Extracto
Pequeños ARN no codificante de proteínas, microARN (MIR), que regulan los niveles de ARN mensajero, recientemente han sido identificados, y puede desempeñar un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades. El presente estudio se centró en el miR-31 y se investiga su posible participación en la carcinogénesis pulmonar. La expresión de miR-31 se modificó en las células de cáncer de pulmón a través de ya sea la amplificación o la pérdida del locus del gen de acogida. La fuerte expresión de miR-31 en carcinomas de células grandes se atribuyó a la amplificación de genes. Mientras tanto, la pérdida de expresión de miR-31 se observó más frecuentemente en adenocarcinomas agresivos. Por lo tanto, el miR-31 puede jugar un papel pleiotrópicos en el desarrollo de los cánceres de pulmón entre los diferentes tipos histológicos. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que demuestra el potencial mecanismo causante de la alteración de la expresión de miR-31 y sugerir su importancia potencialmente diversa en los diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón
Visto:. Okudela K, Tateishi Y, Umeda S, Mitsui H, Suzuki T, Saito Y, et al. (2014) alélica desequilibrio en el miR-31 Host locus del gen en el cáncer de pulmón - su posible papel en la carcinogénesis. PLoS ONE 9 (6): e100581. doi: 10.1371 /journal.pone.0100581
Editor: Salvatore Papa, Instituto de Hepatología - Birkbeck, Universidad de Londres, Reino Unido
Recibido: 23 Enero, 2014; Aceptado: 26-may de 2014; Publicado: 30 de junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Okudela et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y (Tokio, Japón), japonés y con una donación del Fondo para el Médico de Yokohama (Yokohama, Japón). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en el mundo desarrollado [1], [2]. Incluso si el tumor primario se reseca con éxito, se observa una recurrencia en un gran porcentaje de los pacientes [1], [2]. Aunque algunos tumores de pulmón son sensibles a los agentes quimioterapéuticos convencionales o ciertos agentes de direccionamiento molecular, muchos no son [3], [4]. Por lo tanto, una mejor comprensión del mecanismo molecular que subyace a la carcinogénesis de pulmón es importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
Small RNA no codificante de proteínas, microARN, que regulan los niveles de ARN mensajero, recientemente se han identificado, y tiene ha demostrado que desempeñan papeles importantes en la patogénesis de diversas enfermedades. Varios microARN (MIR), incluyendo let-7, miR-21, miR-30d, miR-31, miR-155 y miR-205, han sugerido que participan en la carcinogénesis de diferentes tipos de tumores malignos [5]. Entre ellos, se informó que el miR-31 para ser más fuertemente expresada en el tejido tumoral que en el tejido no tumoral, y se sugiere tener un papel oncogénico en la carcinogénesis pulmonar [6] - [12]. Por otra parte, un estudio reciente ha demostrado el valor pronóstico de miR-31, debido a que la mayor expresión de miR-31 se asocia con un peor pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón [13]. Mientras tanto, una diferencia en la expresión de miR-31 entre los tipos histológicos de cáncer de pulmón y el mecanismo potencial de una expresión alterada de miR-31, no se han dilucidado.
En el presente estudio se analizó la expresión de miR-31 y el estado de su locus del gen de acogida en los diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
líneas celulares y cultivo
Una línea celular inmortalizada epitelial de las vías respiratorias humanas (16HBE14o , virus Simian 40 (SV40)-transformado células epiteliales bronquiales humanas) descrito por Cozens aL et al. (1994) [14] fue proporcionado amablemente por Grunert DC (Centro Médico California Pacific Research Institute). Un sub-clon de células 16HBE14o, descritos como NHBE-T en este estudio, se utilizó. líneas de células epiteliales de las vías respiratorias inmortalizadas (HPL1D y HPL1A, las vías respiratorias pequeñas células epiteliales humanas transformadas con SV40) se establecieron por Masuda A et al. (1997) [15]. líneas celulares de cáncer de pulmón humano (A549, H322M, H358, H522, H820, H2087, H23, EKVX, H226, H827, H1819, H441, H4006, HOP62, H1299 y H460) y una línea celular de riñón embrionario humano (HEK293T) eran comprado de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). El cáncer de pulmón LC2AD línea celular humana, Lu130, Lu135, Lu139 y Lu140, se adquirió en el Banco de Células Riken (Tsukuba, Japón). Las líneas celulares de cáncer de pulmón humano, y PC9 HARA, eran de Immuno-Biological Laboratories Co. (Gunma, Japón). La líneas celulares de cáncer de pulmón humano, TKB1, TKB2, TKB4, TKB5, TKB6, TKB7, TKB8, TKB9, TKB12, TKB14, TKB15, TBK17, y TKB20, fueron obtenidas del Dr. Hiroshi kamma a través del Dr. Takuya Yazawa (Escuela Universitaria Kyorin de Medicina) [16]. células de las vías aéreas pequeñas primaria epiteliales (SAEC) y células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) fueron adquiridos de SANKO Kagaku (Tokio, Japón).
cáncer de pulmón primario
Un total de 129 tumores primarios de pulmón (71 adenocarcinomas, 38 carcinomas de células escamosas, 18 carcinomas de células grandes, 2 carcinomas de células pequeñas) se eliminaron mediante la resección quirúrgica radical en Kanagawa cardiovascular y respiratorio hospital Center (Yokohama, Japón). Este estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki [17], y fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de la Ciudad de Yokohama y la Prefectura de Kanagawa cardiovascular y respiratorio Hospital Center [18]. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos que proporcionan materiales.
extracción de RNA
Las líneas celulares se lavaron con solución salina tampón fosfato fría y luego se congelaron rápidamente. Fijado en formalina y secciones de tejidos embebidos en parafina se examinaron microscópicamente. piezas tumorales y no tumorales se diseccionaron con una hoja de afeitar. El ARN total fue extraído utilizando el miRNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA).
RT-PCR cuantitativa
Para detectar los genes miARN, primera línea de cDNA fue sintetizado a partir de ARN total utilizando el Mir Kit X miARN primer capítulo de síntesis de acuerdo con los protocolos del fabricante (Takara, Kyoto, Japón). El ADNc generado se usó como una plantilla en PCR en tiempo real con SYBR Premezcla ExTaq (Takara) y se ejecutan en un sistema térmico Cycler DADOS-PCR en tiempo real (Takara). El cebador directo usado para la detección de miR-31 era 5'AGGCAAGATGCTGGCATAGCT (madurar miR-31, MIMAT0000089). El cebador inverso era lo universal mrq cebador 3 '(Takara). El conjunto de cebadores utilizado para detectar U6 snRNA fue adquirido de Takara Bio Inc. nivel de miR-31 se normalizó a niveles U6 snRNA. Para detectar ARNm, ADNc de la primera cadena se sintetizó a partir del ARN total utilizando el Sistema primer capítulo de síntesis superíndice III (Invitrogen). El ADNc generado se usó como una plantilla en PCR en tiempo real con el sistema de ensayo de la expresión génica TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se ejecutan en un sistema térmico Cycler DADOS-PCR en tiempo real (Takara). Las sondas TaqMan y conjunto de cebadores utilizado para detectar Applied Biosystems GAPDH [NM_002046.5], ITGA5 [NM_002205.2], MMP16 [NM_005941.4], y RHOA [NM_001664.2], se ha personalizado y comprados. ITGA5, MMP16, y RhoA niveles se normalizaron a los niveles de GAPDH.
análisis por PCR del miR-31 locus
ADN genómico fue extraído de las líneas celulares de cáncer utilizando el kit DNeasy (Qiagen). El estado (supresión o retención) del locus del gen caliente miR-31 se analizó por PCR genómica de ADN usando el conjunto de cebadores de 5 'F TAACTACATCTTCAAAAGCGGAC y R 5' TACATAGCAGGACAGGAAGTAA. El estado del locus del gen CDKN2A (D9S974) y otro locus distante del brazo corto del cromosoma 9 (D9S304) también fueron analizados utilizando los conjuntos de cebadores 5 'de F y R 5' GAGCCTGGTCTGGATCATAA AAGCTTACAGAACCAGACAG, y F 5'GTGCACCTCTACACCCAGAC y R 5 'TGTGCCCACACACATCTATC, respectivamente.
In situ
hibridación para miARN
In situ
hibridación se llevó a cabo de acuerdo con un método descrito anteriormente [ ,,,0],19]. En pocas palabras, el ácido nucleico bloqueado (LNA) modificada con sondas de detección para miR-31 y U6 snRNA, y revueltos sonda de control negativo (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) fueron marcadas con digoxigenina (DIG) utilizando el kit DIG Oligonucleotide Tailing (Roche, Basilea , Suiza) según las instrucciones del fabricante. Fijado en formol y las secciones de tejido incluidas en parafina se acetiló y se hibridó con sondas de detección marcadas con DIG, y luego se probaron con fragmentos Fab anti-DIG conjugados con fosfatasa alcalina (Roche). La señal de hibridación se visualizó usando una solución reveladora de color (Roche).
fluorescente
In situ
hibridación (FISH) para el locus del gen
incluidas en parafina formaldehído-fijo y secciones de tejido se utilizaron para el análisis. Las secciones se hirvieron en tampón de citrato (0,01 M, pH 6,0) para liberar las estructuras cromosómicas cerrados [20]. Estas secciones se hibridaron con una sonda marcada con Cy3 que cubre el miR-31 locus (BAC clon: RP11-354P17) y una sonda marcada con FITC para el locus centrómero en el cromosoma 9 (Vysis INC, Downer Groves, IL.). La señal del miR-31 locus y centrómero 9 fue contado por más de 50 células en todos los tumores, y se calculó el número de copias del miR-31 locus con respecto al de centrómero 9.
El tratamiento con 5 -azacytidine y tricostatina a
las células se trataron con 10 mM de 5-azacitidina (Sigma, St. Louis, MO) durante 72 horas mediante el intercambio el medio todos los días o con 300 ng /ml de tricostatina a ( Wako, Osaka, Japón) durante 24 horas. Las células también se trataron con 5-azacitidina durante 48 horas y luego con una combinación de 5-azacitidina y tricostatina A durante 24 horas adicionales.
PCR específica de metilación
ADN genómico se sometió a un tratamiento de conversión bisulfato usando el kit de modificación bisulfato de ADN MethylEasy (Human Genetic Signatures, Macquarie Park, Australia). Metilación específica de PCR dirigidos a los dos sitios CpG en el promotor del locus del gen miR-31 host (LOC554202), que se demostró anteriormente [21], se realizó de acuerdo con el método descrito en otra parte [21].
bisulfato de DNA Sequencing
un sitio GpC en el promotor de locus del gen de acogida miR31 (LOC554202), que se demostró anteriormente [21], se amplificó por PCR utilizando ADN genómico bisulfato tratados como una plantilla, de acuerdo con la método descrito en otra parte [21]. El producto de PCR se subclonó en el plásmido vector azul pT7 (Novagen, Darmstadt, Alemania), y luego se sometió a una reacción de colorante-terminador de ciclo con el cebador promotor T7 universal, usando el kit Big Dye Terminator versión 3.1 (Applied Biosystems, foster City, CA).
Análisis estadístico
las diferencias en las medias del número de copias relativo del fueron analizados con ANOVA de una sola vía MIR-31 locus entre los grupos clasificados de acuerdo a diversos parámetros patológicos . Las diferencias en los medios de miR-31 niveles en el experimento inhibidora se analizaron con la prueba t de Student para datos independientes una. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (SPSS para Windows, versión 10.0, SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
Otros
Los procedimientos experimentales utilizados para llevar a cabo la inmunohistoquímica para Ki-67 y analizar oncogénico mutaciones en los genes KRAS y EGFR se describen en otra parte [22].
resultados
miR-31 y la expresión de sus objetivos conocidos en líneas celulares de cáncer de pulmón
MIR 31 expresión parecía ser fuerte en algunas líneas celulares de cáncer, pero estaba completamente ausente en otros algunas líneas celulares (Fig. 1). También se examinó la expresión de let-7i. Let-7i se expresó en todas las líneas celulares y sus niveles difería de los de miR-31 (Figura S1). Se sirvió como control para evaluar la calidad de los materiales y se aseguró de que las alteraciones marcadas se produjeron en la expresión de miR-31. Por otra parte, un experimento preliminar demostró que la restauración de miR-31 marcada suprimió el crecimiento de una línea celular de cáncer (LC2AD) que casi perdió su capacidad de expresar miR-31 (Figura S2). Estos resultados nos llevó a investigar más a fondo la importancia potencial de la expresión alterada de miR-31 en la carcinogénesis pulmonar.
miR-31 niveles se normalizaron a los niveles de ARNsn U6. Técnico repeticiones se realizaron por triplicado. Los medios y las desviaciones estándar (barras de error) se muestran. AEC, las vías respiratorias células epiteliales (células no cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, de células grandes carcinoma de células; SCC, carcinoma de células pequeñas.
Estado del gen locus de miR-31 en líneas celulares de cáncer de pulmón
Los estados del locus del gen miR-31, locus del gen CDKN2A, y el adyacente locus (D9S304), se investigaron mediante análisis de PCR. Entre las líneas de cuarenta y uno celulares examinadas, seis líneas celulares (14,6%, 6/41 líneas celulares; H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, y TKB9) perdieron el miR-31 de acogida gen locus (Figura 2, Tabla 1. ), mientras que doce líneas (29,3%, 12/41 líneas celulares;. TKB14, H4006, A549, LC2AD, TKB4, H460, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, TKB9) perdieron el locus del gen CDKN2A (figura 2, Tabla 1 ). Las seis líneas que perdieron el locus de miR-31 también perdieron el locus del gen CDKN2A (Fig. 2, Tabla 1). El locus adyacente (D9S304) sirvió como control positivo para el análisis de PCR (Fig. 2).
Los resultados de los análisis de PCR se muestran. AEC, las vías respiratorias células epiteliales (células no cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, de células grandes carcinoma de células; SCC, carcinoma de células pequeñas.
modificación epigenética del promotor de miR-31 y su expresión
miR-31 expresión estuvo ausente en todas las seis líneas celulares perder el MIR -31 anfitrión gen locus (Fig. 2, Tabla 1). Mientras tanto, las cinco líneas celulares (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, y TKB17) que retuvo el locus del gen miR-31 (Fig. 2, Tabla 1) también perdieron el miR-31 expresión o reducido su nivel (Fig. 2, Tabla 1), lo que indica la posible participación de modificación epigenética en su regulación a la baja. Por lo tanto, las líneas celulares que perdieron la expresión de miR-31, pero conservó su locus del gen fueron examinados para investigar los efectos de los inhibidores de la ADN metiltransferasa y la histona deacetilasa en la expresión de miR-31. De cualquier y /o la combinación de ambos inhibidores no restauró de forma reproducible la expresión de miR-31 en estas células (Fig. 3A). Metilación específica de análisis de PCR en dos sitios de la región promotora del gen de acogida miR-31 reveló que los dos sitios se metilado en todas las líneas celulares examinadas (Fig. 3B). análisis de secuenciación de ADN bisulfato en el sitio CpG de la región promotora también reveló que estaba de vez en cuando metilado en todas las líneas celulares examinadas (SAEC, NHBE-T, H820, H441, LC2AD, Lu140, TKB15, y TKB17) (Fig. 3C). Los niveles de metilación parecían ser no significativamente diferente entre las células que retienen la expresión de miR-31 (SAEC, NHBE-T, y H820) y los perderlo (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, y TKB17) (Fig. 3C) . El estado de metilación de las regiones putativo promotor del gen de acogida de miR-31 no se asoció con el estado de recuperación de miR-31 niveles después de los tratamientos con los inhibidores (Fig. 3A y 3C). Por lo tanto, la metilación del ADN en la región putativa examinó aquí no podía atribuirse a la regulación a la baja de miR-31.
Las células tratadas con vehículo de control (CTL), 5-azacitidina (AZA), tricostatina A (TRC), o una combinación de AZA y TSA (AZ /TR) se examinaron para la restauración de miR-31 expresión utilizando RT-PCR cuantitativa. Se calculó el nivel relativo de miR-31 normalizado a los de U6 snRNA. Se realizaron dos experimentos independientes. Técnico repeticiones del análisis de PCR se realizaron por triplicado. Se muestran las medias y desviaciones estándar (barras de error) (A). Los dos sitios (S1 y S2) a partir del promotor putativo de miR-31 se amplificó por PCR con cebadores específicos, ya sea para metilada (M) o no metilado (UM) de ADN de ADN genómico bisulfato modificado usando sodio como una plantilla, de acuerdo con el método se describe en un estudio anterior [21]. Se presentan resultados representativos (B). La región del promotor de miR-31 que contiene sitios CpG se amplificó por PCR utilizando ADN genómico modificado con bisulfato de sodio como una plantilla, de acuerdo con el método descrito en un estudio anterior [21]. Ocho subclones de los productos de PCR fueron analizados por su estado de metilación mediante secuenciación de ADN. Abiertos (○) y rellenos (•) círculos indican la citosina no metilada y metilado CpG en los sitios indicados, respectivamente (C). AEC, las vías respiratorias células epiteliales (células no cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, carcinoma de células grandes; SCC, carcinoma de células pequeñas.
La expresión de miR-31 en los cánceres primarios de pulmón
RT-PCR cuantitativa análisis reveló que algunos tejidos tumorales y no tumorales expresan miR-31 en detectable niveles (Fig. 4A). Estos niveles varían, pero fueron notablemente alta en algunos de los tumores examinados (Fig. 4A). Estos parecían ser ligeramente mayor en carcinomas de células grandes y ligeramente inferior en los adenocarcinomas (Fig. 4A). Entre los adenocarcinomas examinados, la expresión de miR-31 fue menor en carcinoma poco diferenciado (Fig. 4B y 4C), así como en el subtipo sólido (Fig. 4D). se observó daño tisular grave acompañada de reacciones regenerativas en los tejidos no tumorales que expresan miR-31 (no mostrado)
.
niveles de miR-31 se evaluaron en los tumores primarios de pulmón y el correspondiente tejido no tumoral de pulmón. El número de copias de miR-31 y U6 snRNA se midieron utilizando RT-PCR cuantitativa. Técnico repeticiones se realizaron por triplicado. Los medios y las desviaciones estándar (barras de error) de miR-31 niveles normalizados a los de U6 snRNA se muestran como los resultados obtenidos de todos los tumores (A) y los de ADC (B). Diferencias significativas en la media de miR-31 niveles en los adenocarcinomas entre los diferentes grados histológicos (9 carcinomas bien diferenciados (TWA); 3 carcinomas moderadamente diferenciados (MOD); 8 carcinomas pobremente diferenciados (POR)) y subtipos (carcinoma 8 bronquioloalveolar (BAC) ; 3 acinar carcinoma (ACN); 8 carcinoma sólido (SOL) (un carcinoma papilar (= así diferenciar el carcinoma) fue excluido de un análisis estadístico) se analizaron con un ANOVA de una vía Los medios y las desviaciones estándar (barras de error) de. se presentan los grados histológicos (C) y (D) subtipos.
In situ
análisis de hibridación de miR-31 en secciones de tejido confirmaron que el miR-31 se expresó en células neoplásicas y también reveló que incluso variada entre las células neoplásicas, incluso en un mismo tumor (Fig. 5). regenerativos células epiteliales, células intersticiales y células inflamatorias también expresó el miR-31 en varios niveles (Fig. 5).
una sonda que consiste en la secuencia aleatoria revueltos sirvió como un control negativo (paneles inferiores). fotografías representativas de tejido tumoral (a la izquierda dos paneles) y no tumoral (derecha dos paneles), que expresa el miR-31 (centro de dos paneles) o no (dos paneles laterales), se presentan.
Estado del miR-31 locus del gen de acogida en los cánceres primarios de pulmón
análisis FISH reveló que el miR-31 de acogida locus del gen se perdió en las células neoplásicas de algunos tumores, como el recuento de señal desde el miR-31 locus fue menor que la del centrómero del cromosoma 9 (Fig. 6A). La dosis de genes de la miR-31 locus estimado por la razón de miR-31 /centrómeros en los adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas fue ligeramente inferior a la de no canceroso epitelio bronquial (Fig. 6B). Sin embargo, en algunos tumores de células grandes carcinomas el locus miR-31 se amplificó (Fig. 6C). La dosis de genes fue significativamente mayor en carcinomas de células grandes que en los epitelios no canceroso y otros tipos histológicos (Fig. 6C, la Tabla 2). Todos los tumores con una amplificación del locus del gen, que fueron examinados forma disponible, expresaron un alto nivel de la transcripción de miR-31. Por el contrario, entre los adenocarcinomas, la dosificación del gen tendían más a ser menor en los tumores más agresivos (tumores poco diferenciados o tumores sólidos) guía subtipo
Se presentan los resultados representativos de los tejidos tumorales y no tumorales (Tabla 2)., y las señales verde y rojo indican el miR-31 locus y centrómero locus del cromosoma 9, respectivamente (A). El recuento de señal desde el miR-31 locus normalizado a que desde el locus centrómero del cromosoma 9 se determinó como la puntuación de FISH. Se presentan las puntuaciones de peces medidos (B). Las puntuaciones medias en el epitelio bronquial no tumoral y en los diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón se presentan (C). Las diferencias en la puntuación media se analizaron con una prueba de ANOVA de una sola vía. Los valores de p se indican. BEC, células epiteliales bronquiales (células no cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, el carcinoma de células grandes.
Discusión
Un estudio inicial de los cánceres de mama sugirió que el miR-31 podría ser un supresor tumoral, lo que inhibe la propagación metastásica invasiva y de células neoplásicas [23]. Otros estudios han apoyado esta conclusión inicial y reveló los posibles mecanismos moleculares que subyacen a la forma de miR-31 evade la invasión y metástasis [24]. MiR-31 también ha demostrado ser regulado por disminución en los cánceres gástricos y se sugirió para funcionar como un supresor de tumores [25]. Por el contrario, el miR-31 se encontró que estaba aumentada en cánceres colorrectales, y se sugirió que promueva la difusión invasivas y metastásicas de las células neoplásicas [26], [27]. Por lo tanto, el papel potencial de miR-31 en la carcinogénesis puede diferir entre los diversos tipos de cánceres. En el cáncer de pulmón, la expresión de miR-31 en general, se ha informado a ser mayor en el tejido tumoral que en el tejido correspondiente no tumoral [6] - [12]. Nuestros resultados del análisis de RT-PCR cuantitativa, en la que se muestran varios tumores primarios de pulmón de expresar firmemente el miR-31, parecen ser consistentes con los resultados anteriores [6], [7], [9] - [12]. análisis FISH reveló que la amplificación en el gen locus anfitrión podría ser uno de los mecanismos responsables de la fuerte expresión de miR-31. Un estudio reciente demostró un valor pronóstico de miR-31, ya que la mayor expresión de miR-31 se asocia con un peor pronóstico en el cáncer de pulmón [13], y también sugirió su papel oncogénico través de
in vitro
experimentos [ ,,,0],13]. Tomados en conjunto con estos resultados, se sugirió el miR-31 para promover la carcinogénesis, especialmente de los carcinomas de células grandes. En contraste, la expresión de miR-31 se redujo notablemente o completamente ausente en algunas líneas celulares de cáncer de pulmón. Además, sus niveles variaron en los tumores primarios de pulmón. Algunos tumores expresan el miR-31 a niveles más bajos que el tejido no tumoral correspondiente, mientras que otros tumores no expresan en absoluto. Entre los adenocarcinomas examinados, la dosis de genes fue ligeramente menor en los tumores más agresivos (tumores poco diferenciados subtipo o sólidos). Estos resultados sugieren que miR-31 puede jugar un papel supresor en la carcinogénesis de adenocarcinomas. Por lo tanto, miR-31 puede jugar un papel pleiotrópico en el desarrollo de los cánceres de pulmón de diferentes tipos histológicos. La expresión de algunos objetivos conocidos de miR-31, tales como ITGA5, MMP16, y RHOA [28], se examinó de manera preliminar en células transfectadas-miR-31 y las células de cáncer de pulmón (Figura S3). Sin embargo, la expresión forzada de miR-31 no redujo los niveles de mRNA de estas moléculas. En las líneas celulares de cáncer de pulmón nativo, no se observó correlación entre el nivel de estas moléculas y los niveles de miR-31 entre los diferentes tipos histológicos (Figura S3). Objetivos de miR-31 pueden variar en diferentes situaciones, y la diafonía compleja entre los objetivos pueden permanecer escondido en células de cáncer de pulmón. Otros estudios que investigan exhaustivamente objetivos de abajo están garantizados con el fin de dilucidar el mecanismo molecular que subyace a la forma potencial de miR-31 promueve la carcinogénesis de los diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón
.
Los tejidos no tumorales que presentan graves daños y la inflamación expresan fuertemente miR-31.
In situ
análisis de hibridación también confirmó la fuerte expresión de miR-31 en la regeneración de las células epiteliales no neoplásicas y las células mesenquimales. Por lo tanto, miR-31 puede ser inducida por estímulos que promueven el crecimiento celular en respuesta a daño tisular y puede controlar las reacciones regenerativas. La alteración de la expresión de miR-31, si está regulado por disminución o regulación al alza, puede dar lugar a una alteración en la homeostasis celular y también puede participar en la transformación neoplásica.
Un análisis de la situación del locus del gen demostró que la deleción homocigota del gen locus de miR-31 fue una de las causas de la pérdida de su expresión en líneas celulares de cáncer de pulmón. Sin embargo, algunas líneas de células que retuvieron el locus del gen miR-31 también atenúan en gran medida su expresión. Estudios anteriores indicaron que la hipermetilación del ADN o las histonas en el promotor de locus del gen de acogida miR-31 fue la causa de la fuerte regulación a la baja de miR-31 en los cánceres de mama leucemia [21] o un adulto de células T [29]. Sin embargo, nuestros resultados del experimento usando inhibidores de ADN metiltransferasa y la histona deacetilasa no apoyaron la participación de modificación epigenética en la atenuación de la expresión de miR-31. PCR específica de metilación y la secuenciación de bisulfato analiza también fracasaron en demostrar una relación causal entre la hipermetilación del ADN del promotor y dicha atenuación severa. es probable que participen en la regulación a la baja de la expresión de miR-31 Un posible mecanismo que no sea la modificación epigenética. El promotor putativo locus del gen de acogida miR-31 contiene múltiples elementos CCAAT potenciador [30]. CCAAT elemento vinculante proteína (C /EBP) -β fue encontrado para inducir miR-31 expresión en el epitelio de las vías respiratorias en respuesta a ciertos estímulos externos [30]. C /EBP-α se demostró que ser severamente regulado por disminución en los cánceres de pulmón [31] - [34], y pueden ser la causa de la expresión desordenada de miR-31. se justifica una investigación sobre la posible implicación de la familia C /EBP en la atenuación de miR-31 expresión en el cáncer de pulmón. líneas de células epiteliales de las vías respiratorias inmortalizadas Mientras tanto, no cancerosas transformadas por el antígeno T grande de SV40 (NHBE-T, HPL1D, y HPL1A), en el que se inactivan, se encontró que p53 y las vías mediadas por RB para expresar al marcadamente los niveles más bajos de miR-31 que las células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas (SAEC) y células epiteliales bronquiales (NHBE). Este antígeno viral puede modular directamente e indirectamente la expresión de miR-31.
En resumen, los resultados del presente estudio sugieren que una expresión alterada de miR-31 ya sea debido a la amplificación o la pérdida de su locus del gen de acogida podrá participar en la carcinogénesis pulmonar. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio para describir el posible mecanismo causal subyacente a la expresión alterada de miR-31 en los cánceres de pulmón.
Apoyo a la Información
Figura S1. Empresas El número de copias de let-7i y U6 snRNA se midieron utilizando RT-PCR cuantitativa. Let-7i niveles se normalizaron a los niveles de ARNsn U6. AEC, las vías respiratorias células epiteliales (células no cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, de células grandes carcinoma de células; . SCC, carcinoma de células pequeñas
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figura S2.
Efecto biológico de la restauración de miR-31 en una línea celular de cáncer de pulmón (LC2AD) se presenta. El vector de pro-retrovirus pLHCX (BD Clontech) que llevan fragmentos de ADN que incluyen la región de codificación de miR-31 (MIMAT0000089) flanqueando sobre un margen de 100 pares de bases en ambas direcciones, se obtuvo. Los vectores de retrovirus (vector vacío (Mock), la cadena con sentido de miR-31 (SS), y la cadena antisentido de miR-31 (AS)) se infectaron como el mismo método descrito anteriormente [17]. Después de una breve selección con higromicina B (BD Clontech), se recogieron las células supervivientes y se contaron, y 2,0 × 10
4 fueron re-sembraron en una placa de 10 cm. Después de 15 días, las células fueron fijadas con metanol y se tiñeron con Giemsa (A). Se presentan las medias y las desviaciones estándar (barras de error) de los recuentos de colonias de los experimentos por triplicado (B). Las células seleccionadas se cultivaron y se pasan varias veces. duplicaciones de la población acumulados se presentan (C). Las células recolectadas inmediatamente después del proceso de selección se examinaron para la expresión de miR-31 y U6 snRNA por RT-PCR cuantitativa. Se presenta el nivel de miR-31 normalizada a la de U6 snRNA (D)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0100581.s002 gratis (TIF)
Figura S3. Empresas El número de copias de ITGA5, RHOA, MMP-16, y el ARNm de GAPDH se midieron utilizando RT-PCR cuantitativa. ITGA5 (A), se muestran RHOA (B), y MMP-16 (C) niveles normalizados a los niveles de GAPDH. AEC, las vías respiratorias células epiteliales (células no cancerosas); TRAS, LC2AD línea celular de cáncer de pulmón - transfectantes base (vector vacío (FALSO), la cadena con sentido de miR-31 (SS), y la cadena antisentido de miR-31 (AS)); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, de células grandes carcinoma de células; SCC, carcinoma de células pequeñas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0100581.s003 gratis (TIF)
Reconocimientos
En especial, gracias Emi HONDA y Misa Otara (Prefectura de Kanagawa cardiovascular y respiratoria del hospital Center, Yokohama, Japón) por su asistencia.