Extracto
El cáncer de próstata (PC) es una causa principal de muerte en los hombres sin embargo, los factores que regulan su progresión y eventual metástasis al hueso siguen sin estar claros. Aquí mostramos que la expresión WISP1 /CCN4 en tejidos de cáncer de próstata fue hasta reguladas en las etapas tempranas de la enfermedad y, además, que se correlaciona con el aumento de los niveles circulantes de WISP1 en el suero de los pacientes en etapas tempranas de la enfermedad. WISP1 también fue elevada en la próstata del ratón TRAMP modelo de cáncer en el tejido enfermo hipoplásico que se desarrolla antes de la formación carcinoma avanzado. Cuando se ensayó la capacidad de los anticuerpos anti-WISP1 para reducir la propagación de las células PC3-Luc a sitios distantes mostró que dos veces inyecciones semanales de los anticuerpos anti-WISP1 redujeron el número y el tamaño total de los tumores distantes desarrollados después de intracardíaca de inyección (IC) de células PC3-Luc en ratones. La capacidad de los anticuerpos contra WISP1 para inhibir el crecimiento de células de cáncer PC3-Luc en ratones también fue evaluado y demostró que dos veces inyecciones semanales de los anticuerpos anti-WISP1 redujeron el crecimiento local del tumor cuando se examinan en xenoinjertos. Para comprender mejor el mecanismo de acción, la migración de células PC3-Luc a través de membranas con o sin una barrera de Matrigel ™ mostró las células fueron atraídos por WISP1, y que esta atracción fue inhibida por el tratamiento con anticuerpos anti-WISP1. También se muestra la expresión de WISP1 en la interfase hueso-tumoral y en el estroma de los cánceres primeros grados sugeridas expresión WISP1 está en condiciones de desempeñar un papel tanto en la promoción del crecimiento del cáncer y su propagación a los huesos. En resumen, la sobre regulación de WISP1 en las primeras etapas del desarrollo del cáncer, junto con su capacidad para inhibir la propagación y crecimiento de células de cáncer de próstata hace que sea tanto un objetivo potencial y un marcador de diagnóstico accesible para el cáncer de próstata.
cita: Ono M, Inkson CA, Sonn R, faldas escocesas TM, de Castro LF, Maeda A, et al. (2013) WISP1 /CCN4: un objetivo potencial para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata y se extendió al hueso. PLoS ONE 8 (8): e71709. doi: 10.1371 /journal.pone.0071709
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Marzo, 2013; Aceptado: 2 Julio 2013; Publicado: 14 Agosto, 2013
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Financiación:. Esta investigación fue apoyada por la División de Investigación Intramural, NIDCR del Programa de Investigación Intramural del NIH, DHHS (MO, CAI, TMK, LFCD, AM (Maeda), FLM, PGR, ADB, LL NM-F, ACB, NPSC, AM (Molinolo) y MFY), por una subvención del Departamento de Defensa W81XWH-11-1-0239 (AJ y NSF) y por una beca Howard Hughes (RS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
al ser la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres de todas las razas, el cáncer de próstata es un importante problema de salud para los hombres [1], [2]. Se ha propuesto que la mayoría de los hombres de edad avanzada albergan rastros de cáncer de próstata, y sin embargo las bases moleculares de cómo y por qué los avances de cáncer están siendo difícil de alcanzar [3]. Al igual que muchos otros tipos de cáncer peligrosas, las células de cáncer de próstata tienen una muy alta incidencia de la migración desde el tumor primario a sitios distantes en el que son una causa más directa de la morbilidad y la mortalidad [4]. Un sitio frecuente para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso, sin embargo, cuando el cáncer progresa a esta etapa, por lo general es incurable [5], [6], [7]. Por lo tanto hay una necesidad crítica de 1) entender los factores que contribuyen a la progresión de la enfermedad en la próstata, 2) entender cómo y por qué los cánceres de próstata "casa" a hueso y, aún más, 3) idear nuevas formas de prevenir este complejo y devastador proceso. La metástasis de cáncer de próstata puede ser un proceso ineficiente y sólo una fracción de los pacientes de cáncer de próstata se desarrollan cáncer que hace metástasis a sitios distantes [3]. Mediante el análisis de los primeros eventos que tienen lugar durante la progresión del cáncer de próstata es factible que los nuevos procedimientos de diagnóstico podrían ser desarrolladas para predecir la progresión y el futuro gravedad del cáncer y optimizar el tiempo y la naturaleza de las intervenciones terapéuticas. Nueva información sobre las proteínas candidatas que participan en este proceso podría, también, potencialmente ser utilizado para desarrollar nuevas terapias para reducir la propagación y el establecimiento de la enfermedad en sitios distantes como los huesos.
Secretada
WISP1 (Wnt-1 inducida por proteínas ) es un miembro de la familia CCN que se denomina de sus miembros fundadores de Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 y Nov /CCN3. Actualmente hay seis miembros de la familia que también incluyen WISP1 /CCN4, WISP2 /CCN5 y WISP3 /CCN6 [8]. WISP1 fue identificado por primera vez como un gen expresado en la línea de melanoma metastásico, K-1735, donde fue llamado Elm1 (en referencia a su expresión en las células metastásicas humilde) [9]. Casi al mismo tiempo que Elm1 se descubrió, WISP1 se identificó en un laboratorio independiente, donde se encontró que era hasta reguladas por Wnt1 transformado células epiteliales mamarias, y en varias líneas de cáncer de colon, así como que se expresa en el tejido de cáncer de colon humano [10 ]. Posteriormente, se demostró WISP1 para conferir características oncogénicas a células de riñón de rata (NRK-49F), incluyendo el crecimiento acelerado, densidad de saturación mejorada y mayor capacidad para formar tumores en ratones [11]. Desde su identificación original, WISP1 se ha encontrado en una variedad de cánceres, incluyendo carcinoma esofágico de células escamosas [12], condrosarcoma [13], carcinoma de mama [14] [15], neurofibromatosis de tipo I [16], carcinoma de colon [17, ], carcinoma pulmonar de Lewis [18], colangiocarcinoma invasivo, carcinoma gástrico escirro [19] y endometrial endometriod adenocarcinoma [20]. Curiosamente, WISP1 expresión en muchos de estos tipos de cáncer se localiza en los tejidos del estroma que rodean a las células cancerosas [15], lo que sugiere que podría desempeñar un papel en el microambiente que soporta el crecimiento y /o eventual propagación del tumor primario.
en condiciones no patológicas, WISP1 se encuentra en varios tejidos embrionarios y adultos que incluyen sobre todo los nuevos sitios de formación de hueso [21] en el que parece controlar la osteogénesis [22]. Teniendo en cuenta el hecho de que los cánceres de próstata tienen un alto tropismo al hueso y, además, que este proceso puede mejorarse mediante el aumento de recambio óseo [23] la hipótesis de que WISP1 puede, potencialmente, estar implicado en la regulación de metatasis cáncer de próstata. Este estudio se realizó para determinar primero si y donde WISP1 se expresa en los tumores de próstata primarios y, a continuación, para determinar el papel de WISP1 en el crecimiento y homing de las células de cáncer de próstata en el tejido esquelético. Nuestros resultados demostraron que WISP1 se encuentra en las primeras etapas de cáncer de próstata, ya sea en los tejidos de biopsias o en sueros de pacientes afectados, así como en el tejido pre-carcinoma hipoplasia de un modelo de ratón de cáncer de próstata. Además, demostramos que la inhibición de la función WISP1 utilizando anticuerpos neutralizantes redujo el crecimiento del tumor de xenoinjerto de una línea celular de cáncer de próstata, así como su homing al hueso. Tomados en conjunto, nuestros puntos de estudio para WISP1 como nuevo participante en los procesos de crecimiento de cáncer de próstata y metástasis ósea
Métodos
Declaración de Ética
Los sujetos humanos:. Las biopsias que representan diferentes grados del cáncer de próstata (del I-IV), incluyendo tejidos de control fueron adquiridos de los Estados Unidos Biomax ™ (Cat#PR801) y su uso aprobado por los Institutos nacionales de la Salud Oficina de sujetos Humanos de Investigación, Bethesda, MD (Exención#11583). La aprobación para el uso de suero humano se obtuvo de la Universidad Johns Hopkins Medicine (JHM) Junta de Revisión Institucional (IRB), Baltimore, MD. El número del protocolo aprobado por el IRB para su uso con el suero de ensayo es JHM IRB-X No: 04-07-27-03e. Las muestras patológicas /especimenes de diagnóstico de los proveedores comerciales son de fuentes que están disponibles al público y la información es registrada por el investigador de tal manera que los sujetos no pueden ser identificados, directamente oa través de identificadores ligados a los sujetos y el consentimiento informado se obtuvo de todos donantes de suero antes de su uso
para aclarar:. la naturaleza de las muestras utilizadas para los sujetos humanos, se obtuvo el consentimiento por escrito de los donantes como parte de los protocolos para la recogida de muestras de suero (ProMedDx, Inc.) y biopsia de tejido núcleos (de Estados Unidos. Biomax Inc.). Estos protocolos y sus formularios de consentimiento fueron aprobados por las fuentes comerciales propias juntas de revisión institucional. Más información sobre los detalles exactos de los contenidos de los formularios de aprobación por escrito se puede encontrar en www.promeddx.com de muestras de suero y en www.biomax.us de matrices tisulares. Estos protocolos y sus formularios de consentimiento fueron aprobados por las fuentes comerciales propias juntas de revisión institucional. Debido a que se identifican de-las muestras disponibles en el mercado y desvincularse de su donante, su uso no se ajusta a la definición de Sujetos Humanos de Investigación de los NIH, por lo tanto, los protocolos están exentos (Exención#1158 para el NIH y no: 04/07/27 -03e de la Universidad Johns Hopkins).
experimentos Uso de animales
Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo en los Institutos nacionales de salud y la institución que concedió la homologación de los procedimientos con animales descritos en el documento que se conoce como el Comité de Cuidado y uso de Animales (ACUC). El número de aprobación para los experimentos llevados a cabo en el estudio actual es NIH ACUC#12-645.
Producción de anticuerpos policlonales
Un péptido WISP1 humana con la secuencia RDTGAFDAVGEVEAWHRN (aminoácidos 198-216, la adhesión NP número 003873, véase la Figura S1 a) fue sintetizado y conjugado a través de la cisteína que se activa la hemocianina de lapa californiana y se inyecta en un conejo (LF-185) para producir anticuerpos policlonales en una instalación aprobada por la AAALAC (Covance Inmunología Servicios, Denver, PA, EE.UU.) . El título del antisuero resultante se probó usando un ELISA directo, ya sea con el péptido LF-185 o con WISP1 humana purificada como control (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EE.UU.) unido a la placa de microtitulación. La especificidad de la LF-185 fue probado por Western blot utilizando otros tres miembros disponibles de la familia CCN Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 y Nov /CCN3 (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EE.UU.) y mostró inmunoreactividad sólo hacia WISP1 (Figura S1B ). Un segundo anticuerpo de conejo a WISP1 fue generado a una secuencia en el extremo C-terminal, que está altamente conservada (& gt; 95%) entre el ratón y WISP1 humano (aminoácidos 346-367, NP 003873 ver, Figura S1A), utilizando la humana secuencia peptídica CRNPNDIFADLESYPDFSEIN conjugado a través de la cisteína a KLH activada (LF-187). Este último anticuerpo también mostró una alta reactividad a WISP1 y no a los otros miembros de la familia CCN probados (S1B).
Purificación de anticuerpos policlonales
Los péptidos utilizados para generar LF-185 y LF-187 eran purificados mediante su correspondiente péptido y el Kit de Inmovilización Sulfolink (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.), y los anticuerpos fueron purificados por afinidad de la siguiente manera. En primer lugar, las columnas de péptidos ligada se equilibraron de acuerdo con el protocolo del fabricante y después se hizo pasar a 2,0 ml de cada suero a través de la columna, se lavó con PBS, y se eluyeron con una solución 4 M de guanidina en PBS. Los anticuerpos eluidos se dializaron inmediatamente con un exceso de volumen de PBS durante la noche a 4 ° C y la recuperación de su inmunorreactividad verificada por ELISA. anticuerpos purificados por afinidad se almacenaron a -80 ° C antes de su uso. Para los controles experimentales, IgG se purificó a partir de un conejo challanged solamente con adyuvante utilizando la proteína A IgG kit de purificación (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) con una columna de Proteína de afinidad usando las mismas, lavar, las condiciones de elución y diálisis de unión utilizados para purificador de LF-185 y LF-187.
la inmunohistoquímica y tinción TRAP
las láminas fueron teñidas utilizando las recomendaciones del fabricante de una manera idéntica a la utilizada para las secciones de ratón se describen a continuación. Brevemente, se desparafinaron secciones de tejido, la actividad peroxidasa endógena destruido por metanólico H
2O
2, rehidratada y se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-WISP1 IgG (sc-25441, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) diluido a una concentración de 4 mg /ml (01:50) en PBS más 10% de suero de cabra durante la noche a 4 ° C. Un isotipo de IgG normal de conejo se utilizó como control no inmunorreactiva (AB-105-C, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). Para algunas tinciones (S5) anticuerpos primarios a WISP1 humana (LF-185) o suero preinmune y se utilizaron primero diluyeron 1:500 y se incubaron a 4 ° C durante la noche antes de la detección. Las secciones se contratiñeron con verde de metilo y áreas de inmunotinción positiva evaluados por al menos dos investigadores independientes. Para la tinción TRAP, el kit de TRAP /ALP tinción (# 294-67001, Wako, Osaka, Japón) se utilizó siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Análisis Suero
El suero de los pacientes con grados definidos de cáncer de próstata o de los controles normales se resolvió por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sondaron con un anticuerpo policlonal contra el carboxi-terminal conservada de WISP1 humana (LF-187) mediante procedimientos de transferencia Western estándar. El anticuerpo primario, LF-187, se añadió a una dilución de 1: 2000 seguido después de la incubación y el lavado con un anticuerpo secundario marcado con HRP utilizado a una dilución de 1:10,000. Después de la eliminación de la solución de segundo anticuerpo, la membrana se lavó y se expone al sustrato enzimático quimioluminiscente y las señales se capturaron, digitalizados y analizados mediante una lógica 2200 del sistema Kodak GEL Imaging (Carestream Health Inc., Rochester, NY, EE.UU.). Para cada transferencia, la intensidad neta de la banda correspondiente a la longitud completa WISP1 se normalizó a la señal media de los carriles duplicados que contenían 20 ng de WISP1 recombinante (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EE.UU.).
Animales
ratones inmunodeficientes (nude atímicos-Foxn1nu) fueron adquiridos de Harlan y eran de 8 semanas de edad en el momento del estudio. Un modelo de ratón de cáncer de próstata (próstata transgénico adenocarcinoma de ratón o TRAMP) que sobre-expresa el virus de simio 40 (SV-40 /Tag) de genes de la cepa promotor de próstata probasina específico (PB) se ha generado anteriormente [24] y se utiliza para examinar expresión WISP1 en tejido de la próstata afectada. El fondo genético de los ratones TRAMP era NOD y se obtuvo mediante el cruce de las hembras TRAMP B6 con NOD machos /LTJ para generar una cepa hemizygous F1 para el PB-Tag. Resultantes ratones TRAMP-NOD fueron sacrificados por sobredosis de pentobarbital a las 8 y 16 semanas de edad y de la próstata y las vesículas seminales cosechados para el análisis histológico. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada durante la noche y después se transfirieron a alcohol 70%. tejidos fijados se incluyeron en parafina y se seccionaron a un espesor de 4 micras. Para determinar la densidad mineral ósea relativa de los ratones tratados hormiguero WISP1 se utilizó un densitómetro Lunar PIXImus (GE Medical Systems) diseñado específicamente para los roedores.
La colonización de células PC-3 Luc a sitios distantes por inyección intracardiaca ( IC)
Ocho semanas de edad de sexo masculino ratones NIH /Bg-nu /nu atímicos-XID nude- fueron anestesiados con isofluorano y afeitaron en el lugar de la inyección, que luego se limpió con yodo y alcohol al 70%. entonces A jeringa TB con una aguja de calibre 27 unida se cargó con una suspensión de PC3-Luc (5 × 10
5 células /150 ml de PBS) y la aguja que se inserta verticalmente en el cuarto espacio intercostal. Cuando un destello de sangre se observó en el cubo de la aguja de las células se inyectaron lentamente hasta que el contenido de la aguja estaban vacíos y la aguja se retiró lentamente. Para asegurarnos de que las células se inyectaron correctamente en el ventrículo izquierdo y se difunden por todo el ratón y no, por ejemplo, atrapado en los pulmones (como sería el caso de una inyección en el ventrículo derecho) después de la inyección IC los ratones fueron inyectados inmediatamente con 100 l de una solución de 40 mg /ml de D-luciferina de luciérnaga (Biosynth) por vía intravenosa y la imagen utilizando un Lumina-XR (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Los ratones que mostraron la distribución de las células PC3-Luc a juzgar por la luminiscencia en todo el cuerpo se utiliza a continuación para otros tratamientos. Los ratones se dividieron en tres grupos de tratamiento (n = 6 /grupo) y se inyectaron con células en el día 0. La administración de anticuerpos se llevó a cabo con una dosis de 100 mg mediante inyección IP dos veces por semana, comenzando el día 0 de la inoculación del tumor y continuando durante todo el experimento. Tres grupos consistieron en: 1) los ratones inyectados con 100 l de anticuerpo purificado por afinidad, LF-185, 2) los que recibieron IgG de control, y 3) los 1X dado PBS solo.
In vivo Imágenes
se realizó semanalmente para realizar el seguimiento del crecimiento y la creación de las células tumorales usando un Lumina-XR (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EE.UU.). Antes de la formación de imágenes ratones fueron inyectados con 100 l de una solución 40 mg /ml de D-luciferina de luciérnaga (Biosynth) en PBS por vía intravenosa. Los ratones fueron tratados durante un total de 4 semanas y la zona y cargos de exposición a la luz se cuantificaron como se ha descrito anteriormente. En la cuarta semana, después de análisis de la luciferasa final, los huesos que muestran la colonización por las células tumorales se recogieron y se analizaron usando un sistema de radiografía MX-20 Faxitron con la exposición a 30 Kv durante 40 segundos utilizando película PPL de Kodak con incrustación subsiguiente y el procesamiento para histología e inmunoquímica.
Cultivo de células y RT-PCR
células PC3-Luc [25] son un tipo de cáncer de próstata humano que expresan constitutivamente luciferasa (un regalo del doctor Russell Taichman, Universidad de Michigan de Odontología, EE.UU.). Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) que contiene 10% de SFB (Atlanta Biológicos, Lawrenceville, GA, EE.UU.) y 1% de penicilina solución /estreptomicina (Gibco GlutaMAX-I, Grand Island, Nueva York, EE.UU. ) en un ambiente de 37 ° C de 5% de CO
2 /aire. Las células se pasaron cada 2 días a 85% de confluencia. RT-PCR se realizó en ARNm aislado de células PC3-Luc cultivadas y amplificado utilizando conjuntos de oligonucleótidos correspondientes a WISP1 humano utilizando secuencias y condiciones descritas anteriormente [22].
xenoinjerto
células de cáncer de próstata humana PC3-Luc fueron entregados a los viejos ratones desnudos atímicos Fox1nu 8 semanas por inoculación subcutánea de una suspensión de células tumorales (5 × 10
6 células /200 l de PBS) se contaron en el día 0. en este experimento las células, se resuspendieron en 200 l de PBS frío y se mantienen en tubos estériles sobre hielo húmedo durante el transporte a la instalación para animales. El número óptimo de células para este experimento se determinó midiendo primero el crecimiento general PC3-Luc usando 2 × 10
6, 5 × 10
6 1 × 10
7 células /inoculación en 4 sitios diferentes /ratón . Para la inoculación, las células se extraen en una jeringa de TB con una aguja 25G unida y se inyecta con el lado bisel hacia arriba en el lado dorsal previamente limpiado con alcohol. A continuación, el tamaño del tumor se midió por la pinza o por la actividad de luciferasa relativa usando el Lumina XR como se ha descrito anteriormente. Nuestro estudio piloto mostró que la más baja 2 × 10
6 dosis de PC3-Luc creció lentamente, mientras que la dosis más alta 1 × 10
7 dosis creció muy rápidamente, tanto de los cuales se juzgó a ser sub-óptima para el 4 -Semana evolución en el tiempo previsto para nuestros tratamientos con anticuerpos. La dosis media de 5 × 10
6 era óptima y luego se usa para experimentos posteriores. Tres grupos de tratamiento compuestos de 6 desafiados ratones desnudos por grupo inyecta por vía intraperitoneal (IP) dos veces a la semana, ya sea con 1) 100 g de anticuerpo policlonal purificado por afinidad dirigidos contra WISP1 (LF-185) 2) 100 g de IgG de control se purificó de manera similar o 3 ) PBS sola en un volumen de 100 l. anticuerpos purificados recién preparados se prepararon antes de la inyección en los ratones de prueba. En el curso de los experimentos los tumores se midieron con un calibrador para estimar su tasa de crecimiento relativo y en la cuarta semana, los tumores se recogieron y se pesaron. En un experimento los ratones fueron seguidos durante 6 semanas (S4) con resultados similares. Todos los experimentos con ratones se repitieron al menos dos veces. Al final del experimento algunos tumores se analizaron adicionalmente por la histología y se analizaron para la expresión WISP1 como se describe en la sección anterior "inmunohistoquímica y tinción TRAP".
In vitro de migración
En la migración in vitro Red de las células PC3-Luc fue probada usando BD Falcon FluoroBlok insertos de cultivo celular con orificios de 8 micras (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.). células PC3-Luc en fase de crecimiento logarítmico fueron separados de placas de 100 mm por la tripsina-EDTA, y 2 × 10
4 células se trataron previamente con 100 g /ml de LF-187, anticuerpo IgG o PBS durante 1 hora a 37 ° C en RPMI 1640 sin suero y se añadieron a FluoroBlok insertos de cultivo celular. Se añadió RPMI 1640 que contenía FBS al 5% o 200 /ml WISP1 ng (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EE.UU.) a la cámara inferior, y todo el sistema se incubó a 37 ° C durante 24 horas en 5% de CO
2 . Después de la incubación y la fijación, las células se tiñeron con DAPI (cat#P36935, Molecular Probes, Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.). Las células migradas se examinaron microscópicamente en el lado inferior de la membrana mediante la detección de núcleos DAPI marcado migrados. El número de células en 3 campos enteros aleatorios a 100 aumentos se contó con foto-Pro Plus (MediaCybernetics, Rockville, MD, EE.UU.) y el promedio de tres pozos se determinó.
Análisis estadístico
Una de Student para datos independientes
t-test
se utilizó para comparar control frente a muestras experimentales utilizando el software GraphPad Prism (Prisma 5, GraphPad software, Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) para la migración celular, el crecimiento del tumor y ensayos de luciferasa.
Los valores P Restaurant & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. La distribución de los parámetros medidos para valores WISP1 suero fue evaluada por el D'Agostino & amp; Pearson prueba de normalidad ómnibus. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron mediante
t-test
, mientras que las comparaciones entre tres o más grupos utilizaron una prueba de ANOVA de una sola vía de un Student para datos independientes. La asociación de los niveles de proteína WISP1 con PSA se evaluó mediante una correlación de Spearman.
P
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Protein Expression WISP1 en el tejido del cáncer de próstata y en el suero de los pacientes afectados
El antisuero eran. producido contra un dominio deficiente y altamente conservada de WISP1 (LF-185 y LF-187, respectivamente, véase S1) en conejos y comprobar que es altamente reactivo a WISP1 (S1) e incapaz de una reacción cruzada con otros tres miembros de la familia CCN incluyendo Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 o Nov /CCN3 (S1). A pesar de que no han sido evaluados directamente por Western blot, WISP2 /CCN5 humana y WISP3 /CCN6 no contienen las secuencias de proteínas primarias que podrían razonablemente ser considerados homólogo al péptido humano altamente conservada utilizado para producir LF-185. La ubicación y el nivel relativo de expresión de WISP1 en la próstata y de próstata humanos normales de diversos grados de severidad se evaluó con el LF-185 utilizando biopsias de tejidos obtenidos comercialmente de Biomax ™. En este experimento biopsias de cáncer bajo y alto grado (I era más bajo, IV era más alto) y se tiñeron para inmunohistoquímica usando los antisueros WISP1 y se comparó con la tinción con IgG como control negativo. La evaluación de esta tinción por al menos dos observadores independientes reveló que WISP1 se expresa en mayor medida en el cáncer de próstata en comparación con los controles normales (Figura 1A) y que se encuentra principalmente en el tejido de estroma que rodea el tumor y en cierta medida en el tejido epitelial. Además de esto, la tinción WISP1 fue mayor en las muestras que eran de pacientes con el grado más bajo de cáncer (I) en comparación con aquellos con los grados más altos (IV) de cáncer.
A. Detección inmunohistoquímica de WISP1 en biopsias de pacientes con varios grados de cáncer de próstata. La tinción específica para WISP1 (LF-185) se encontró en el estroma y en el epitelio de los tumores a partir de las puntuaciones más bajas Gleason Grade (grado I) y de forma difusa a lo largo de la altamente metastásico (grado IV) carcinoma neoplásica. B. Una imagen representativa de un ensayo de transferencia Western cuantitativa utilizado para medir los niveles séricos de WISP1 en el suero de sujetos normales (carriles 1-6) y de sujetos con cáncer de próstata (carriles 7-12). C. bandas cuantificados a partir de 20 sujetos normales y 60 pacientes con cáncer de próstata fueron comparadas por
t-test
. D. Las muestras fueron estratificados según el estadio de la enfermedad utilizando el sistema de puntuación TNM y se compararon mediante una prueba de ANOVA. NL, Normal, pT1, pT2, pT3 más baja a la más alta gravedad, LN
+ /SV
+, ganglios linfáticos positivos, vesícula seminal positivo. E. Los niveles de WISP1 fueron estratificados por puntuaciones de Gleason y se compararon mediante la prueba de ANOVA, 5 es la gravedad más bajo, 9 es mayor severidad. F. La asociación de los niveles séricos WISP1 con PSA se analizó mediante la correlación de Spearman (PSA, eje X, WISP1, eje Y). Cada pequeño círculo representa los valores de un único paciente.
Nuestros datos de inmunohistoquímica que muestra que la expresión de WISP1 fue más fuerte en las biopsias de grado más bajo nos llevó a especular que WISP1 en tales tipos de cáncer podría escapar en suero y se detectó usando inmunotransferencia técnicas. Para probar esta hipótesis, las muestras de suero se examinaron mediante transferencia Western usando anticuerpos para WISP1 (Figura 1B). Nuestro análisis mostró que cuando todos los grados se agruparon WISP1 fue significativamente mayor en el suero de pacientes con cáncer de próstata (PCA) en comparación con los controles normales (NL) (Figura 1C). Estas muestras se subdividieron adicionalmente usando el tumor, nodo, metástasis sistema de puntuación (TNM) y mostraron que los niveles relativos de WISP1 fueron significativamente mayores en los pacientes con grados pT2, pT2 y pT3 en comparación con cualquiera NL o a los pacientes que eran los ganglios linfáticos y seminal vesícula positivo (LN + /+ SV) (Figura 1C). Como se predijo, cuando se las muestras de re-evaluado utilizando el sistema de puntuación de Gleason los niveles relativos de WISP1 fueron significativamente mayores en los grados 5-7 en comparación con los grados más avanzados 8-9 (Figura 1E). Curiosamente, cuando se compara con los niveles de PSA había una correlación inversa significativa con WISP1 siendo más alta en las muestras que tenían los niveles más bajos de PSA (Figura 1F).
Expresión WISP1 en el modelo TRAMP de cáncer de próstata
con el fin de confirmar nuestra idea de que WISP1 fue hasta reguladas en el cáncer de próstata se utilizó un modelo de ratón generado anteriormente conocido como vagabundo (transgénico adenocarcinoma de próstata del ratón). Esta cepa de ratones transgénicos comienza a adquirir tejido de la próstata hipoplásico por 8 semanas de edad y a las 16 semanas los tejidos afectados progresan a carcinomas con carga tumoral significativa. próstatas afectados fueron aisladas de los ratones NOD-TRAMP a tempranas (8 semanas de edad) y tardía (16 semanas de edad) etapas de la progresión del tumor y se analizaron para la expresión WISP1 por inmunohistoquímica. En las primeras etapas de la enfermedad WISP1 fue altamente expresado en el tejido hipoplásico que se desarrolla inicialmente en el modelo a esa edad (panel inferior Figura 2A). En los tejidos aislados de ratones 16 semanas de edad, la expresión WISP1 se incrementó aún más con el futuro desarrollo de la hiperplasia (panel central Figura 2B) y, además, se expresó en términos generales en las regiones con carinoma avanzada (panel inferior Figura 2B).
A. localización WISP1 a las 8 semanas de edad en el tejido normal de próstata (panel superior) y el tejido hiperplásico (panel inferior, flecha negro). B. localización WISP1 a las 16 semanas de edad en el tejido normal de la próstata (panel superior), el tejido hiperplásico (panel central, flecha negro) y carcinoma (panel inferior). controles de IgG se muestran a la derecha de cada panel.
Anti-WISP1 El tratamiento reduce la propagación y establecimiento de PC3-Luc distantes del sitio de inyección
células PC3-Luc eran se inyecta en el ventrículo izquierdo de ratones inmunocomprometidos y permitir que se extienda y crecer durante 4 semanas con inyecciones dos veces semanales de la PBS, IgG o anti-WISP1. A continuación se determinaron el número de tumores y la carga total del tumor por su capacidad para emitir luz (luminiscencia) y mostró que el anti-WISP1 redujo significativamente ambos parámetros en comparación con PBS o tratamientos de IgG (Figura 3A y 3B respectivamente). En nuestras manos la línea celular PC3-Luc utilizado en el estudio tenía un alto triopism para el hueso haciendo su camino después de la inyección IC a numerosos sitios del esqueleto, incluyendo la mandíbula, hocico, columna vertebral, fémur, tibia, las costillas, el esternón, la escápula y el cúbito. Sin embargo, también se encontraron otros sitios de la vivienda de células PC3-Luc fuera del esqueleto y se incluyen los tejidos blandos, el corazón, pulmón y testículo comprende approximately10% de todas las metástasis. Una imagen representativa de los tumores formados después de la inyección IC se muestra en (S2) que ilustra estos hallazgos. Cuando se contaron el número de tumores, se encontró que los sitios del esqueleto fueron preferentemente disminuyeron por el tratamiento con anticuerpos WISP1. Específicamente, en los controles, 90% de las metástasis estaban en los tejidos duros y 10% en el tejido blando. Con los tratamientos con anticuerpos WISP1 el número de sitios esqueléticos afectados se redujo a 66% de las metástasis totales con los sitios de los tejidos blandos que componen el 33% de las metástasis totales. Además de número total tumor la carga total del tumor se reduce en por tratamientos con anticuerpos WISP1 comparación con los tratamientos de IgG (Figura 3B). Esto indicó que no sólo la difusión, sino también el crecimiento del tumor se redujo por neutralización WISP1. Para poner a prueba la posibilidad de que podría afectar WISP1 tumor cultiva el próximo evaluó el crecimiento de los xenoinjertos utilizando PC3-Luc.
A. Número total de los tumores desarrollados por ratón tratado con IgG o anti-WISP1 (LF-185). **
p
& lt; 0,01 vs. PBS tratamiento anti-WISP1, la carga tumoral B. Total juzgado por mediciones luciferease relativas por ratón. ***
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. & Lt; 0,001 IgG frente a tratamiento anti-WISP1
WISP1 tratamiento con el anticuerpo reduce el tamaño del PC3-Luc xenoinjertos en ratones inmunodeficientes
los anticuerpos contra WISP1 se utilizaron a lo largo de IgG lado y PBS controles a probar su capacidad relativa para reducir el crecimiento de células de cáncer de próstata que fueron cultivadas bajo la piel de ratones inmunodeficientes. Los animales fueron inyectados dos veces a la semana con anti-WISP1 y el crecimiento del tumor monitorizado durante 4 semanas. Teniendo en cuenta que WISP1 se hace en el hueso que también examinó los ratones utilizando una máquina de escaneo DEXA y mostraron que los ratones tratados con anti-WISP1 tenía ningún cambio significativo en el porcentaje de la densidad mineral ósea, antes y después del tratamiento en comparación con PBS o controles de IgG (S3 ). La tasa de crecimiento del tumor se midió durante el curso del experimento usando calibradores e indicó que los tumores en los ratones tratados con anti-WISP1 se redujeron en tamaño en comparación con PBS o controles de IgG (S4). Cuando los tumores se retiraron al final de los tratamientos y se fotografiaron, estaba claro que los tumores eran más pequeños en los ratones tratados con anti-WISP1, (Figura 4A) y que tenían peso estadísticamente menos en general en comparación con los tumores de los ratones tratados con PBS o IgG (Figura 4B).
A.