Extracto
22Rv1 es una línea celular de cáncer de próstata común usado en los experimentos de xenoinjerto de ratón, así como ensayos de cultivo celular in vitro para estudiar los aspectos de la tumorigénesis del cáncer de próstata. Recientemente, esta línea celular se muestra a albergar múltiples copias de un gammaretrovirus, llamado XMRV, integrado en su genoma. Mientras que el xenoinjerto de cáncer de próstata CWR22 original es libre de cualquier retrovirus, las líneas celulares generadas posteriormente 22Rv1 y CWR-R1, portadoras de este virus y, además, arrojan partículas infecciosas gammaretroviral en su sobrenadante. Aunque XMRV más probable fue generada por los eventos de recombinación en cultivo de células de este virus se ha demostrado para infectar células humanas in vitro y 22Rv1 así como células CWR-R1 ahora se consideran bioseguridad 2 reactivos. Aquí, hemos demostrado que las células con 22Rv1 reducida espectáculo de la transcripción retroviral reduce la angiogénesis tumoral y el aumento de la necrosis del tumor primario derivado de células xenotransplantes en ratones SCID en comparación con la línea celular de sus padres. La presencia de transcripciones XMRV aumenta significativamente la secreción de la osteopontina (OPN), CXCL14, IL13 y TIMP2 en 22Rv1 células. Además, estos datos son compatibles con la invasión de células in vitro y ensayos de diferenciación. En conjunto, nuestros datos sugieren que la presencia de transcritos XMRV contribuye al menos en parte a las características 22Rv1 observadas in vitro e in vivo con respecto a la migración, invasión y angiogénesis tumoral. Proponemos que los datos recibidos con 22Rv1 células o células equivalentes capaces de transportar gammaretroviruses xenotropic Se debe controlar cuidadosamente, incluyendo otras líneas celulares de cáncer de próstata probados para las secuencias virales
Visto:. Stieler K, T Schumacher, Horst AK, Fischer N (2012 ) XMRV induce la migración celular, la expresión de citoquinas y la angiogénesis tumoral: ¿Se 22Rv1 Las células de un cáncer de próstata modelo adecuado? PLoS ONE 7 (7): e42321. doi: 10.1371 /journal.pone.0042321
Editor: Peter Sommer, Instituto Pasteur Corea, República de Corea
Recibido: Abril 23, 2012; Aceptado: 2 Julio 2012; Publicado: 27 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Stieler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es el tipo más común de cáncer en los hombres en las sociedades occidentales con más de 350.000 nuevos diagnósticos de cáncer y más de 90.000 muertes reales por año, únicamente en Europa, representando con ello un problema socio-económico serio. El cáncer de próstata refleja una enfermedad en estadio heterogéneo y multi que proporciona un desafío en el desarrollo adecuado in vitro y en modelos in vivo
En modelos in vitro se basan en algunas líneas celulares de cáncer de próstata disponible [1], que son de origen epitelial.: las líneas de células más comunes utilizados son LNCaP [2], PC3 [3], DU145 [4] y, como un modelo de xenoinjerto común también 22Rv1 células [5]. Estas líneas celulares sirvieron en el pasado, y todavía son comúnmente aplicados, como modelos para la investigación de la progresión tumoral, invasión, metástasis, nuevas estrategias terapéuticas, así como resistencia a los medicamentos. Trasplantadas en ratones inmunodeficientes estas líneas celulares producen tumores que son similares a la tumor parental [5]. Tal en modelos de xenoinjerto in vivo se han establecido utilizando células LNCaP, PC3 22Rv1 o células injertadas en SCID inmunodeficiente, ratones desnudos o NOD-SCID. En ausencia de un modelo ideal de ratón que exhiben hiperproliferación y la hiperplasia de las células epiteliales (intraepitelial prostática neoplasia, PIN), PIN de alto grado (PIN de alto grado), los adenocarcinomas y los carcinomas de próstata invasivo (ratones, naturalmente, no se desarrollan PC), experimentos de xenoinjerto de ratón utilizando tejidos rodajas o líneas celulares de cáncer de próstata humano son ampliamente utilizados.
22Rv1 se deriva de un tumor CWR22 xenoinjertado recidivante que se ha trasplantado en serie en ratones desnudos [5]. En 2009, se han demostrado las células 22Rv1 para llevar a múltiples copias integradas del XMRV gammaretrovirus (virus relacionado con el virus de la leucemia murina xenotropic); estas células producen altos títulos de virus en el sobrenadante del cultivo [6]. El trabajo reciente proporciona pruebas de que dos líneas celulares generadas a partir de un tumor de xenoinjerto CWR22, 22Rv1 (CWR22Rv1) y CWR-R1, producen partículas infecciosas XMRV en su sobrenadante [7].
XMRV ha sido identificado originalmente en el tejido de la próstata a partir de pacientes con cáncer de próstata familiar [8]; trabajos posteriores proporcionan evidencia de expresión de la proteína XMRV en hasta un 23% de todos los casos de cáncer de próstata [9]. Sin embargo, varios estudios no lograron detectar el XMRV en muestras de cáncer de próstata mediante PCR o métodos IHC [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19] Debido a la falta de variabilidad de secuencia de fragmentos de genes XMRV en los aislados de los pacientes en comparación con la variabilidad de secuencia identificada en una línea celular positiva XMRV 22Rv1 se postuló que el XMRV podría ser un contaminante de laboratorio en lugar de un verdadero virus humano exógeno [20]. Estos datos se ven reforzados por los datos recientes de Paprotka y colegas que analizan diferentes pasajes de xenoinjertos CWR22: XMRV está presente en las células y las células 22Rv1 CWR-R1, sin embargo, los primeros pasajes del xenoinjerto CWR no llevan ningún secuencias XMRV detectables. Estos datos están a favor de un evento de recombinación durante los pases de xenoinjerto de CWR22, generando de ese modo XMRV [7].
22Rv1 células son un modelo preclínico de uso común de cáncer de próstata [21], [22], [23] . Sólo recientemente, esta línea celular fue clasificada como una línea celular de nivel 2 de bioseguridad. Esta línea celular produce altos títulos de partículas gammaretroviral xenotropic que pueden infectar las células humanas [6], [7]; células ratones endogámicos por lo general llevan una mutación en el receptor de estos virus, llamado Xpr1, y no son permisivas para este grupo de virus. Sin embargo, ciertas células de ratón (ratones salvajes y algunas cepas puras que llevan el alelo receptor apropiado [24], [25]) pueden ser infectados con el virus. Precaución para la interpretación de los datos como consecuencia exclusivamente de las células portadoras del virus 22Rv1 se han discutido anteriormente [26] Sin embargo, no tratan directamente en in vivo o in vitro experimentos.
En este estudio hemos analizado la relación de causalidad entre el gammaretrovirus XMRV y el fenotipo transformado de las células 22Rv1 usando ensayos in vitro utilizan comúnmente para estudiar la proliferación celular, la migración y la diferenciación mediante la comparación de 22Rv1 células y 22Rv1 células con títulos reducidos virales en xenoinjertos experimentos con ratones, la migración in vitro, la invasión y ensayos de formación de tubo. Ofrecemos pruebas de que el XMRV gammaretrovirus contribuye significativamente a la tumorigénesis xenoinjertos de 22Rv1 en ratones. Estas observaciones son compatibles con los resultados in vitro que demuestran diferencias en la liberación de citoquinas en las células infectadas con células 22Rv1 XMRV y 22Rv1 con transcripciones virales reducidos. Por otra parte, aportar pruebas de que la infección por XMRV en los fibroblastos del estroma de la próstata induce significativamente cambios en la liberación de citoquinas. Observamos diferencias en la migración celular de las células LNCaP cuando se utiliza en in vitro de migración celular y la invasión ensayos junto con sobrenadante de cultivo de las células del estroma infectadas con XMRV; sobrenadante de las células infectadas con gammaretroviruses anfotrópicos o XMRV env pseudotyped virus como partículas no influye en la migración celular de las células LNCaP que indican que esto afecta es específico para el XMRV y no depende de la interacción del receptor o la señalización del receptor.
En resumen, nuestra resultados indican que la capacidad transformadora de células 22Rv1 es fuertemente dependiente de la presencia de XMRV. Por lo tanto, los resultados obtenidos en experimentos con células 22Rv1 con respecto a la tumorigénesis del cáncer de próstata tienen que ser validados en otras líneas celulares de cáncer de próstata virus negativo.
Resultados
La línea de células epiteliales de próstata 22Rv1, deriva de un xenoinjerto de carcinoma de próstata humano en ratones inmunodeficientes, contiene varias copias de la XMRV gammaretrovirus integrado en el ADN de la célula huésped. XMRV se replica activamente en esta línea celular que resulta en sobrenadante que contiene el virus infeccioso [6], [7]. 22Rv1 células se han utilizado en los experimentos de xenoinjerto de ratón en el pasado sin saber que un virus infeccioso se shedded por esta línea celular. A pesar de que XMRV más probable es que no es un virus que circula en la población humana se analizó la contribución de este virus a características de la línea celular:. Migración celular y la liberación de citoquinas, así como la progresión tumoral en ratones inmunodeficientes
xenoinjertados 22Rv1 los tumores en ratones SCID con transcripciones virales reducidos son altamente necrótico y muestran menos la formación de vasos
Hemos establecido una línea celular 22Rv1 con cantidades reducidas resultantes de transcripción XMRV en partículas virales infecciosas menos en el sobrenadante del cultivo. Se combinaron dos shRNAs diferentes dirigidas a dos regiones diferentes en la región de XMRV LTR (Figura 1A). horquillas estables que contienen las secuencias de shLTR1 y shLTR2 (Tabla S1) se clonaron individualmente en el vector lentiviral LEGO G-puro [27]. partículas virales pseudotyped que contienen sobrenadante de ambos shRNAs que contienen ARN lentiviral se utilizó para la infección de células 22Rv1, que fueron tratados posteriormente con puromicina para seleccionar las células que expresan shRNA. Para descartar la selección específica de eventos de integración individual, la selección mayor en lugar de la selección clonal solo se llevó a cabo, así como se generó sobrenadante de control que contiene partículas virales pseudotyped lentiviral con el plásmido parental LeGo G-puro y sin shRNA inserto. Como se muestra en la Figura 1B Gag p30 /CA (cápside) los niveles de expresión de proteínas se redujeron significativamente, así como la cantidad de partículas infecciosas derramada en el sobrenadante se redujo considerablemente en shLTR1 + 2 22Rv1 expresando células (Figura 1C). El uso de estas células en xenoinjerto en experimentos in vivo, con un total de seis ratones SCID por grupo shRNA fueron inyectados por vía subcutánea con 2 × 10
6 células en matrigel en cada flanco lateral. aparición del tumor y el peso se controló durante 36d. No observamos diferencias significativas en el inicio del crecimiento del tumor entre las células de control 22Rv1 y células que expresan 22Rv1 shLTR1 + 2 como se juzga mediante inspección visual todos los días y el control de peso de los ratones (datos no presentados). Después 36d, se sacrificaron los ratones y se analizó el peso del tumor, necrosis, así como la formación de vasos. El peso de 22Rv1 shLTR1 + 2 tumores se redujo significativamente (Figura 2A panel izquierdo) en comparación con los tumores de control. Estos tumores muestran grandes áreas de necrosis (como se ve en el panel de la izquierda la figura 2B, Figura S2A (células de control) y S2B (22Rv1 shLTR1 + 2)) y mostraron un número significativamente menor número de buques cuando se realiza la tinción inmunohistoquímica aplicación de un anticuerpo monoclonal CD34 a las secciones de tejido tumoral ( Figura 3A paneles superior y la figura 3B) en comparación con los controles.
(a) representación esquemática de XMRV región LTR y 5 'UTR de Gag. La localización de shRNAs utilizados para reducir las transcripciones XMRV en 22Rv1 células se muestra como flechas. Tres secuencias diferentes, shLTR1 (región R), shLTR2 (región U5) y shLTR3 (ubicados dentro de poco abajo del sitio donante de empalme (SD)) fueron elegidos utilizando la herramienta en línea siRNA Buscador de destino del Ambion. (B) 22Rv1 células transducidas con el sobrenadante lentiviral que contiene el shRNAs indicado y puromicina seleccionado: 22Rv1 shLTR1 + 2 células muestran redujo significativamente la proteína p30 (CA) en el análisis de Western Blot en comparación con las células control. Actina se utilizó como control de carga. (C) PCR en tiempo real para determinar la cantidad relativa de partículas infecciosas en el sobrenadante del shRNA transducidas 22Rv1 células.
ratones SCID (n = 6) fueron por vía subcutánea inyectado con 22Rv1 shLTR1 + 2, shLTR3 o con 22Rv1 células de control. Para cada línea celular tumoral de la cantidad final fue de n = 12. 36d p.i. los ratones fueron sacrificados y los tumores se analizaron para determinar el peso (A) y la necrosis (B).
(A) tinción inmunohistoquímica para CD34 reveló formación de vasos sanguíneos rudimentaria en XMRV derribar los tumores, mientras que los tumores de control de 22Rv1 display surgió estructuras de la angiogénesis. (B) CD34
+ áreas en los tumores se cuantificaron en control y tumores shLTR3 (n = 10 cada uno). Los porcentajes de CD34
+ áreas se expresan en relación con las áreas totales analizados.
Para descartar que las diferencias observadas son una consecuencia de los llamados efectos puntuales objetivo de shRNAs dirigidos transcripciones XMRV o selección clonal de un evento de integración individual, tercera shRNA con secuencias complementarias a la región 5'GAG (229-250, NC_007815) (Figura 1A) se clonó en el plásmido LEGO G-puro. De manera similar a las células 22Rv1 transfectadas con shLTR1 + 2, las células 22Rv1 expresan shLTR3, mostraron una reducción significativamente p30 CA /gag niveles de expresión de proteínas (Figura 1B, carril 3 y 4) y hasta el 80% de partículas virales menos infecciosas en el sobrenadante del cultivo (Figura 1C) en comparación con las células control. La inyección de estas células en cada flanco de seis ratones SCID no redujo el punto de crecimiento del tumor tiempo, así como no hubo ningún cambio significativo en el peso del tumor como se observa para shLTR1 + 2 (Figura 2A, panel derecho). Sin embargo, hemos observado grandes áreas de necrosis en los tumores 22Rv1 shLTR3 (Figura 2B, panel derecho). Mientras que los tumores de 22Rv1 shLTR1 + 2 mostraron sólo pequeñas diferencias en el tamaño de las áreas necróticas, estas diferencias fueron estadísticamente significativas en los tumores inducidos con células 22Rv1 shLTR3. Del mismo modo, CD34 tinción demostrado disminución de la formación de vasos en base a CD34 tinción positiva IHC en los tumores inducidos por células 22Rv1 shLTR3 en comparación con el control de los tumores (Figura 3).
Estos experimentos indican que las características de xenoinjertos 22Rv1 en ratones inmunodeficientes dependen parcialmente en la producción de la XMRV gammaretrovirus en estas células.
22Rv1 células que expresan shLTR1 + 2 difieren en citoquinas patrón de expresión en comparación con células parentales
sobrenadantes de cultivo de células de control 22Rv1, infectados con sobrenadante pseudotyped lentiviral que contiene el plásmido vacío puro LEGO G y de 22Rv1 shLTR1 + se recogieron y se ensayaron para citocinas mediante el uso de un procedimiento en fase sólida inmunotransferencia (RayBio citoquinas Human Antibody matriz 5; RayBiotech) 2 células (Figura S3). Los sobrenadantes se aplicaron a membranas que contienen anticuerpos a 80 citoquinas humanas. Las pequeñas diferencias de la liberación de citoquinas a partir de estas células se detectaron (Figura S3). En 22Rv1 células con niveles de transcripción XMRV reducidos, osteopontina (OPN), inhibidor tisular de TIMP2 matrixmetalloproteinase y IL13 se redujeron ligeramente, mientras que se aumentó el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).
Usando cuantitativa en tiempo real PCR para el ARNm indicada transcripciones que confirmaron estos hallazgos: OPN, TIMP2 y expresión IL13 se redujeron significativamente en las células que expresan 22Rv1 shLTR1 + 2 mientras que la expresión de HGF se incrementa considerablemente (Figura 4). Además, se evaluó la expresión de MMP9 expresión de metaloproteinasas de matriz y CXCL14 en las células 22Rv1 y 22Rv1 shLTR1 + 2 células. Si bien no se encontraron diferencias en la expresión de ARNm MMP9 en estas líneas celulares (datos no mostrados), la expresión de CXCL14 se redujo significativamente en las células 22Rv1 shLTR1 + 2.
El ARN total del control 22Rv1 y 22Rv1 shLTR1 + 2 se analizó para determinar los niveles de expresión de ARNm de las citoquinas indicadas por QRT-PCR. Los datos se normalizaron en contra de tres genes del hogar (GAPDH, TBP, RLP13).
De Novo La infección de próstata estroma de fibroblastos con XMRV replicación competente Las diferencias en la expresión de citoquinas inducidas
Para analizar si la las diferencias observadas en la expresión de citoquinas y liberación es de tipo celular dependiente, analizamos la expresión de citoquinas y liberación en los fibroblastos del estroma de la próstata (PRSC) infectados con el XMRV replicación competente derivado de las células LNCaP transfectadas con el ADN proviral XMRV VP62. PRSC fueron aisladas de tejido de la próstata por la colagenasa digestión y el cultivo en medios selectivos como se ha descrito recientemente [28], [29]. células superando se expandieron y se confirmaron mediante tinción con FACS para la expresión de α-SMA (actina de músculo liso) y vimentina (marcadores de fibroblastos estromales activados) y la falta de expresión de citoqueratina [28]. Sólo los números de paso de bajos de estas células se utilizaron en experimentos de infección XMRV. 2d pasado sobrenadante infección de XMRV infectados CALP o células infectadas simuladas se aplicó a una membrana comerciales arrays de anticuerpos (RayBio; véase la figura S4). infección XMRV de las células fue confirmada por PCR específica XMRV gag (datos no mostrados). De los 60 citoquinas analizadas por anticuerpos matrices de membrana y ocho (GRO, GRO, TIMP1, TIMP2; HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13) son expresados diferencialmente por XMRV infectada, en comparación con el simulacro de las células infectadas. Mientras GRO y GRO transcripciones fueron hasta reguladas en el sobrenadante de las células infectadas por el PRSC XMRV, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13, se redujo TIMP1 y TIMP2 expresión.
Para confirmar los resultados obtenidos por los arrays de anticuerpos de citoquinas y de excluir las diferencias en la preparación de células de fibroblastos del estroma de próstata primarios, se realizó en tiempo real los experimentos de PCR cuantitativa utilizando dos líneas de fibroblastos del estroma diferentes PRSC obtenidas de diferentes pacientes (Figura 5). Las células se infectaron con sobrenadante de cultivo que contiene XMRV competente replicación derivado de células LNCaP transfectadas con DNA proviral VP62 XMRV [30], [31]; Se extrajo el RNA total, DNaseI tratada y posteriormente se analizó mediante qRT-PCR para las diferencias en la expresión de citoquinas. Si bien hemos sido capaces de confirmar los resultados obtenidos por la matriz de Ab GRO, IL13 y TIMP1, no hemos podido confirmar nuestros datos preliminares para TIMP2, HGF y IGFBP4. TIMP2 y IGFBP4 expresión aumentó en respuesta a la infección por XMRV y la inducción de la expresión de HGF se observó solamente en las células PrSc29, mientras que las células PrSc5 mostraron el efecto contrario
.
próstata Primaria fibroblastos del estroma (PRSC) fueron infectados con el XMRV que contiene sobrenadante de LNCaPi células o con sobrenadante de simulacro. El ARN total se analizó para determinar los niveles de expresión de ARNm de diferentes citocinas por QRT-PCR. Los datos se normalizaron en contra de tres diferentes genes de limpieza e ilustran como la expresión génica relativa en comparación con burlarse de las células infectadas en cada punto de tiempo individual.
liberación de citoquinas En función de XMRV replicación Influencias de invasión y la formación in vitro del tubo
se realizaron
Para obtener una comprensión mecanicista de las diferencias observadas en la liberación de citoquinas de las células epiteliales o estromales de próstata infectadas con XMRV, varios estudios in vitro. No se observaron diferencias en la proliferación celular entre infectada (control 22Rv1 shRNA y 22Rv1 shLTR1 + 2 o PRSC infectadas y las células PRSC que solicitan un ensayo de MTT (Figura S1) no infectado. A continuación, se investigó si las células XMRV infectados podrían promover la migración de células LNCaP de una manera paracrina. fibroblastos del estroma de próstata primario, ya sea simulada o XMRV infectadas se sembraron en el compartimiento inferior de una placa de cámara de 24-transwell. a través de una membrana permisiva liberan citoquinas afectan directamente a la invasividad de las células LNCaP. Utilizando este ensayo se realizó un curso en una infección XMRV, que se muestra en la Figura 6A. infección XMRV de los resultados del estroma de fibroblastos en aumento estadísticamente significativo de la migración de las células LNCaP que se aumenta, además, en las células infectadas para el período de tiempo (28d) más largo. Este aumento es específico para XMRV desde un MLV relacionada (MoMCF, un MLV anfotrópico usando TIF2 como receptor) no resultó en una mayor cantidad de la migración de las células LNCaP (Figura 6B). Curiosamente, la replicación del virus incompetente como partículas pseudotipados con env XMRV no dio lugar a un aumento de la migración de células LNCaP (Figura 6B ) lo que sugiere que los acontecimientos independientes de la unión al receptor y la señalización contribuir al fenotipo observado
.
(a) fibroblastos estromales primarias (PRSC) 8d o 28d pi con XMRV se sembraron en el compartimiento inferior de una cámara de invasión. Invasividad de las células LNCaP se calculó en tres experimentos independientes realizados por duplicado. (células B) PRSC infectadas con xenotropic MLV (XMRV) inducir la invasión de células de cáncer de próstata in vitro, mientras que las células del estroma infectadas con MoMCF anfotrópico o virus pseudotyped XMRV env como partículas no aumentan la invasión de las células LNCaP. infección XMRV (C) y (D) induce la formación de tubos de células HMEC. Las células sembradas en matrigel se incubaron con sobrenadante de cualquiera de XMRV o fibroblastos estromales infectados de forma simulada y la formación del tubo fue seguido por 5 h. imagen representativa de la formación de tubos observado se muestra en (C). (D) La cuantificación de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Imágenes de tres diferentes campos visuales por pocillo se analizaron para determinar la longitud del tubo (20 tubos por campo) con la función gobernante Adobe Photoshop
Además, se realizaron ensayos de angiogénesis in vitro:. Se analizó la formación del tubo utilizando sobrenadantes de cualquiera de XMRV o células falsamente infectadas como un estimulante ya que contenían expresados diferencialmente /o diferentes niveles de citocinas pro-angiogénicos. Se añadió el sobrenadante del cultivo de los fibroblastos del estroma de la próstata a las células HMEC en la formación de matrigel y el tubo fue seguido durante 5 horas. Los cambios en la liberación de citoquinas en respuesta a la infección por XMRV aumentaron significativamente la longitud de la red capilar formada por las células HMEC (Figura 6C y D), lo que concuerda con nuestros resultados in vivo.
Discusión
Nuestro estudio demuestra que gammaretroviruses xenotropic, que han sido identificados con frecuencia en líneas celulares de cáncer, establecidos por los que pasa a pesar de ratones desnudos, no sólo corren el riesgo de infección, pero también podría influir significativamente en los datos experimentales recibidos con estas líneas celulares. En particular, la línea celular de cáncer de próstata 22Rv1 utiliza comúnmente en el cáncer de próstata en los estudios in vitro, así como modelos de xenoinjerto in vivo lleva varias copias de XMRV integrado y activamente arroja virus infeccioso en su sobrenadante.
XMRV fue inicialmente identificado en el tejido de cáncer de próstata humano y su asociación con patologías humanas se ha sugerido en los últimos años. generando de este modo los datos recientes que sugieren una recombinación de secuencias XMRV ratón de dos antepasado, llamado Pre-XMRV1 y Pre-XMRV2, en cultivo celular XMRV [7] junto con varios estudios no detectar secuencias de XMRV en muestras humanas [11], [12], [ ,,,0],14], [17], [18], [20], [32], [33], [34], [35], [36], [37] cuestionar una asociación de XMRV con enfermedades humanas.
Sin embargo, el análisis del potencial de transformación XMRV es de gran interés ya que 22Rv1 células y células CWR22-R1 producen virus infecciosos y son un modelo generalmente aceptado modelo in vitro, así como modelo de xenoinjerto para estudiar la tumorogénesis del cáncer de próstata, la progresión, los biomarcadores y la desarrollo de estrategias terapéuticas.
en el presente estudio hemos generado una línea celular 22Rv1 con la reducción de las transcripciones XMRV y los niveles de proteína viral mediante la aplicación de la orientación shRNA dos regiones diferentes en la región LTR XMRV. en vivo experimentos mostraron que los tumores inducidos por células con 22Rv1 reducidos transcripciones XMRV fueron muy necrótico y mostraron significativamente menos vascularización a juzgar por la tinción de CD34 (Figura 3) y CEACAM-1 tinción (datos no mostrados). Para excluir la selección del sitio de integración, así como de destino shRNA off afecta estos experimentos se repitieron usando experimentos independientes de infección 22Rv1 Lego-shXMRV LTR, así como el uso de diferentes secuencias de ARNhc dirigidas a tercera región en XMRV (shLTR3). En contraste con los experimentos utilizando 22Rv1 shLTR1 + 2 células, no se observaron diferencias significativas en el tamaño del tumor que pueden ser debido al pequeño número de animales por grupo. Alternativamente, las diferencias observadas en el tamaño del tumor en el primer conjunto de experimentos de xenoinjertos utilizando shRNA secuencias dirigidas a las regiones LTR 59-79 y 103-125 podría ser una consecuencia de los llamados fuera de objetivo efectos en las células. Se señala que en lugar de shRNA contra secuencias de luciferasa u otros generalmente no se encuentran en el genoma humano, un vector lentiviral vacío se utilizó para generar el control de sobrenadante lentiviral posteriormente utilizado para transducir células 22Rv1. Por lo tanto, no podemos excluir una saturación de los componentes de la maquinaria siRNA dando lugar a efectos no específicos. Sin embargo, no se observó ningún fenotipo, aumento de los niveles de apoptosis, la reducción de la viabilidad de las células, que se ha descrito que se correlaciona con efectos inespecíficos causados por saturación de la vía de siRNA [38]. Fuera de objetivo efectos fueron descartadas mediante la repetición de los experimentos con animales con una tercera región, diferente en el genoma XMRV como una secuencia shRNA.
No hay formación de metástasis en los pulmones, el bazo y el hígado, así como la metástasis ósea se detectó en los ratones de control, así como los ratones Shltr (datos no mostrados). Además, los tumores no varían en el estado de diferenciación, la organización de células del estroma Tampoco los tumores muestran diferencias en la infiltración de leucocitos, reflejados por la presencia relativa de CD18
+ leucocitos (datos no mostrados). Curiosamente, tanto conjunto de experimentos de xenoinjerto (shLTR1 + 2, así como shLTR3) reveló redujo la vascularización y áreas de necrosis aumentó. Dado que no hemos creado un virus XMRV con un sitio de destino cambiada de los shRNAs aplicadas que podríamos usar para complementar 22Rv1 células transducidas con shLTR3, es posible que el observado in vivo e in diferencias in vitro de estas células son una consecuencia de leer a través de o XMRV recombinante y transcripciones celulares.
estudios recientes han sugerido funciones importantes de citoquinas en diversos aspectos del crecimiento tumoral. La mayoría de las citoquinas identificadas en nuestros ensayos se han descrito para influir en la formación microambiente tumoral durante la tumorigénesis de próstata. GRO /GRO (CXCL1), un miembro de la familia de las quimiocinas CXC, promueve la angiogénesis y recluta neutrófilos y células endoteliales durante la progresión maligna en el cáncer de próstata. La expresión aberrante de HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) y su receptor, c-Met, a menudo se correlacionan con estadios avanzados de cáncer de próstata. Del mismo modo, IGFBP2 y 4 (insulina como factor de crecimiento de unión a proteínas 2 y 4) son biomarcadores para los estadios avanzados de cáncer de próstata. inhibidores tisulares de matrixmetalloproteinases (TIMP) tienen, independientemente de su función - la inhibición de la actividad de la proteinasa de MMP (matrixmetalloproteinases) se ha descrito como factores que intervienen en la progresión del tumor: TIMP 1 y 2, tanto inhibir la apoptosis de las células tumorales; TIMP 1 promueve la angiogénesis tumoral y TIMP 2 acelera la progresión del tumor
liberación de citoquinas inducida por XMRV no parece ser específica de las células epiteliales del tumor sino que también se puede observar mediante los fibroblastos del estroma de próstata (Figuras 5; S4).. Nos gustaría señalar que en estos experimentos XMRV poblaciones virales derivados de células LNCaP transfectadas con el ADN proviral VP62 XMRV fueron utilizados. No nos secuenciar el virus de la población derivada de células LNCaP infectados de novo para descartar transformación aguda variantes derivadas XMRV por eventos de recombinación como recientemente publicado [39].
infección por XMRV de fibroblastos del estroma resultó en un aumento estadísticamente significativo de la migración células LNCaP que se incrementó además en las células infectadas por un plazo mayor de tiempo (28d). Este aumento podría ser específico para XMRV y depende de la replicación XMRV: a MLV relacionado (MoMCF, un MLV anfotrópico usando TIF2 como receptor) no resultó en una mayor cantidad de células LNCaP que migran (Figura 6B). Curiosamente, el sobrenadante de las células infectadas con partículas pseudotyped replicación defectuosa XMRV-env no dio lugar a cambios en la migración celular que sugiere que la unión no contribuye a los cambios observados receptor.
En general, nuestras observaciones están en concordancia con algunos aspectos de los datos recientemente publicados que muestran que la infección por XMRV de células LNCaP promueve la proliferación, la transformación y la invasividad de estas células in vitro [40], así como se ha demostrado recientemente que la infección XMRV puede inducir apoptosis en algunas líneas celulares humanas [41]. Si bien también se observa un aumento de la capacidad de invasión de las células cuando se incubaron con sobrenadante de cultivo de células XMRV infectados, no se observó un aumento de la proliferación debido a la infección por XMRV, ni 22Rv1 células transducidas con shRNAs transcripciones de orientación XMRV (Figura S1) ni las células LNCaP o las células del estroma infectados con el XMRV (datos no mostrados) mostraron una disminución o un aumento en la tasa de proliferación
no se observan diferencias en los niveles de mRNA MMP9 como consecuencia de la infección por XMRV como recientemente publicado [40].; aunque se observó una reducción de la liberación TIMP2 de las células infectadas con XMRV PRSC. Desde MMP están regulados principalmente en los niveles de proteína no podemos excluir diferencia en la actividad MMP9. arrays de anticuerpos de citoquinas usadas aquí no incluían MMP9 o MMP-2, así como no se incluyeron técnicas zimografía para probar las diferencias en la actividad de la proteína o MMP9 MMP2. Se entiende que la velocidad y extensión de la angiogénesis es un componente crítico de la progresión tumoral. El mecanismo exacto por el cual el XMRV puede afectar la angiogénesis, la formación de vasos y las diferencias en la liberación de citoquinas no se entiende.
contaminación Retrovirus parece ser frecuente entre las líneas celulares ampliamente utilizados [11], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. La presencia desconocida de los retrovirus en líneas celulares de lado el riesgo de peligro biológico podría afectar los resultados de los experimentos. Estudios recientes demuestran claramente que las líneas celulares humanas, incluyendo líneas celulares de cáncer de próstata comúnmente llevan secuencias gammaretroviral [6], [20], [48]. Para algunos de ellos la formación de partículas infecciosas se ha demostrado: la línea de células T humanas Jurkat J6, lymphoblastoid línea celular A3.0 /F7 [47], la línea de células B DG75 [45] y las líneas celulares de cáncer de próstata LAPC4, VCAP y EKVX [6], [48]; Sin embargo, en solo algunos ejemplos la consecuencia sobre el resultado experimental se ha demostrado [44], [47], [49]. Llegamos a la conclusión que los resultados experimentales obtenidos in vitro o in vivo llevado a cabo con líneas de células positivas de retrovirus (en particular 22Rv1 o CWR-R1) podría reflejar propiedades moleculares del virus en lugar de las características específicas del tipo celular. Por lo tanto, el estado retroviral de líneas celulares utilizados en los experimentos debe ser proporcionada, así como los ensayos (incluidos los experimentos in vivo de xenoinjertos) debe ser validado utilizando múltiples líneas celulares.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
La líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP (ATCC#CRL-1740) y 22Rv1 (ATCC#CRL-2505) se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% FCS, 5% de penicilina /estreptomicina y L- glutamina. Condiciones similares se aplicaron a shRNA tratados 22Rv1 células. TE671 (ATCC#CRL-8805) y las células 293T (ATCC#CRL-11268) se cultivaron en DMEM Glutamax (Gibco) suplementado con 10% FCS, 5% de penicilina /estreptomicina. células HMEC (Lonza) se cultivaron en Medio de crecimiento celular endotelial MV2 (PromoCell). Se establecieron líneas de células del estroma (PRSC) como se describe [29], [50], [51].