Extracto
Una solución estructura de RMN de alta calidad se presenta para la proteína hMcl- 1 (171 a 327) que comprende los residuos 171-327 de la proteína anti-apoptótica humano MCL-1 (HMCL-1). Dado que esta construcción contiene la secuencia de motivos tres Bcl-2 de homología (BH), que participan en la formación de un sitio de unión para los inhibidores de HMCL-1, se considera que es crucial para el diseño basado en la estructura de nuevos fármacos contra el cáncer de bloqueo relacionada la MCL1 vía anti-apoptótica. Mientras que las coordenadas de una estructura de la solución de RMN para una construcción correspondiente del homólogo de ratón (MMCL-1) están disponibles al público, nuestra estructura es la primera estructura de resolución atómica reportado para el "apo forma 'de la proteína humana. La comparación de las dos estructuras revela que HMCL-1 (171 a 327) presenta una ranura algo más ancha ligando /inhibidor de la unión, así como una distribución de carga diferente dentro del surco de unión BH3. Estos resultados sugieren fuertemente que la disponibilidad de la estructura humana es de importancia crítica para apoyar el diseño futuro de fármacos contra el cáncer
Visto:. Liu G, L Poppe, Aoki K, Yamane H, J Lewis, Szyperski T (2014 ) de alta calidad RMN estructura de la proteína humana anti-apoptótica de dominio MCL-1 (171-327) para el cáncer de Diseño de Fármacos. PLoS ONE 9 (5): e96521. doi: 10.1371 /journal.pone.0096521
Editor: Annalisa Pastore, Instituto Nacional para la Investigación Médica, Medical Research Council, Londres, Reino Unido
Recibido: 17 de diciembre de 2013; Aceptado: 8 Abril 2014; Publicado: May 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por Amgen Inc. (www.amgen.com). LP, KA, HY y JL son empleados de Amgen Inc. y Amgen Inc. jugaron un papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este estudio fue financiado por Amgen Inc., pero no hay ningún interés en competencia que puede sesgar este trabajo. Esta afiliación no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El mal funcionamiento de la apoptosis celular [1] es una característica importante de cáncer. La regulación de la apoptosis depende de la familia de proteínas Bcl-2 que contienen uno o varios Bcl-2 de homología (BH) motivos de secuencia. Sobre la base de su función y de la similitud de sus respectivos motivos de secuencia de BH, estas proteínas se pueden agrupar en tres clases [2], [3]: (i) multi-dominio proteínas pro-apoptóticas tales como Bax y Bak, (ii) Anti (es decir, pro-supervivencia) proteínas -apoptotic como MCL-1, Bcl-1, Bcl-x
L, Bcl-w y Bfl-1 /A1, todos los cuales exhiben una arquitectura similar como Bax y Bak, y (iii) varias proteínas pro-apoptóticos que comprenden sólo una única secuencia motivo BH3 como Bid, Bad, Bim, Puma, Noxa, Hrk, BMF y Nbk /Bik ( 'BH3-sólo' proteínas). El motivo BH3 de clase (iii) proteínas forma un α-hélice anfipática que interactúa específicamente con un bolsillo hidrofóbico formado en tanto clase pro-apoptóticos (i), y la clase anti-apoptótica (ii) las proteínas con la participación de sus respectivos motivos BH [ ,,,0],2], [3]. La inhibición de la formación del complejo proteína-proteína resultante ofrece una estrategia prometedora para tratar el cáncer. Por ejemplo, la molécula pequeña de Bcl-2 antagonista de ABT-737 [4] inhibe la clase anti-apoptótica (ii) las proteínas Bcl-x
L, Bcl-w y Bcl-1, y un congénere [5] que pueden ser administrado por vía oral se encuentra actualmente en ensayos clínicos.
el anti-apoptóticos y pro-supervivencia-350 residuo de proteína MCL-1 ( "células de leucemia mieloide-1 ') [2] está anclado principalmente en la membrana mitocondrial externa por un dominio transmembrana C-terminal y contiene tres dominios BH secuencia: BH3 (residuos 209-223), BH1 (252-272) y BH2 (residuos 304-319) [2]. MCL-1 inhibe la muerte apoptosis receptor inducida por unirse selectivamente a hacer una oferta truncado (tBid) [6] y puede secuestrar endógeno Bak para bloquear la muerte celular mediada por Bak. Por otra parte, MCL-1 interactúa con varias proteínas BH3-only (Bim, Bid y Puma, Noxa y Bak). Por lo tanto, MCL-1 juega un papel temprano en respuesta a las señales que dirigen o bien la supervivencia celular o muerte celular [2] y se ha demostrado ser hasta reguladas en numerosos tumores malignos. Los enfoques que se deroga la función anti-aptototic el de MCL-1, ya sea mediante la reducción de su abundancia o inactivando su BH3-funcional de unión al surco muestran una gran promesa para el tratamiento del cáncer [2], [4], [6], [7]. Aquí presentamos la estructura de la solución de RMN de alta calidad del segmento de polipéptido 171-327 de MCL-1 humana (HMCL-1), que comprende los tres motivos BH consideran cruciales para la estructura basada en el diseño de fármacos.
Resultados y discusión
Una estructura de RMN de alta calidad de HMCL-1 (171-327) se obtuvo (Tabla 1) y las coordenadas fueron depositados en el AP [8] (2mhs código de acceso). La estructura se compone de siete hélices α-α1-a7 (residuos 173-191, 204-235, 240-253, 262-280, 284-301, 303-308 y 311-319) dispuesto para formar la característica 'Bcl-2 de núcleo 'estructura [9] (Figura 1). Las hélices son local y globalmente bien definido, mientras que el C-terminal (residuos 320-327) y los bucles que conectan, respectivamente, hélices α1 y α2, hélices α3 y α4, y hélices α4 y α5 son flexible desordenada. El centro de α4 hélice está rodeada por las otras seis hélices, con α1, α2, α3 y α5 embalado alrededor de un lado, y α6 y α7 embalado en contra de su N-terminal. Hélices α2, α3, α4 y α7 participan en la formación del surco de unión BH3. El potencial de superficie de la proteína electrostática es positivo en ambos extremos de la ranura de unión BH3 (debido a la presencia de Arg 233, Lys 234, Arg 248 y Arg 263) y negativo en el lado del lado α3 hélice (debido a Asp 256) (Figura 2). Esto muestra que la distribución de carga en el surco de unión BH3 de HMCL-1 (171-327) se diferencia claramente de otras proteínas anti-apoptóticas [10].
(A) Backbone de los 20 confórmeros Cyana que representa la solución estructura del HMCL-1 (171-327) después de superposición de red troncal N, C
α y los átomos de alfa-hélices para rmsd mínima C '. Los tres motivos de secuencia de BH son de color verde (BH3), rojo (BH1) y azul (BH2), respectivamente. Dibujo (B) de la cinta del confórmero de menor energía de HMCL-1 (171-327). α-hélices α1-α7 se etiquetan y se colorea de manera diferente, y los extremos N- y C-terminales están etiquetados como "
N '
" y "
C'
". Las cifras se han generado utilizando los programas MolMol [36] y PyMoI [37].
(A) Para humana HMCL-1 (171-327) en la orientación mostrada en la Figura 1 (izquierda) y después de la rotación de 180 ° alrededor del eje vertical (derecha). colores de la superficie (azul de carga positiva; rojo para carga negativa) indican el potencial electrostático calculada mediante el uso de PyMOL [37] y su protocolo de la electrostática de vacío predeterminado. (B) Lo mismo que en (A), pero para el ratón MMCL-1 (152-308).
incluyendo nuestro HMCL-1 (171-327), la estructura de veinte estructuras de resolución atómica que contiene diferentes construcciones MCL-1 se depositan actualmente en el AP. Además de las dos proteínas apo '' HMCL-1 (171-327) y el ratón MMCL-1 (152-308) [10] [código de acceso AP 1wsx, el 89% de identidad de secuencia con la proteína humana], las estructuras de diecinueve proteína-ligando complejos se depositan (Tabla 2) [9], [11] - [18]. Claramente, el gran número de estructuras disponibles refleja el interés excepcional en MCL-1 como un objetivo para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer. La superposición de las alfa-hélices revela, como era de esperar, estrecha similitud estructural para todas las estructuras de MCL-1 proteínas (Figura 3): significa la raíz cuadrada valores de desviación (rmsd) van de 1.05 a 1,54 en relación con hMcl1-1 (171-327 ) (Tabla 2). Sin embargo, la comparación de las dos estructuras de proteínas apo de HMCL-1 (171-327) y MMCL-1 (152 a 308) con las estructuras complejas muestra que el bolsillo de unión se ensancha en la formación de complejos (tabla 2): las distancias entre el C
α átomos de residuos de Su 224 en α2 hélice (Su 205 en MMCL-1) y su 252 (Su 233 en MMCL-1) en el extremo C-terminal de hélice α3 son, respectivamente, aproximadamente 16 Å y ~ 14 Å en HMCL-1 (171-327) y MMCL-1 (152-308), y ~18-21 Å en los complejos.
(a) Estructuras de HMCL-1 (171-327) (verde) y MMCL-1 (152-308) (cian, PDB adhesión código 1wsx) después de la superposición de la cadena principal N, C
α y átomos de los alfa-hélices para rmsd mínimo C '. (B) la elaboración de la cinta (ampliada en (A)) que muestra los diferentes anchos de ranura de unión de los humanos (verde) y la proteína de ratón (cian). Las distancias entre los átomos Cα-de residuos Su 224 en α2 hélice (HIS 205 en MMCL-1) y su 252 (Su 233 en MMCL-1) en el C-terminal de hélice α3 se resaltan: ~ 16 Å en hMcl- 1 (171-327) y ~ 14 Å MMCL-1 (152-308) (C) Superposición como en (a) de HMCL-1 (171-327) (verde) y MMCL-1 (152-308) (cian , 1wsx), y seis MCL-1 estructuras complejas seleccionados (véase también la Tabla 2): MCL-1 humano complejo con Bim BH3 (magenta, 2nla); quimérico de rata humana rMcl-1 (171-208) HMCL-1 (209-327) formando complejo con el ratón mNoxaB BH3 (amarillo, 2rod); ratón MMCL-1 (152-308) formando complejo con el ratón NoxaA BH3 (rosa, 2roc); ratón MMCL-1 (152-308) formando complejo con el ratón Puma BH3 (gris, 2jm6); ratón MMCL-1 (152-308) formando complejo con el ratón NoxaB BH3 (púrpura, 2rod); quimérico de rata humana MMCL-1 (171-208) HMCL-1 (209-327) acomplejado con Bim BH3 humana (naranja, 2nl9); quimérico de rata humana MMCL-1 (171-208) HMCL-1 (209-327) acomplejado con Bim BH3 humana (L62A, F68A) (de color verde claro, 3d7v) .Las cifras fueron preparadas con los programas MOLMOL [36] y PyMOL [37].
el hecho de que el humano de la apo proteína exhibe una ranura algo más ancha de unión que el homólogo de ratón (Tabla 2) puede ser, al menos parcialmente, atribuido a la cadena lateral de Leu 246 en la proteína humana que no está enterrado tan profundamente como la cadena lateral Phe correspondiente en la proteína de ratón. Además, al comparar la la proteína de humano y de ratón, se observaron diferencias para las distribuciones de carga en la ranura BH3 de unión (Figura 2): la proteína humana está cargado negativamente en el lado de α3 hélice, mientras que la superficie correspondiente de la proteína de ratón es cargado positivamente. Esta diferencia surge de Ser 255 correspondiente a Lys 236 en la proteína de ratón. Sorprendentemente, HMCL-1 (171-327) es estructuralmente más similar a la hMcl1 (171-327) -hBim complejo BH3 (Figura 3) que a APO MMCL-1 (152 a 308) (Tabla 2).
en conjunto, las comparaciones estructurales muestran que, a pesar de la identidad de secuencia de 89% entre la proteína humana y de ratón, la disponibilidad de la estructura humana HMCL-1 (171-327) se puede esperar que sea de importancia crítica para apoyar el diseño futuro de medicamentos contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Preparación de muestras de RMN
Los estudios preliminares demostraron que HMCL-1 (171-327) (UniProt /Swiss-Prot ID Q07820 /MCL1_HUMAN ) no es estable en solución. Sin embargo, el mutante Cys 286 → Ser es estable durante varias semanas a concentraciones de ~ 0,7 mM, y ambos de tipo salvaje y mutante se unen el péptido BH3-Bim con la misma afinidad (K
d ~ 60 pM) en un ensayo Biacore . Por lo tanto, hemos resuelto la estructura de RMN de HMCL-1 (171-327) Cys 286 → Ser referido como HMCL-1 (171-327) en esta publicación.
HMCL-1 (171-327) fue clonados, expresados, replegaron y se purificaron siguiendo protocolos estándar para producir una uniforme
13C,
marcada con 15N muestra de proteína [19]. En pocas palabras, el gen se clonó en un plásmido pSR482-21.1 pET21d (Novagen) derivado de rendimiento. La construcción resultante contiene siete restos no nativos en el extremo C-terminal (LHHHHHH) para facilitar la purificación de proteínas.
Escherichia Coli
BL21 (DE3) pMGK células, una cepa mejorada codón, se transformaron con pMcl1-21.1, y se cultivaron en medio mínimo MJ9 [20] que contiene (
15nH
4)
2SO
4 y
T CD -
13C-glucosa como fuentes de nitrógeno y carbono suela. cuerpos de inclusión dobles-lavado que contienen HMCL-1 (171-327) se solubilizaron en clorhidrato de 8 M tamponada guanidina (VWR) que contenía DTT 5 mM, se diluyó lentamente en nueve volúmenes de 20 mM Tris-HCl, NaCl 250 mM, 0,5 M urea, 10% de glicerol, pH 7,4, y replegada dentro de las 72 horas a 4 ° C. HMCL-1 (171-327) se purificó utilizando una resina de afinidad Talon (Clontech) aplicó a una columna de alto rendimiento SP HiTrap (GE Healthcare). El rendimiento final de
T
purificada -
13C,
proteína 15N (& gt; 98% homogénea por SDS-PAGE; 20,3 kDa por MALDI-TOF espectrometría de masas) fue ~ 25 mg /L. Además, un
U
-
15N y 5% por biosíntesis dirigida fraccionadamente
marcado con 13C de la muestra [21] se generó para la asignación estereoespecífica de grupos metilo isopropílico. muestras de RMN se prepararon a una concentración de proteína de 0,7 mM. Un tiempo de correlación rotacional general isotrópica de ~ 10 ns se infiere de
tiempos de relajación espín 15N que indican que HMCL-1 (171-327) es monomérica en solución.
Espectroscopía
RMN
RMN Los espectros se registraron a 25 ° C. Cinco G-matriz de transformadas de Fourier experimentos (GFT) de RMN [22], [23] y una simultánea 3D
15 N /
13C
alifáticos /
13C
NOESY aromático resuelto [24] , [25] espectro (tiempo de mezcla de 60 ms, el tiempo de medición: 48 horas) se adquirieron en un espectrómetro de 750 MHz Varian INOVA equipado con una sonda convencional. 2D constante de tiempo [
13C,
1 H] espectros -HSQC (18 horas) se registraron para el 5% por biosíntesis dirigida fraccionadamente
Ejemplo de marcado con 13C en un espectrómetro Varian INOVA 600 MHz equipado con una sonda criogénica como se ha descrito [21], [26]. Los espectros fueron procesados y analizados mediante el programas NMRPipe [27] y XEASY [28].
Secuencia columna vertebral específica (H
N, H
α, N, C
α) y H
β /C
ß asignaciones de resonancia se obtuvieron mediante el uso de (4,3) D HNNC
αβC
α (63 horas) /(4,3) DC
αβC
α (CO) NHN (62 horas) y (4,3) DH
αβC
αβ (CO) NHN (69 horas) [23] junto con el programa AutoAssign [29]. los desplazamientos químicos de la cadena lateral más periférica fueron asignados con alifáticos (4,3) D HCCH (87 horas) [23] y 3D
15 N /
13C
/
13C alifáticos
aromática de resolución temporal [
1 H,
1 H] -NOESY [24], [25]. En general, se obtuvieron las asignaciones para el 96% de la espina dorsal y
1 H
β /
13C
ß resonancias y el 93% de las resonancias de las cadenas laterales que son asignables con los experimentos de RMN mencionados anteriormente (excluyendo el N-terminal NH
3
+, Pro
15 N,
13C 'que precede residuos prolil, Lys NH
3
+, Arg NH
2, OH, cadena lateral
13C 'y aromáticos
13C
γ). Por otra parte, el 100% /100% de Val y Leu restos isopropilo con no degenerados desplazamientos químicos de protones eran estéreo específicamente asignado (Tabla 1). Los desplazamientos químicos se depositaron en el BioMagResBank [30] (número de acceso 19654).
1H-
1 H limitaciones de distancia límite superior para cálculos de estructura se obtuvieron a partir NOESY (Tabla 1). Además, la cadena principal limitaciones de ángulo diedro se derivaron de los desplazamientos químicos utilizando el programa TALOS [31] para los residuos situados en elementos de estructura secundaria bien definidos (Tabla 1). El CYANA programas [32], [33] y AUTOSTRUCTURE [34] se utilizaron en paralelo a NOE asignar a largo plazo [24]. Los cálculos de la estructura finales se realizaron usando CYANA seguido de agua explícita refinamiento baño usando el programa CNS [35].
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Janet Cheetham por la valiosa sugerencia de considerar el mutante C286S de HMCL-1 (171-327) para la determinación de la estructura de RMN.