Extracto
Antecedentes
Virus del papiloma humano (VPH), especialmente HPV16 , se asocia con el desarrollo de cáncer y intratype variantes cervicales y las amígdalas en la secuencia de aminoácidos de la HPV16 E6 oncogénica se han demostrado estar asociados con lesiones de persistencia y de cáncer virales. Por esta razón la presencia de HPV16 E6 variantes en el carcinoma de células escamosas de amígdalas (TSCC) en el cáncer cervical (CC), así como en muestras cervicales (CS), se exploraron.
Métodos
HPV16 E6 se secuenció en muestras de 108 TSCC y 52 cc de pacientes diagnosticados desde 2000 hasta 2008 en el condado de Estocolmo, y en el 51 CS de mujeres jóvenes que asisten a un centro de salud de los jóvenes en Estocolmo.
resultados
la variante rara E6 R10G era relativamente frecuente (19%) en TSCC, ausente en CC y poco frecuentes (4%) en CS, mientras que la variante L83V conocido era común en TSCC (40%), CC (31%), y CS (29%). La diferencia para R10G fue significativa entre TSCC y CC (p = 0,0003), así como entre TSCC y CS (p = 0,009). El HPV16 linaje filogenético Europea y sus derivados dominada en todas las muestras (& gt; 90%).
Conclusión
La relativamente alta frecuencia de la variante R10G en TSCC, en comparación con lo que se ha encontrado en CC tanto en el presente estudio, así como en varios otros estudios en diferentes países, puede indicar una diferencia entre TSCC y CC con respecto a la inducción de tumores y el desarrollo. Alternativamente, puede haber diferencias en cuanto a la prevalencia oral y cervical de esta variante que necesitan ser explorados más
Visto:. Du J, Nordfors C, Näsman A, Sobkowiak M, M Romanitan, Dalianis T, et al. (2012) Virus del Papiloma Humano (VPH) 16 E6 variantes en Cáncer amigdalar en comparación con los de cáncer cervicouterino en Estocolmo, Suecia. PLoS ONE 7 (4): e36239. doi: 10.1371 /journal.pone.0036239
Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Puerto Oncología, Portugal
Recibido: 10 Febrero, 2012; Aceptado: March 29, 2012; Publicado: 27 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Du et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero fue proporcionada por el Instituto Sueco para el control de Enfermedades Infecciosas, la Fundación sueca del cáncer (100.258), el Consejo Sueco de Investigación (K2011-56X-15282-07-6), la Sociedad del cáncer de Estocolmo (101081), el Ayuntamiento de Estocolmo (2010067) y el Instituto Karolinska. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Co-autor Torbjörn Ramqvist es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales ..
Introducción
La infección con alto riesgo (HR) del virus del papiloma humano (VPH) tiene desde el principios de 1980 ha reconocido a provocar el desarrollo del cáncer de cuello uterino y, más recientemente, también el cáncer orofaríngeo [1], [2]. Entre los cánceres orofaríngeos principalmente amigdalar y la base de la lengua de los cánceres están asociados con el VPH. En particular, la incidencia de cáncer orofaríngeo VPH positiva ha aumentado durante las últimas décadas, tanto en Europa y los EE.UU. [3] - [5]. De acuerdo con el Registro de Cáncer de Suecia, en Suecia, en la actualidad más de 400 nuevos casos de cáncer de cuello de útero y alrededor de 200 casos de cáncer de amígdalas son diagnosticados cada año.
Todos los tipos de HPV conocidos por estar asociados con el cáncer orofaríngeo están también vinculados a cervicales cáncer y HPV16 domina en tanto, causando un 50-60% de todos los cánceres de cuello uterino VPH positiva y aproximadamente el 90% de todos los cánceres de amígdalas VPH positiva. Además, mientras que el genoma de HPV está integrado en su mayoría en el cáncer cervical, a menudo es episomal en el cáncer de amigdalina [6]. Esto indica que, aunque hay muchas similitudes entre estos dos tipos de tumores también podría haber diferencias, tanto en relación con el potencial de HPV16 para provocar el desarrollo de tumores, ya la forma en que diferentes tipos de VPH causan tumores.
Las variantes del genoma del HPV16 en el cáncer de cuello de útero, en etapas previas de cáncer de cuello uterino, y en muestras cervicales de diferentes áreas geográficas se han estudiado ampliamente y el VPH se ha clasificado en linajes filogenéticos como europeo (e), Asia (As), de origen asiático (AA), afro-1 y -2 (AF-1 y AF-2), y el norte de American1 (NA1) [7] - [11].
La principal transformación de las proteínas de HPV16, E6 y E7 , el objetivo de p53 y Rb, respectivamente, inhiben la apoptosis y promover la proliferación y por lo tanto la mayoría de los estudios sobre variantes de HPV16 se han centrado en E6 y E7 en Además de los estudios de la región no codificante de control (NCCR). Variantes se han demostrado que difieren a menudo en E6 y NCCR, mientras que la proteína E7 es a menudo más conservadas [12], [13]. Además, para los principales linajes variantes, variantes con alteraciones de nucleótidos individuales se encuentran con frecuencia, especialmente en los tumores. El más frecuente de estas mutaciones es la transición de T a G en el nt 350 en E6, abreviado como E-T350G, causando un cambio de aminoácido de leucina a valanine en A.A. 83 (L83V). Varios estudios sobre la variante L83V han demostrado una asociación con la persistencia viral y la progresión del cáncer de carcinoma de cuello uterino, aunque algunos estudios posteriores no han podido confirmar esta asociación [14] - [17]. Otras variantes también se han relacionado con propiedades importantes para el desarrollo de tumores tales como, por ejemplo, los que tienen la capacidad de inhibir la transactivación de p53 [18].
Mientras que muchos estudios sobre variantes de HPV16 se han realizado en el cáncer de cuello de útero, se han realizado muy pocos estudios de este tipo en cáncer del cuello [19], [20 ]. El propósito de este estudio fue, por tanto, para examinar si había alguna diferencia en la incidencia y la frecuencia de HPV16 E6 variantes entre el cáncer de amígdalas y el cáncer de cuello uterino. Por esta razón, la prevalencia de las secuencias de HPV16 E6 se compararon en muestras de cáncer de cuello uterino y de las amígdalas de los pacientes diagnosticados durante el mismo período de tiempo en el Condado de Estocolmo, Suecia. Además, al comparar los datos obtenidos a partir de estos tumores con las frecuencias de las variantes de HPV16 en personas sanas, HPV16 E6 también fue analizado en muestras cervicales de mujeres jóvenes sanas en una clínica de la juventud en Estocolmo.
Resultados
HPV16 E6 variantes en el aminoácido R10G y L83V
El cincuenta y cinco HPV16 positivo CSET, 52 y 51 CC CS se analizaron con respecto a la secuencia de HPV16 E6, el cuadro S1. La diferencia más notable entre TSCC y CC se encontró con respecto a las frecuencias de la variante E-A131G que causan un cambio de arginina a glicina en A.A. 10 (R10G). Esta mutación estaba presente en 22% (12/55) de TSCC, mientras que carece por completo de las muestras de CC y sólo está presente en 4% (2/51) de las muestras cervicales. Esta diferencia fue significativa tanto entre TSCC y CC (p = 0,0003), así como entre TSCC y CS (p = 0,009).
La variante E-T350G era la más común entre los tres grupos de muestras . Esta variante, causando un cambio de leucina a valina en aa 83 (L83V), era especialmente común en TSCC (45%), seguido de CC (31%) y CS (29%), respectivamente.
Validación de R10G y las frecuencias L83V en otras muestras de TSCC
a fin de validar el aumento de las frecuencias de mutaciones R10G y L83V en TSCC, 53 muestras adicionales de TSCC, de pacientes diagnosticados en el mismo hospital durante el mismo período, se evaluaron sólo para el R10G y las mutaciones L83V. Entre estas 53 muestras 17% (9/53) llevó a la R10G y el 34% (18/53) la mutación L83V. Cuando se resumieron todas las 108 muestras de 19% tenían R10G y el 40% de la mutación L83V. La mayoría (12/21) de la E6 de TSCC albergar R10G también contenía L83V. No se observó diferencia significativa entre el seleccionado originalmente 55 TSCC y el grupo TCCS extendida con respecto a estas dos mutaciones.
Frecuencia de otras variantes
Las mutaciones en otros sitios fueron menos comunes para todos los tipos de muestras, y sólo 19/28 de ellos afectado a la secuencia de aminoácidos. Los más comunes fueron Q14H y H78Y, ambos presentes en el 4% de CC y CS, mientras que el 7% de TSCC tenía Q14H y H78Y. Además, dos muestras de cáncer de cuello uterino tenían 27 bp repite entre nt 528 y 554.
Distribución de los diferentes linajes filogenéticos
Tal como se detalla en la Tabla S1, se encontró el prototipo HPV16 E6 Europea en el 38% de TSCC, el 65% de CC y el 59% de CS. Sin embargo, cuando se incluyeron las muestras con el tipo Europeo con diferencias de nucleótidos menores (incluyendo R10G y L83V), estas cifras aumentaron a 93, 94 y 96%, respectivamente. Como también se muestra en la tabla S1 otros tipos, Africano-1 y 2, Oriental. Americana de Asia y América del Norte sólo se encontraron en algunas muestras.
Correlación de HPV16 E6 variantes en el cáncer de amígdalas con parámetros clínicos
Las muestras de TSCC se compararon con respecto a las características del paciente y del tumor basan en el presencia de R10G, L83V o ausencia de estas variantes tal como se presenta en la Tabla 1. sin embargo, hubo diferencias significativas para cualquiera de estos parámetros, aunque hubo una tendencia a que los tumores con R10G tener un estadio T inferior.
la presencia de la R10G o L83V variantes en el cáncer de amígdalas fue analizada en correlación con la supervivencia libre de enfermedad a 3 años (DSF) de los pacientes. Sin embargo, no se encontró correlación significativa cuando DSF se comparó entre pacientes con presencia o ausencia de la variante R10G o entre pacientes con presencia o ausencia de la variante L83V (datos no mostrados).
Discusión
en el presente estudio, se han analizado y comparado la frecuencia de las diferentes variantes de HPV16 E6 en TSCC, CC y CS, todos obtenidos a partir de la zona de Estocolmo durante el mismo período de tiempo. Se encontró que el HPV16 R10G era relativamente común en TSCC, ausente en CC y raro en CS. El VPH 16 linaje europeo dominaba y la variante L83V era muy común en las tres categorías de muestras.
El hecho de que la otra forma rara variante de HPV16 E6 R10G se observó en TSCC, pero no en CC en pacientes diagnosticados en el mismo período de tiempo desde el mismo hospital es sorprendente. Esta variante tiene a nuestro conocimiento siempre ha sido rara, aunque se observa en CC en algunos otros estudios [11], [13], [18]. Aunque el tiempo de la infección por HPV para el desarrollo de cáncer de amígdalas se desconoce es probablemente similar entre el cáncer de cuello uterino y de las amígdalas, ya que la edad media de los pacientes es comparable. Por lo tanto, es razonable suponer que los pacientes en este estudio con el cáncer de cuello uterino y de las amígdalas fueron más probable infectadas con HPV16 durante aproximadamente el mismo período. La razón de la alta frecuencia de la variante R10G en TSCC de Estocolmo, en comparación con CC de Estocolmo y otras áreas, es desconocido. Una posibilidad es que esta variante HPV16 por alguna razón era /es más común en la vía oral en comparación con la zona genital. Se necesitan más estudios sobre HPV16 obtenidas a partir de muestras orales para explorar esta posibilidad. Otra posibilidad podría ser que esta variante de HPV16 tiene una mayor propensión a causar TSCC. Cabe destacar que, aunque la mayoría de los pacientes con TSCC eran hombres, y sólo las mujeres tienen CC, no hubo diferencias relacionadas con el sexo en las frecuencias relativas de R10G en TSCC. Los datos recogidos indican que prácticamente todos los pacientes portadores de la variante R10G tenían Suecia, su país de origen, sin embargo, no tenemos información si se han trasladado a Estocolmo desde otras partes de Suecia.
Está bien establecido que HPV16 E6 junto con E6AP (proteína asociada a E6) forma un complejo que se dirige específicamente a p53 y mediar la degradación de p53, que es esencial para la tumorigénesis [21], [22]. Varios estudios se han realizado en la variante R10G en los cánceres de cuello uterino. La mutación R10G es en el extremo N-terminal, importantes para la unión y la degradación de p53, y también se ha demostrado que el resultado en un B modificado /epítopo de células T [13], [23], [24]. Se ha demostrado que tanto E6 con R10G y L83V retienen la capacidad de abrogar la detención del crecimiento, y fuertemente a reducir los niveles de estado estacionario de p53 [25]. Sin embargo, mientras que E6 con R10G ha una disminución de la unión a E6BP (proteína E6 de unión) y disminución de la capacidad de inducir la degradación de Bax, E6 con L83V E6 tiene una mayor unión a E6BP y retenido capacidad de inducir la degradación de Bax en comparación con un prototipo de HPV16 E6 [18 ]. E6 tanto con el R10G y alteración L83, que 9/12 TSCC tenía en este estudio, se comportó similar al prototipo [18]. Además, el sitio R10G También se ha informado que es esencial para la señal de localización nuclear [26]. Por lo tanto, varias características diferentes del sitio R10G pueden influir en la progresión del cáncer, a pesar de que no está claro en qué grado. En el presente estudio no se observó ninguna diferencia significativa en cuanto a la supervivencia libre de enfermedad a 3 años entre los pacientes con TSCC llevar o no llevar variante HPV16 E6 R10G. Esto es un argumento en contra de la posibilidad de que esta variante podría causar más agresivamente creciente TSCC.
Otras variantes de HPV16 E6, especialmente L83V, variar geográficamente y puede afectar el riesgo patológico [27]. En este estudio, L83V fue la variante más común en todo tipo de material, el cual está en línea con muchas otras observaciones tanto en los genitales y la cabeza y el cuello región [16], [19], [20], [28], [ ,,,0],29]. En este caso, se encontró una mayor prevalencia de L83V en TSCC en comparación con CC y CS, mientras que la prevalencia en las últimas categorías eran más o menos de acuerdo con los informes anteriores [12], [14], [29] - [31]. Sin embargo, hay varios estudios que demuestran una asociación entre L83V y el aumento de la persistencia del virus y el riesgo de neoplasia cervical y la progresión del cáncer [28], [32]. Además, los estudios sobre HPV16 E6 variantes y la respuesta inmune celular indican cambios específicos, que desde un punto inmunología huésped-virus de vista puede explicar un modificado potencial oncogénico [33] - [35]. Digno de mención, no se encontró ninguna correlación significativa entre la presencia o ausencia de la variante L83V y la supervivencia libre de enfermedad a 3 años de los pacientes.
Es de destacar que la variante de HPV16 Europea tiene claridad acerca de la misma muy de alta frecuencia en el CS de mujeres jóvenes, obtuvo 2009-2010, al igual que en las muestras de CC. Con el aumento de viajar durante las últimas décadas un aumento en las variantes de HPV16 de otras áreas geográficas no habría sido inesperado, pero este aumento no se observó.
Una limitación en el presente estudio es el número de muestras analizadas. Sin embargo, el 108 TSCC analizados constituyen aproximadamente el 65% de todos los pacientes del Condado de Estocolmo con HPV16 TSCC positivo diagnosticados durante este período de tiempo y donde se dispone de biopsias [1], [36]. Otra limitación es que sólo se analizó la región E6. Por lo tanto, si había alguna diferencia en el NCCR, E7 E5 o regiones entre las muestras de TSCC y CC, éstos se han perdido.
En este estudio se encontró una diferencia significativa en la distribución de variantes de HPV16 entre TSCC y las muestras de CC de los pacientes ingresados en el mismo hospital durante el período de tiempo específico. Más específicamente, la variante rara R10G fue significativamente más frecuente en los TSCC que en CC, y era con frecuencia en combinación con la variante L83V en las antiguas tumores. Se necesitan más estudios para investigar si la variante R10G puede ser más común en forma oral, en comparación con las muestras cervicales. Además, hubo concordancia relativa entre la presencia de variantes en CC y CS.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Karolinska institutet, Estocolmo, Suecia, de acuerdo con los permisos éticos 2005 /431-31 /4, 2005/1330/32, 2008 /870-31 /4, 2008 /813-31 /2 y 2009/1278/31/4. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes en el estudio.
Tumor muestras cervicales y material de
Pre-tratamiento de parafina embebido biopsias de tumores de pacientes del Condado de Estocolmo, diagnosticado 2000-2007, con el carcinoma de células escamosas de amígdalas (TSCC) o 2003-2008 con el cáncer de cuello uterino (CC). Todas las muestras tumorales previamente habían sido analizados para la presencia y tipo de HPV [1], [36] - [38]. Entre el 166 y el 90 TSCC CC que fueron HPV16 positivo, 55 y 52 TSCC CC fueron seleccionados al azar. En la segunda parte del estudio, para su validación, de 53 años adicionales, seleccionados al azar, HPV16 TSCC positivo desde el mismo período de tiempo fueron incluidos. Un diagrama de flujo para las muestras de TSCC se presenta en la Figura 1. Además, las muestras 51 HPV16 positivos cervicales (CS), a partir de un estudio previo de 2009-2010 en un centro de salud de los jóvenes en Estocolmo [39] fueron seleccionados al azar y se analizaron. La edad media de los pacientes con cáncer eran 59,7 y (mediana de 59 años, rango 30-84 y) para los pacientes y el 50,3 TSCC y (mediana de 45 años, rango 25-88 y) para los pacientes con CC, mientras que la edad media de las mujeres en el clínica para jóvenes fue del 19,9 y (mediana 20 y, range16-22 y).
Secuenciación
se extrajo el ADN y se analizó la presencia de VPH y el VPH tipo descrito en estudios previos [1], [37], [39]. Para el análisis de HPV16 E6 de tejidos de cáncer se utilizan dos pares de cebadores que cubren toda la región E6. 5'-CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 ', junto con 5'-TGCTGTTCTAATGTTGTTCC-3' amplificar pb 57-375 y 5'-GGAATCCATATGCTGTATGT-3 ', junto con 5'-3 TGCAATGTAGGTGTATCTCC' amplificar pb 273-587. Para muestras cervicales un par de cebadores que abarca la totalidad de E6 se utilizó; 5'-CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 'y 5'-GTACCCTCTTCCCCATTGGT-3' amplificar pb 57-902. Se realizó la PCR con la temperatura de recocido a 49 ° C y los productos se purificaron usando ExoSAP-IT (USB, VWR) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una PCR para la secuenciación se realizó sobre los productos purificados con terminadores Big Dye ™ (Applied Biosystems) y los amplicones se analizaron en un secuenciador Applied Biosystems 3130. Ambas cadenas de ADN fueron secuenciados y la secuencia de ADN y la correspondiente secuencia de aminoácidos se comparó con la secuencia de referencia europeo HPV16 (código de referencia: NC_001526.1) usando el software de Sci-Ed (Ciencia y Software Educativo, Durham, NC, EE.UU.). Tres investigadores (JD, CC y MS) estuvieron involucrados en el análisis de las secuencias. Para los casos en que el resultado obtenido no estaba clara, se repitió la secuencia.
El análisis estadístico
Las diferencias en las frecuencias de las variantes para TSCC y CC o CS se evaluaron mediante chi-cuadrado y la prueba exacta de Fischer ( de dos colas) utilizando software de análisis estadístico en línea (GraphPad software). La edad media fue la edad en el primer diagnóstico.
supervivencia libre de enfermedad (DFS) se definió como el tiempo desde la fecha de diagnóstico de la fecha de la última vez conocido que el paciente estaba libre de la enfermedad, o la fecha de la recurrencia de la enfermedad (local, regional o recurrencia distante). La muerte sin recurrencia documentada fue censurado en la fecha de la muerte. La supervivencia acumulada se calculó con el método de Kaplan-Meier y se analizaron con la prueba de log-rank. El análisis de supervivencia se realizó en SPSS (SPSS Statistics IBM, versión 20).
Apoyo a la Información sobre Table S1. Empresas El frecuencias de diferentes variantes HPV16E6 en el cáncer cervical (CC), el carcinoma de células escamosas de amígdalas (TSCC) y las muestras cervicales (CS)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0036239.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
los autores desean agradecer a las parteras, Jenny Kugelberg, Ingrid Madarasz, Anne Henriksson Klintberg, Kicki Bergström, Åsa Weitzberg, Kerstin Johanssson en la clínica de los jóvenes en busca de ayuda con la recolección de las muestras .