.
La glicosilación de las proteínas es específico de célula. La N-glicosilación de una proteína refleja las modificaciones que se han producido en la célula de la que procede [13]. La glicosilación de la misma proteína secretada por el tejido enfermo, las células malignas o células normales pueden, ya menudo lo hacen, ser diferentes [14]. Nosotros, y otros, han observado cambios en la glicosilación ligada a N con el desarrollo de la cirrosis y HCC [15] - [19]. Específicamente, la cantidad de núcleo fucosilada glicano enlazado a N derivados de las preparaciones de proteína total aislado a partir del suero de individuos infectados crónicamente con HCV y de aquellos con un diagnóstico de HCC fue consistentemente mayor que en pacientes sanos o en aquellos con VHC y "inactivo "la enfermedad [19].
el uso de lectinas-fucosa específico para identificar las proteínas que se convierten en fucosilados en pacientes con enfermedad hepática, se identificaron más de 100 glicoproteínas de pacientes con HCC y /o cirrosis que contenían una mayor fucosilación [19 ]. Una de estas proteínas fue de alfa-1-antitripsina (A1AT). Se analizó la glicosilación ligada a N de las cinco isoformas principales de A1AT y descubrimos, además de mayores niveles de fucosilación núcleo, aumentos significativos en fucosilación brazo exterior con el desarrollo de cáncer de hígado. El uso de un ensayo basado en lectina, que mide este cambio de más de 400 pacientes con enfermedad hepática y encontramos AAL A1AT reactiva podría detectar HCC con una sensibilidad del 70% y una especificidad del 86%, utilizando un punto de corte de 5 unidades relativas. El análisis de glicanos de los falsos positivos identificados fucosilación-brazo exterior como la causa de la falsa positividad. En contraste, se encontró que los aumentos en fucosilación núcleo sólo en pacientes con cáncer. Se discuten las razones de este cambio y la utilidad clínica de este cambio.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Tanto la Universidad de Drexel Colegio de Medicina y la Universidad de Saint Louis Juntas de Revisión institucional aprobó el protocolo del estudio, que fue consistente con los estándares establecidos por la Declaración de Helsinki de 1975. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante.
Pacientes
las muestras de suero se obtuvieron de la Escuela de saint Louis Universidad de Medicina (saint Louis, MO). La información demográfica y clínica, junto con una muestra de sangre se recogió de cada participante en un tubo separador de suero. La muestra se centrifugó a 2 horas, y el suero se almacenó a -80 ° C hasta el ensayo. Los pacientes se inscribieron en la Clínica de Cáncer de hígado Universidad de Saint Louis y el CHC se diagnostican utilizando los mismos criterios establecidos para el ensayo HALT-C [20]. Los participantes habían HCC identificado por biopsia, por un nuevo defecto hepática que muestra aumento vascular en una modalidad de imagen (ultrasonido [EEUU], resonancia magnética [MRI], o la tomografía computarizada [CT]) con los niveles de AFP & gt; 1.000 ng /ml, o por presunta HCC. A los participantes se presume que tienen CHC si tenían un defecto hepática discreta en los Estados Unidos con los niveles de & lt AFP; 1000 ng /ml y, o bien otras dos exploraciones (MRI, CT, angiografía) malignidad indicando con al menos una de las siguientes características: hipervascularidad, arterial a portal derivaciones venosas, portal de trombosis de vena cerca del defecto, tumor en la vena porta, o uno de otro (RM o TC) muestra las características característico de HCC y, o bien un aumento de tamaño con el tiempo después del descubrimiento inicial (al menos duplicar si es menos de 1 cm) o un aumento en el nivel de AFP a & gt; 200 ng /ml. La estadificación del tumor se determinó utilizando la Red Unida de Organ Sharing sistema de estadificación TNM-modificado (UNOS) para el HCC. Para el grupo de cirrosis, pacientes con hepatitis C y cirrosis comprobada por biopsia se inscribieron. Todos los controles cirróticos fueron seleccionados para el CHC mediante ecografía, TC o IRM antes de la inscripción. Los pacientes que eran HBsAg + (con o sin ADN del VHB se clasificaron en el grupo HBV. Del mismo modo, los pacientes que eran ARN del VHC positivo, sin evidencia de cirrosis, se clasificaron en el grupo HCV. Los pacientes con otras enfermedades hepáticas no viral, pero sin cirrosis eran clasificadas en el otro grupo la enfermedad hepática (OLD). control de los pacientes eran pacientes sanos reclutados por el estudio para actuar como controles.
bidimensional (2-D) electroforesis en gel
Un total de 7 l de suero se diluyeron en 330 l de tampón de solubilización que contiene 7 M urea, tiourea 2 M, 4% de CHAPS, DTT 65 mM, tributilfosfina 5 mM, y una mezcla de 0,4% de anfolitos portadores (Servalyt pH 2-4, pH 3 -10, pH 9-1, 01:02:01). Las muestras se agitaron periódicamente durante 1 h y se aplicaron a una joven de 18 cm de pH 3-7 NL gradiente de pH inmovilizado (IPG) de la tira (Amersham, Piscataway, NJ, EE.UU.) . rehidratación del gel se llevó a cabo durante 14 horas a 50 V y se concentró utilizando el aparato IPGphor (Amersham) enfoque isoeléctrico. Después de enfocar, tiras de gel se redujeron primero alquila después en urea 6 M, 2% SDS, 30% de glicerol, Tris 50 mM, pH 6,8, y 30 mM de DTT, ya sea o 75 mM yodoacetamida durante 10 minutos cada uno. La segunda dimensión se resolvió con un gel de 8% a 18% de acrilamida-0,8% gradiente de PDA en una célula xi Protean II (BioRad Laboratories Sede, Hercules, CA, EE.UU.) con las condiciones de funcionamiento ajustado a 20 mA /gel durante 20 min y 40 mA /gel durante 4 h. Los geles se fijaron y tiñeron con Coomassie coloidal. Los geles fueron imágenes utilizando el sistema de infrarrojos Odyssey Imaging (Li-Cor Biosystems, Lincoln, Nebraska) y analizados mediante el software de imágenes de gel Dinámica no lineal progénesis estación de trabajo (no lineal Durham, Carolina del Norte, EE.UU.).
láser asistida por matriz de desorción /la ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas
manchas de proteínas se escindieron de los geles teñidos con Coomassie coloidal azul, se destiñó, y se digirió con tripsina. péptidos recuperados se concentraron y se desalaron usando ZipTip C18 (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se prepararon para MALDI-TOF espectrometría de masas mediante la mezcla de 0,5 ml de mezcla de péptidos con 0,5 ml de 10 mg /mL α-ciano ácido 4-hidroxicinámico y ácido fórmico 1% en 50% de acetonitrilo y dejando que la gotita se seque sobre la placa MALDI. Los mapas de péptidos de masas se obtuvieron usando un espectrómetro de masas Voyager Pro-DE (Applied Biosystems, Vida Biotecnologías, Carlsbad, CA) que opere en modo de iones positivos reflectrón. Las proteínas fueron identificados a partir de los mapas de masas de péptidos utilizando la base de datos en línea MASCOTA (www.matrixscience.com) para buscar en la base de datos de proteínas no redundante.
Análisis de glicanos
Los puntos de gel 2DE fueron extirpados y utilizando destained 40% de metanol 7% de ácido acético. Los tapones de gel fueron deshidratados con acetonitrilo, se eliminó el acetonitrilo y 25 mM de DTT se dejó de absorber en el enchufe. El tapón se calentó a 100 ° C durante 5 min, se dejó enfriar, y se alquiló en la oscuridad durante 30 min con 75 mM yodoacetamida. Los tapones de gel se lavaron usando dos repeticiones de deshidratación acetonitrilo y 20 mM de bicarbonato de amonio de rehidratación. Después de una deshidratación final, los tapones de gel se secaron en un Speed Vac. Peptide:N-glicosidasa F (PNGasa F) se diluyó con 20 mM de bicarbonato de amonio pH 7 y se dejó adsorber en el tapón de gel. A continuación, el tapón de gel se cubrió con la misma solución y se dejó incubar durante la noche a 37 ° C. Los glicanos se eluyeron de la tapón de gel mediante sonicación en agua Milli-Q tres veces; el eluyente se agruparon, se secó hacia abajo, y marcado con un colorante 2AB (Ludger, Oxford, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Los glicanos se limpiaron usando cromatografía en papel y se filtraron utilizando un filtro de jeringa de 0,22-micras. glicanos marcados con fluorescencia fueron posteriormente analizados utilizando el sistema de cromatografía líquida de alta resolución Waters Alliance con una columna de fase normal (TSK amida 80 columnas) complementado con un detector de fluorescencia Waters y se cuantificó usando el Administrador de Cromatografía Millennium (Waters Corporation, Milford, MA). La fase móvil consistió en disolvente (formiato de amonio 50 mM, pH 4,4) A y disolvente B (acetonitrilo). El gradiente utilizado fue el siguiente: gradiente lineal de 20% a 58% de disolvente A en 0,4 ml /minuto para 152 min seguido de un gradiente lineal de 58% a 100% de disolvente A para el siguiente 3 min. La velocidad de flujo se incrementó a 1,0 ml /minuto; la columna se lavó en 100% de disolvente A durante 5 min. Después de la etapa de lavado, la columna se equilibró en 20% de disolvente A durante 22 min, en preparación para la siguiente muestra. estructuras de glicano fueron identificados mediante el cálculo del valor de la captación de glucosa y exoglicosidasa la digestión, como se describe anteriormente [21].
ligado a fluoróforo lectina-inmuno ensayo (Flisa)
El anticuerpo de captura (A1AT antihumano de ratón , AbD Serotec, Raleigh NC, EE.UU.), se incubó con peryodato de sodio 10 mM durante 1 hora a 4 ° C. Este tratamiento asegura la lectina es incapaz de reaccionar con la glicosilación del anticuerpo y no afecta a la unión del sustrato de anticuerpos. Se añadió un volumen igual de etilenglicol, y el anticuerpo oxidado se llevó a una concentración de 10 mg /ml con tampón de carbonato de sodio, pH 9,5. Se añadió anticuerpo (5 mg /pocillo) a la placa y, después de la incubación, se lavó con 0,1% de fosfato Tween 20 mM solución salina tamponada de pH 7,4. La placa se bloqueó durante la noche con solución salina 3% de albúmina de suero bovino /fosfato tamponada. Para el análisis, se diluyó 5 l de suero en 95 l de reactivo de bloqueo en heterófilos bloqueo Tubos
tm (Scantibodies Laboratory, Inc. Santee, CA, EE.UU.) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente, se añadieron las muestras a las placas durante 2 h y se lavaron 5 veces en tampón de lectina de incubación (10 mM Tris pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,1% de Tween 20). A1AT fucosilados se detectó con un conjugado de biotina
Aleuria aurantia
lectina (AAL) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). lectina unido se detectó utilizando estreptavidina conjugada IRDye 800; la intensidad de la señal se midió usando el sistema de imagen de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska). En todos los casos, las intensidades de señal se compararon con los de las señales detectadas con suero humano comercialmente adquirida (Sigma Chemicals). La lectina-FLISA detecta la cantidad de fucosilación presente en una cantidad igual de moléculas capturadas de cada muestra del paciente y se lleva a cabo de una manera independiente de la cantidad total de proteína en cualquier paciente dado.
Análisis estadístico
las estadísticas descriptivas para pacientes por etapas se compararon mediante diagramas de dispersión que incluyeron los valores atípicos. Todos los valores se presentan como valores medios más o menos el error estándar a menos que se indique lo contrario. Debido a que los datos no seguían una distribución gaussiana típica, una prueba no paramétrica (de dos colas, una confianza del 95%, prueba de Mann-Whitney) se utilizó para determinar diferencias estadísticas entre los grupos. Para determinar el valor de corte óptimo para cada marcador, el receptor curvas características de funcionamiento se construyeron utilizando todos los puntos de corte posibles para cada ensayo. El área bajo la curva ROC fue construido y se compara como se ha descrito anteriormente. Se utilizó un valor de p de dos colas de 0,05 para determinar la significación estadística. Todos los análisis se realizaron utilizando GraphPad Prism (San Diego, CA, EE.UU.).
Resultados
Los niveles de A1AT y grado de Sialyation en pacientes con cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular
agruparon sueros de pacientes sanos (n = 20), pacientes con cirrosis hepática (n = 20) y los pacientes con HCC con un fondo de la cirrosis (n = 20) se resolvieron mediante electroforesis en 2-D gel (2DE) (Tabla 1). La Figura 1A muestra un representante 2-DE de suero humano normal y las Figuras 1B, 1C y 1D muestran un enfoque en los 5 isoformas (M1, M2, M4, M6, M7 y) de A1AT a partir de los tres grupos de pacientes. Tres principales y dos menores isotipos de A1AT se observan con frecuencia cuando el suero humano es isoeléctricamente centrado y en un gel 2-D [22], [23] y estos no se alteran en los tres grupos de pacientes. Las concentraciones de A1AT en cada grupo de pacientes fueron comparables (Figuras 1E-1G) y cayeron dentro de las concentraciones séricas normales. Este resultado se confirmó mediante el análisis de A1AT una enzima-ensayo inmunoenzimático (ELISA), en el que los niveles de A1AT fueron 3,2 mg /ml en el material compuesto a partir de los pacientes sanos, 3,3 mg /ml en el material compuesto a partir de los pacientes cirróticos, y 3,3 mg /ml en el material compuesto a partir de los pacientes con HCC.
los sueros de piscinas de los controles sanos (a, B, e) y la cirrosis (C, F) y el cáncer (D, G) de los pacientes se concentraron utilizando IPGphor 3-7 NL primeras tiras dimensión seguido de la separación SDS-PAGE en 8% a 18% en geles de acrilamida. El pI de puntos de gel son seleccionados M1 = 4,91, M2 = 4,95, M4 = 5,00, M6 = 5.05, y M7 = 5.10. Paneles E, F, y G muestran la abundancia relativa de cada punto de gel.
Se realizó el análisis de glicanos en la M1, M2, M4, M6, M7 y los isotipos de las mezclas de sueros de los participantes normales y pacientes con cirrosis y carcinoma hepatocelular (Figuras 1B-1D) y se examinaron los patrones de sialilación de cada isotipo. Figura S1 muestra un perfil de glicano representante para el isotipo M4 de los controles. De acuerdo con resultados de estudios previos [24], el glicano biantenario es la especie más abundante. Figura S1-B muestra el nivel de la biantenario sialyated y glicano triantenario asociada a cada uno isoformas de cada grupo de pacientes. Como muestra S1-B, el nivel de sialyation en los glicanos bi-anntennery (A2G2S1 o A2G2S2) fue similar en los diferentes grupos de pacientes. Del mismo modo, el nivel de sialyation no se alteró en los glicanos triantenarios. Sin embargo, hubo un aumento en el nivel de la α-1,3 brazo exterior fucosilada vinculados tri-sialyated fucosilados glicano (A3F (3) 1G3S3) en A1AT a partir de los pacientes de cáncer, en comparación con los pacientes sanos y cirróticos. Estos picos se indican en la figura S1 A & amp; B con un asterisco.
Aumento de los niveles de núcleo y del brazo fucosilación exterior se observan en A1AT a partir de pacientes con HCC
Para probar si el aumento del nivel de tri-linked sialyated fucosilada α-1,3 brazo exterior fucosilada glicano (A3F (3) 1G3S3) fue el resultado de un aumento en sialyation o un aumento en la cantidad total de glicano padre, el ácido siálico se eliminó enzimáticamente y re-analizar la muestra. Figura 2 muestra el perfil de glucosilación desialilada simplificado de las cinco isoformas principales para cada uno de grupo de pacientes después del tratamiento con neuraminidasa (
Arthrobacter ureafaciens
). Tres picos de interés, que se indican con una estrella en la Figura 2, se alteran de forma reproducible en las isoformas de M1, M2, y M4 como el hígado enfermo progresa de la cirrosis al cáncer. exoglicosidasa digestión secuencial (datos no mostrados) mostró estos picos a ser un núcleo fucosilado biantenario glicano (F (6) A2G2), un glucano triantenario (A3G3), y un glicano triantenario con un residuo de fucosa brazo exterior única α 1,3 vinculados ( A3F (3) 1G3). La Figura 3A muestra un perfil de desialilada representante con la estructura de glicano correspondiente identificado para cada pico. Tabla 2 es una cuantificación de cada estructura de glicano presentes en los cinco isoformas principales para cada grupo de pacientes. Los cambios específicos en la glicosilación se observan en las isoformas de A1AT con la progresión a cirrosis y HCC. En M6, la isoforma con muy poco tri y estructuras tetra-antenarios, el núcleo biantenario fucosilada glicano (F (6) A2G2), representa 4,48% en pacientes normales, 4,37% en pacientes con cirrosis, y 7,04% en pacientes con cáncer, una tendencia observada a través de cada isoformas (Tabla 2, glicano 3). El porcentaje de cambio entre sano y la cirrosis y entre la cirrosis y el cáncer se da en la Figura 3C, y muestra que esta estructura cambia con cáncer sólo. En M4, los glicanos triantennary con un residuo de fucosa brazo exterior (A3F (3) 1G3) aumenta de 4,34% en los participantes normales al 6,78% en pacientes con cirrosis, y 13,18% en los pacientes con cirrosis, más cáncer. Una vez más, esta tendencia se ve en cada una de las isoformas, con la excepción de la M6 debido a la falta total de estructuras triantenarias (Tabla 2, glicano 8). El aumento relativo de cada una de estas estructuras de glucanos fucosilados como una función de la enfermedad se muestra en la Figura 3B, y muestra que estas estructuras cambios tanto en la cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular. El aumento de la fucosilación brazo exterior también se asoció con una disminución en la matriz de glicanos N-ligados. Es decir, el aumento en el brazo exterior fucosilada glicano triantenario, A3F (3) 1G3, se asoció con una disminución en A3G3 glicano triantenario. (Tabla 2, glicano 6).
Los picos principales que son alterados se indican con un asterisco y son (de izquierda a derecha) un núcleo fucosilada A2G2 bianntennary glicano (F96)), un glicano enlazado a N trianntennary y un glicano enlazado a N trianntennary con un único residuo de fucosa brazo exterior (A3F [3] 3). El porcentaje de cada uno de estos picos en las diferentes isoformas y en los diferentes grupos de pacientes se muestra en la Tabla 2.
(A) Un perfil de glicano enlazado a N representante de un paciente control normal. Los 11 grandes estructuras de glicano identificado se indican y se les da un número. Este número se usa en la Tabla 2 con los nombres estructura proporcionadas. El cambio relativo en el nivel de la trianntennary N vinculado-glicanos con un único residuo de exterior brazo fucosa (A3F [3] G3) (B) y el núcleo fucosilado bianntennary glicano (F [6] A2G2) (C) en normal a cirróticos y cirróticos con CHC se muestra como porcentaje de cambio. Como muestra esta figura, los aumentos en fucosilación brazo exterior están asociados tanto con la cirrosis y carcinoma hepatocelular, mientras que el aumento fucosilación núcleo sólo se observa con HCC.
Análisis de fucosilado A1AT por lectina-Flisa en una cohorte de 458 pacientes
para examinar aún más si los cambios en la inflación y la fucosilación brazo exterior se podía ver en los pacientes individuales y potencialmente utilizados como marcador diagnóstico de cáncer, se analizó una cohorte de pacientes que consta de 458 pacientes para el nivel de A1AT fucosilado usando un ensayo basado en la lectina Flisa. En este ensayo, A1AT fue capturado utilizando un anticuerpo monoclonal y el nivel de fucosilación se determinó utilizando el AAL unión fucosa. AAL reconoce tanto la parte externa del brazo y glicanos núcleo fucosilado. Veinte pacientes sin evidencia de enfermedad hepática se utilizaron como controles; 33 pacientes infectados con VHB tenían un nivel desconocido de la fibrosis hepática; 215 pacientes infectados por el VHC tenían un nivel desconocido de la fibrosis hepática; 65 pacientes tenían cirrosis hepática; 62 pacientes tenían otras enfermedades del hígado; y 63 pacientes tenían cáncer de hígado (Tabla 1). La Figura 3A muestra el nivel relativo de fucosa A1AT lectina reactiva en los seis grupos de pacientes. Los valores se dan como aumento -fold en relación con el nivel en suero comercialmente adquirida "normal". El intervalo de confianza media y 95% de la media se muestran para cada grupo. Se encontró una diferencia clara estadística entre el grupo HCC y todos los otros grupos (P & lt; 0,0001) y entre el grupo cirrótico y el grupo control (P = 0,0173), pero no entre cualquier otros grupos (Figura 3A). El nivel medio de lectina-reactiva A1AT era 1,4 veces (± 0,80) por encima de sigma en el grupo de control, 1,7 veces (± 0.1.8) en el grupo infectado con HBV, 1,9 veces (± 1,8) en el grupo infectado con el VHC, 2,6 veces (± 2,3) en el grupo con cirrosis, 2,6 veces (± 2,0) en el grupo con otras enfermedades hepáticas, y 7,70 veces (± 4,45) en el grupo con HCC. Sorprendentemente, no hubo diferencia en el nivel medio de A1AT AAL-reactiva en pacientes con HCC, en lo que respecta a la etapa de HCC (datos no mostrados). Es decir pacientes con estadio 1 HCC, como se define como una lesión única de menos de 2 cm [11], tuvo un aumento de 9,1 veces (± 4,70) en el nivel de AAL A1AT reactiva mientras que los pacientes con estadio 4 HCC (aquellos con lesiones múltiples & gt ; 6 cm de diámetro) tuvo una media de 6,7 veces (± 5,54), que no fue diferente de la observada en la etapa 1 (pacientes
p = 0,114
)
en esta cohorte, fucosilado. A1AT podía distinguir entre los casos de HCC y no HCC con un área bajo la curva operador receptor (curva ROC) de 0,871. Al comparar solamente HCC en comparación con cirrosis, la capacidad discriminatoria fue 0,867. Utilizando un punto de corte de 5 unidades relativas AAL A1AT reactiva podría diferenciar HCC de cirrosis con una sensibilidad del 70% y una especificidad del 86%. Por el contrario, AFP, cuando se analiza en esta cohorte, tenía un AUROC de 0.764 y podría diferenciar HCC de cirrosis con una sensibilidad de 59% y una especificidad del 93%, utilizando un punto de corte de 20 ng /mL
falsos positivos tienen niveles de brazo exterior fucosilación Considerando Core fucosilación es específico para el CHC
Mayor
Algunos pacientes no tienen cáncer, pero tienen niveles elevados de A1AT lectina-reactiva (Figura 4A). Debido a que los cambios observados en fucosilación brazo exterior de A1AT a partir de pacientes con cirrosis, que era de interés para determinar si las personas con resultados falsos positivos tenían núcleo o fucosilación brazo exterior. La Figura 4A muestra los resultados del análisis de glicanos de A1AT purificado a partir de tres pacientes cirróticos (de nueve) y tres pacientes con la etapa 1 o 2 HCC (de nueve) y se analizaron como antes. Los resultados de estos pacientes se muestran en la Figura 4A, y un perfil de glicano representante de uno de estos pacientes se muestran en la Figura 4B, junto con el nivel de 4 grandes estructuras de glicano indicados. Como muestra la Figura 4B, de acuerdo con los resultados presentados en la Tabla 2 y en las Figuras 3A-3C, los tres pacientes cirróticos tienen niveles de fucosilación núcleo (F (6) A2G2) similares a los observados en los controles sanos. Sin embargo, estos pacientes tienen un aumento significativo en fucosilación brazo exterior (A3F (3) 1G3), similar a los más altos niveles observados en los pacientes con HCC. Es decir, el nivel de fucosilación brazo exterior en estos pacientes varió de 10% a 17%, que es similar al nivel observado en los pacientes con HCC (13%). En contraste, tres pacientes con HCC que tenían muy fuertes resultados positivos de la prueba de Flisa lectina habían aumentado núcleo y fucosilación brazo exterior. Por ejemplo, el núcleo fucosilada glicano bianntennary representados 9,55% en A1AT purificada a partir de H27 paciente. Del mismo modo, este glicano representaba más del 9% en A1AT purificada a partir de pacientes H18 y H23. Los aumentos en fucosilación brazo exterior que van desde 14,03% a 15,97% de los glicanos totales de A1AT también se observaron en estos pacientes. La figura 4D muestra los resultados de los 18 pacientes con un enfoque en el nivel de brazo exterior (α-1,3) y el núcleo (α-1,6) fucosilación. Al examinar los 9 falsos positivos cirróticos el nivel medio de fucosilación núcleo fue de 3,77 ± 0,25% y el nivel medio de fucosyalation brazo exterior era 11.88% ± 2.79. En el caso de los cánceres de la media nivel de fucosilación núcleo era 8.62% ± 1.2 y el nivel medio de fucosilación brazo exterior era 14.26% ± 1,9. No hubo diferencia estadística entre el nivel de núcleo α-1,6 fucosilación entre estos nueve cirrótico y nueve pacientes con HCC (p & lt; 0,0001), pero no con α-1,3 fucosilación vinculado (p = 0,07). Es importante destacar que el nivel máximo de fucosilación núcleo observado en los pacientes con cirrosis falsos positivos fue del 4,01%, similar a lo observado en los controles sanos (3,62%).
(A) El nivel de A1AT lectina-reactiva en pacientes con HCC, la infección por VHB, la infección por VHC, u otras enfermedades hepáticas (OLD) y en los controles. La línea continua representa el valor medio. El eje X representa el grupo de pacientes. El eje y muestra el aumento en -fold A1AT lectina reactiva en comparación con la de suero comercialmente adquirida. (B) Análisis de glicanos de A1AT isoforma M4 de paciente 21. (C) Cuantificación de análisis de glicanos de tres pacientes cirróticos (01,21 y 27) y tres pacientes en estadio 1 o 2 HCC (HCC-23, HCC 27 y 18 HCC ). Se muestran los niveles de 4 grandes estructuras de glicano. Como muestra esta figura, en falsos positivos cirróticos, hay un aumento en el brazo exterior, pero no fucosilación del núcleo. En consonancia con los datos mostrados en las Figuras 2 y 3, se observaron aumentos en fucosilación núcleo en AAT sólo de los pacientes con HCC. (D) Diagrama de dispersión del nivel de α-1,3 o alfa 1,6 fucosa ligada 9 de falsos positivos cirróticos y 9 pacientes con la etapa 1 ó 2 HCC.
Discusión
Los informes recientes han indicado que el aumento de núcleo y fucosilación-brazo exterior pudieron observarse siguiente análisis glycomic de cualquiera de suero humano, total o suero agotado de inmunoglobulina [18], [19], [25]. Se examinó la glicosilación de una sola proteína, A1AT, como una función de la cirrosis hepática y cáncer de hígado. Con este fin, hemos encontrado algunos cambios que fueron consistentes con nuestros hallazgos anteriores, tales como un aumento en fucosilación núcleo, así como cambios en fucosilación brazo exterior.
La observación de que los cambios en la inflación y la fucosilación brazo exterior puede ocurrir proporcionar pistas sobre las bases moleculares de este cambio. Es decir, aunque no se conocen los mecanismos exactos para una mayor fucosilación núcleo en HCC, se cree que implican aumentos en tanto los niveles de la enzima y los sustratos implicados en fucosilación núcleo [17].
También es posible que estos marcadores reflejan alguna alteración en el aparato de Golgi. Los informes recientes han sugerido que, en lo que respecta a que el hígado, la fucosilación de proteínas está implicada en la proteína de clasificación a la bilis [26]. Por lo tanto, es concebible que la aparición de proteínas fucosilados en el suero puede reflejar un defecto común en la clasificación de proteínas. Es interesante observar que la glicosilación de A1AT en el suero de pacientes con cáncer de hígado (Figuras 2, 3 y 4) es similar a la observada en la bilis de individuos sanos [26].
También es interesante observar que la reactividad de la lectina fue mayor que el cambio total observada en fucosilación. Por ejemplo, el paciente tenía 27, ya sea central o fucosa brazo exterior de 22,82% de sus glicanos N-ligados. Por el contrario, A1AT de un individuo sano tenía fucosa (núcleo o parte externa del brazo), el 9% de los glicanos N-ligados. Por lo tanto, utilizando la lectina Flisa, deberíamos haber observado más cercano a un aumento de 2,5 veces y no el aumento de 11 veces que se ha obtenido. Esta diferencia puede ser un artefacto de la lectina-FLISA, el resultado de otras proteínas unidas a A1AT, el aumento o modificados O-glicosilación, o el aumento de la accesibilidad de la lectina para los residuos de fucosa. Todos estos posibles escenarios están bajo investigación.
También es importante tener en cuenta que el aumento se observó fucosilación brazo exterior, tanto en pacientes con cirrosis y en aquellos con carcinoma hepatocelular. Este hallazgo implica que fucosilación brazo exterior no era específico para el cáncer, pero en lugar probablemente se asocia con inflamación, primero de la cirrosis hepática y entonces de la presencia de la lesión HCC. De hecho, el nivel de fucosilación brazo exterior puede ser un marcador más específico de la inflamación y puede ser predictivo de cáncer de desarrollo [27], [28]. Por el contrario, el aumento de fucosilación núcleo sólo se observan en pacientes con HCC, lo que sugiere que este cambio es el cáncer específico.
Como muestra la Figura 4A, muchos pacientes en los grupos no HCC tienen niveles elevados de lectina-reactiva AAL . El análisis de tres pacientes con niveles elevados de AAL de la cirrosis del grupo indicaron que tenían cambios principalmente en fucosilación brazo exterior, no en fucosilación núcleo. A tal fin, el núcleo de fucosilación puede ser un objetivo más específico para la detección del cáncer [29].