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PLOS ONE: análisis cualitativo y cuantitativo de la inducida por Oridonin ROS mediada por cáncer del esófago KYSE-150 por apoptosis de las células de Fuerza Atómica Microscopy


Extracto

Los altos niveles de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en las células se reconoce como una de las principales causas de la apoptosis de células de cáncer y se ha convertido en una estrategia terapéutica prometedora para la terapia del cáncer. Sin embargo, si la apoptosis asociada propiedades biofísicas de las células de cáncer están relacionados con funciones de ROS intracelulares todavía no está claro. Aquí, por primera vez, hemos determinado los cambios de las propiedades biofísicas asociados con el cáncer de esófago mediada por ROS KYSE-150 apoptosis de las células usando alta resolución microscopía de fuerza atómica (AFM). Oridonin se probó para inducir mediada por ROS apoptosis de las células KYSE-150 de una manera dependiente de la dosis, que puede ser revertida por la N-acetilcisteína pretratamiento (NAC). Sobre la base de AFM de imágenes, se encontró que el daño morfológico y cambios ultraestructurales de KYSE-150 células que estar estrechamente asociado con la apoptosis celular KYSE-150 oridonin inducida por ROS mediada. Los cambios en la rigidez celular determinada por medición de la fuerza AFM también demostraron cambios ROS-dependientes en oridonin inducida por apoptosis de las células KYSE-150. Nuestros resultados no sólo proporcionan nuevos conocimientos sobre los efectos anticancerígenos de oridonin, pero también destacaron el uso de AFM como un NanoTool cualitativa y cuantitativa para detectar la apoptosis de las células cancerosas mediada por ROS basados ​​en las propiedades biofísicas de células, proporcionando información novedosa de las funciones de ROS en apoptosis de las células del cáncer a escalas nanométricas

Visto:. Pi J, H Cai, Jin H, Yang H, J Jiang, Wu a, et al. (2015) Análisis cualitativo y cuantitativo de los mediada por ROS inducida por el cáncer del esófago Oridonin KYSE-150 apoptosis de las células por microscopía de fuerza atómica. PLoS ONE 10 (10): e0140935. doi: 10.1371 /journal.pone.0140935

Editor: Etienne Dague, LAAS-CNRS, Francia |
Recibido: 25 de mayo de 2015; Aceptado: 30 de septiembre de 2015; Publicado: 23 de octubre 2015

Derechos de Autor © 2015 Pi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Desarrollo de Macao Ciencia y Tecnología (N ° 028/2014 /A1), http://www.fdct.gov. MO /

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de las células, tales como peróxido de hidrógeno, superóxido aniones y los radicales hidroxilo, actúan como segundos mensajeros en la regulación de muchos procesos celulares importantes, incluyendo la activación de factor de transcripción, la expresión génica y la proliferación celular, la diferenciación y la senescencia [1]. ROS también han sido implicados en la reprogramación metabólica de las células cancerosas, que juega un papel importante en la iniciación del tumor, progresión y metástasis [2]. Y en base a los diferentes estados redox de las células normales y cancerosas, una estrategia terapéutica prometedora basada en fármacos que aumentan la generación de ROS e inducen la apoptosis en células de cáncer sale para la terapia del cáncer [3]. Los altos niveles de ROS pueden inducir directamente el daño oxidativo de los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, por lo tanto eliminar las células cancerosas que se altere el metabolismo y la transducción de señales. El aumento de la producción de ROS está siempre involucrada en el mecanismo contra el cáncer de potenciales fármacos contra el cáncer, y también participan en algunos medicamentos contra el cáncer usados ​​clínicos, tales como paclitaxel, 5-fluorouracilo y doxorrubicina [4-6].

rubescens Robdosia, una tipos de hierbas medicinales, se ha utilizado tradicionalmente en china para el tratamiento de la faringitis y carcinoma de esófago. Oridonin, la principal sustancia activa farmacológica de rubescens Robdosia con diversos efectos farmacológicos y fisiológicos, ha dibujado una atención creciente de los biólogos del cáncer debido a sus notables actividades antitumorales [7, 8]. Se ha informado de que oridonin puede inducir la apoptosis o la autofagia en diversos tipos de células cancerosas, tales como células de mieloma múltiple [9], células de cáncer colorrectal [10], células de carcinoma de hepatoma [11], células de cáncer de próstata [12], carcinoma cervical células [13] las células cancerosas and.oesophageal [14]. Y muy interesante, la exposición de estas células cancerosas para oridonin resultado en un aumento significativo en la generación de ROS y el eliminador de ROS, tal como N-acetilcisteína (NAC), protege completamente estas células de cáncer de oridonin la muerte celular inducida [9-13]. Por lo tanto, oridonin podría ser servido como un agente anticanceroso ideal para el estudio de la apoptosis mediada por ROS en las células cancerosas.

Como miembro de la microscopía de efecto túnel (STM) técnicas, microscopía de fuerza atómica (AFM) es muy útil en imágenes topografía, la determinación mecánica e investigación sola fuerza molécula de depender de la detección de la desviación en voladizo inducido por las fuerzas entre la punta del AFM y la muestra. Sobre la base de estas ventajas, AFM se ha convertido en una de las nanotecnologías más poderosas para
In situ
de imagen única molécula de las células, especialmente para las detecciones de la membrana celular [15]. Recientemente, AFM se ha introducido para el estudio de la muerte de células cancerosas inducida por el tratamiento de drogas, que no sólo proporciona la información morfológica de alta resolución, sino que también pone de relieve los cambios biomecánicos durante la muerte celular [16-18]. Estas obras demuestran que AFM es muy útil para el estudio de los efectos anticancerígenos de fármacos basados ​​en las propiedades biofísicas celulares. estudios de AFM previos han demostrado que la apoptosis de células de cáncer está estrechamente relacionado con el nivel de ROS intracelular [19-21]. Sin embargo, todavía no existe un estudio sistemático AFM o el análisis sobre los cambios de las propiedades biofísicas de la apoptosis mediada por ROS cáncer.

En el presente estudio, el uso de alta resolución AFM, se investigó sistemáticamente las propiedades biofísicas de cáncer de esófago humano KYSE -150 células, que fueron encontrados a estar estrechamente relacionados con la apoptosis mediada por ROS inducida por oridonin. Oridonin se encontró que inhibe la proliferación, interrumpir el potencial de membrana mitocondrial e inducir la apoptosis de KYSE-150 células a lo largo de la producción de ROS en KYSE-150 células. Todos estos efectos de oridonin en KYSE-150 células podrían ser revertidos por el CAN ROS-búsqueda de objetos, indicando los efectos anticancerígenos de ROS mediada oridonin en KYSE-150 células. Entonces, de alta resolución AFM se aplicó para el análisis de los efectos anticancerígenos de oridonin en células KYSE-150 en base a las propiedades biofísicas de células. Y en particular, se encontró que, por primera vez, AFM detecta daño morfológico, los cambios ultraestructurales de membrana y cambios biomecánicos de células KYSE-150 apoptóticas inducidas por oridonin también estaban estrechamente relacionados con el nivel de ROS intracelular de las células KYSE-150, lo que demuestra el uso de AFM como un poderoso NanoTool para el estudio de la apoptosis de células cancerosas mediada por ROS.

Materiales y Métodos

Materiales

Oridonin (≥98%, HPLC) se obtiene de Biotechology Mingwang (República Popular china). de suero de ternera fetal (FCS), penicilina /estreptomicina, medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), y el kit de la tripsina se obtienen de Gibco (EE.UU.). El paraformaldehído se adquirió de Sigma (EE.UU.). 3- (4, 5) -dimethylthiazo (-z-y1) -3,5-diphenyt- etrazoliumromide (MTT), N-acetil-L-cisteína (NAC), anexina V-FITC /PI (Anexina V-isotiocianato de fluoresceína /yoduro de propidio) kit de detección de apoptosis, DCFH-DA (2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein) kit de ensayo de especies de oxígeno reactivo, rodamina 123, verde actina-tracker (phalloidin- isotiocianato de fluoresceína), 2- (4-amidinofenil) -6 dihidrocloruro -indolecarbamidine (DAPI) y análisis del ciclo celular kits (yoduro de propidio) se compran a Beyotime Instituto de Biotecnología, china.

cultivo de células

cáncer de esófago línea celular KYSE-150 humana se adquiere de biblioteca de células tumorales de la Academia china de Ciencias médicas (Pekín, china), que son cultivadas con medio DMEM suplementado con 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina, y /estreptomicina 100 g ml en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C.

la viabilidad celular de medición

MTT ensayo se utilizó para probar la viabilidad de las células de KYSE-150 células expuestas a oridonin. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 5 x 10
3 células /pocillo durante 24 h y se incubaron con diferentes concentraciones de oridonin para 24 h. Para limpiar los ROS producidos por oridonin, las células fueron pretratadas con NAC 2,5 mM durante 1 h y luego tratados con oridonin para 24 h. Después del tratamiento oridonin, reactivo MTT (10 l, 5 mg /ml) se añadió en cada pocillo de 4 h de incubación, se retiró el medio, y las células se suspendieron en 150 uL de DMSO a incubar durante 10 min. Un espectrofotómetro (TECAN, Switzer-tierra) se utilizó para probar la absorbancia a 490 nm.

intracelular de ROS determinación del nivel de

El nivel de ROS intracelular de KYSE-150 células se determinó mediante un DCFH-DA kit de ensayo de especies de oxígeno reactivo basado. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos con una densidad de 1 x 10
5 células /pocillo durante 24 h y se incubaron con diferentes concentraciones de oridonin para 3 h. Para limpiar los ROS producidos por oridonin, las células fueron pretratadas con NAC 2,5 mM durante 1 h y luego tratados con oridonin para 3 h. Después de oridonin tratamiento, se recogieron las células, se lavaron triple con PBS y se incubaron con solución de DCFH-DA durante 30 min en la oscuridad a 37 ° C. La citometría de flujo (BD, EE.UU.) se utilizó para detectar el nivel de ROS intracelular después las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS.

apoptosis de la célula de detección

Anexina V-FITC /PI kit de detección de apoptosis se utilizó para detectar la apoptosis de oridonin tratada KYSE-150 células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos con una densidad de 1 x 10
5 células /pocillo durante 24 h y se incubaron con diferentes concentraciones de oridonin para 24 h. Para limpiar los ROS producidos por oridonin, las células fueron pretratadas con NAC 2,5 mM durante 1 h y luego tratados con oridonin para 24 h. Después se incubaron con oridonin, se recogieron KYSE-150 células, se lavaron triple con PBS, se suspendieron en tampón de unión de Anexina V, y se incubaron con anexina V y PI marcado con FITC durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, las muestras se analizaron inmediatamente por citometría de flujo (BD, EE.UU.).

membrana mitocondrial análisis potencial
se utilizó citometría de flujo basado en 123
rodamina para determinar las alteraciones de potencial de membrana mitocondrial (MMP ) de KYSE-150 células por tratamiento oridonin. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos con una densidad de 1 x 10
5 células /pocillo durante 24 h y se incubaron con diferentes concentraciones de oridonin para 24 h. Para limpiar los ROS producidos por oridonin, las células fueron pretratadas con NAC 2,5 mM durante 1 h y luego tratados con oridonin para 24 h. Las células KYSE-150 cosechadas y lavadas se incubaron con rodamina 123 por 60 min en la oscuridad a 37 ° C. La citometría de flujo (BD, EE.UU.) se utilizó para detectar la señal de fluorescencia de la rodamina 123 después se recogieron las células y se lavaron dos veces con PBS.

preparación de la muestra AFM

Para las medidas de AFM, KYSE-150 células se recogieron con tripsina al 0,25% y se cultivaron a una densidad de 5 x 10
4 células /pocillo en cubreobjetos de vidrio en una placa de seis pocillos. Después de la incubación durante la noche, se añadió oridonin en el medio de cultivo para 24 h de estimulación. Para limpiar los ROS producidos por oridonin, las células fueron pretratadas con NAC 2,5 mM durante 1 h y luego tratados con oridonin para 24 h. Después de eso, las células se lavaron con PBS de triple, se fijaron con solución de paraformaldehído al 4% durante 10 min, se lavaron triple con agua destilada y se secaron en aire para obtener imágenes de la morfología en el aire o inmediatamente utilizado para mediciones de fuerza en solución PBS. Para las mediciones de rigidez célula viva, KYSE-150 células fueron tratadas con o sin oridonin y NAC durante 24 h, y después se lavaron con tampón de PBS para descartar las células de suspensión en un medio. Las células luego se utilizaron para mediciones de módulo de Young en medio DMEM por AFM.
Cambios
imágenes AFM morfología y análisis ultraestructura de la membrana

AFM se utilizó para investigar la topográfica y ultraestructural (Bruker, alemán) de células KYSE-150 inducidos por el tratamiento oridonin. contaminantes orgánicos de las puntas de nitruro de silicio utilizados en todas las mediciones fueron retirados por la irradiación ultravioleta. Las constantes de resorte de las puntas de AFM se calibraron utilizando el método del ruido térmico aplicado en el software Nanoscope de AFM. En primer lugar, la calibración de la sensibilidad de deflexión se llevó a cabo sobre los cubreobjetos de vidrio a una pequeña deflexión vertical (~ 0 V) ​​en el aire. A continuación, la curva de sintonía térmica fue equipado por el oscilador armónico simple ajuste para calcular la constante de muelle. El radio de curvatura de las puntas de AFM (BudgetSensors, Bulgaria) utilizados para obtener imágenes de la morfología era 10 nm, y la constante de resorte de las puntas era 0,51 ± 0,02 N /m, con una sensibilidad de desviación de 52,94 ± 0,96 nm /V. Las imágenes morfológicas y ultraestructurales de KYSE-150 células se obtuvieron en aire a temperatura ambiente en el modo de contacto. Se obtuvo la ultraestructura de KYSE-150 células en las áreas que rodean los núcleos y el análisis topográfico de procesamiento de imágenes y datos se realizaron utilizando el software de análisis Nanoscope instrumento equipado. Y para que la barra de escala, etiquetas de los ejes X e Y etiquetas de los ejes de imágenes de AFM más fácil de leer, nos re-escrito los de la barra de escala y las etiquetas para el eje X e Y en estas figuras. Para el análisis de parámetros ultraestructura, 30 diferentes 2 × 2 um
2 se calcularon imágenes ultraestructurales en 15 KYSE-150 células diferentes en cada grupo. Antes del análisis de parámetros ultraestructura, imágenes de AFM se aplanan con el primer fin de aplanar por el software de Análisis Nanoscope. Después de eso, la imagen ultraestructura conjunto se calcula para la distribución de la altura y la rugosidad por el software de análisis Nanoscope.

AFM rigidez análisis

propiedades biomecánicas de las células vivas KYSE-150 se midieron en medio DMEM por puntas desnudas en el modo de volumen de trabajo a través de AFM (Bruker, alemán). La constante del resorte de sondas de nitruro de silicio utilizado para las mediciones de células (Bruker, alemán) que vivían fue calibrado por el método de ruido térmico en una placa de cultivo limpio que contenía PBS, que fue de 0,08 ± 0,01 N /m, con una sensibilidad de desviación de 16,23 ± 0,71 nm /V. En el modo de volumen de trabajo, la punta fue abordado alternativamente a la superficie celular y luego se retira de 16 × 16 puntos más de 1 × 1 um
2 en el área de superficie de la muestra, mientras que las curvas de fuerza se registran de forma sincrónica. Para meaurements célula viva, más de 15 lugares diferentes en 15 celdas diferentes se registraron en la zona central de células en cada grupo. El módulo de Young se calculó a partir de las curvas de fuerza de modelo básico de Sneddon, que describe el comportamiento de un indentador de geometría conocida en contacto con un medio-espacio elástico mucho menos rígido que el punzón, como se muestra en la ecuación (1) [22] :( 1 )

Cuando upsilon, F, d, e, y α son la relación de Poisson, la carga de la fuerza, la sangría, el módulo de Young, y el ángulo de apertura de la mitad de una punta cónica, respectivamente. En el modelo de Sneddon, la carga ejercida por el punzón está vinculada a la profundidad de indentación causada, que muestra la relación entre la fuerza aplicada F y el δ indentación en el caso de penetrador cónico. Una relación de Poisson de 0,5 es apropiado para las células y por lo tanto se utiliza en el siguiente análisis [23, 24].

Estadísticas

Todos los resultados son representativos de tres experimentos independientes y los datos presentados se expresan como Media ± SD se realizó un análisis estadístico mediante la prueba t de Student, excepto que el módulo de Young se realizó mediante la prueba de Kruskal-Waillis, y p. & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados y Discusión

Oridonin inhibir KYSE-150 por vía de la viabilidad celular mediada por ROS

Oridonin se ha encontrado para mostrar de amplio espectro contra el cáncer actividades contra diferentes líneas celulares de cáncer [9-13, 25]. Los efectos anti-proliferación de oridonin contra cáncer del esófago KYSE-150 células humanas se investigaron mediante el ensayo de MTT, lo que indica un fuerte efecto de inhibición de la proliferación de las 24 h de tratamiento oridonin en KYSE-150 células como se muestra en la figura 1A. La viabilidad de KYSE-150 células disminuyó de 100,0 ± 6,3% a 90,6 ± 7,8%, 73,2 ± 11,9%, 54,8 ± 16,3%, 32,0 ± 15,3% y el 16,2 ± 5,6% después de 10 M, 20 M, 30 M, 40 M y 50 mM tratamiento oridonin, respectivamente (Fig 1A). Los trabajos anteriores se centraron en la actividad contra el cáncer de oridonin a entender que los efectos de inhibición de oridonin siempre estuvieron acompañados por el aumento del nivel de ROS intracelular en las células del cáncer [9-13]. También se determinó el nivel de ROS en KYSE-150 células, lo que demostró que el tratamiento oridonin podría inducir significativamente la sobreproducción de ROS en una forma dependiente de la dosis y el ROS sobre-producido inducida por oridonin podría ser eliminado por el pre-tratamiento de las células con ROS scavenger NAC (Fig 1B). El nivel de ROS intracelular relativa en las células KYSE-150 aumentó de 100,0 ± 23,4% para las células de control a 125,5 ± 6,9%, 142,1 ± 18,2% y 186,6 ± 15,8% para 10 mM, 30 mM y 50 mM oridonin células, respectivamente tratada (Fig 1C). Con el pre-tratamiento de la NAC 2,5 mM durante 1 h, el nivel de ROS intracelular en KYSE-150 células en 50 mM oridonin tratamiento disminuyó de 114,9 ± 14,8% y el pretratamiento con NAC solo, no mostró efectos significativos en el nivel de ROS en células KYSE-150 con un nivel medio de ROS de 105,6 ± 2,8% (figura 1C). Estos resultados implican que oridonin podría inducir a la sobreproducción de ROS en células KYSE-150, los cuales podrían ser eliminados por NAC tratamiento previo.

(A) Efectos de oridonin sobre la viabilidad de las células KYSE-150. (B) ensayo de DCFH-DA de los efectos de NAC en oridonin inducida por la producción de ROS en KYSE-150 células. (C) El análisis estadístico de los efectos de la NAC en oridonin indujo la producción de ROS en KYSE-150 células. (D) Los efectos de ROS scavenger-NAC en oridonin viabilidad inhibido de KYSE-150 células, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001

Para determinar las funciones. de ROS en la actividad contra el cáncer de oridonin, también detectar los efectos de NAC en oridonin inhibieron la proliferación celular KYSE-150. Como se muestra en la figura 1D, la viabilidad de KYSE-150 células fue 14,6 ± 2,5% después de 50 M oridonin tratamiento, que se invirtió para ser 97,8 ± 1,9% en la 1 h de tratamiento previo con NAC 2,5 mM. Estos resultados sugieren fuertemente los efectos de inhibición de oridonin sobre la proliferación celular KYSE-150 en la vía mediada por ROS.

Oridonin inducida mediada por ROS KYSE-150 apoptosis de las células

La inducción de la apoptosis de células de cáncer tiene sido ampliamente estudiada en los últimos decenios, lo que es uno de los indicadores más comunes e importantes que necesitan ser detectado para el desarrollo de medicamentos contra el cáncer. Para aclarar aún más la actividad anticancerígena de oridonin en células de cáncer de esófago humanos, la apoptosis de las células KYSE-150 se determinó por Anexina V-FITC /PI ensayo. Como se indica en la figura 2A, oridonin podría inducir la apoptosis de KYSE-150 células de una manera dependiente de la dosis, y el pretratamiento con NAC podría inhibir la apoptosis inducida por células oridonin KYSE-150. La tasa de apoptosis de KYSE-150 células aumentó de 7,3 ± 1,5% para las células de control a 10,5 ± 1,9%, 24,8 ± 1,5% y 52,4 ± 3,1% después de 10 mM, 30 mM y 50 mM oridonin tratamiento, respectivamente (Figura 2B). Y con el tratamiento previo de NAC, las tasas de apoptosis de KYSE-150 células fueron 13,0 ± 1,3% y 6,7 ± 1,6% con y sin 50 mM oridonin tratamiento, respectivamente (Figura 2B). Oridonin apoptosis inducida de KYSE-150 células eran los más revertido por el tratamiento NAC, que demostró que oridonin inducida KYSE-150 apoptosis de las células estaba estrechamente relacionada con el ROS sobre-producido inducida por oridonin.

(A) Anexina V /ensayo PI de los efectos de NAC en oridonin inducidas KYSE-150 apoptosis celular. (B) El análisis estadístico de los efectos de la NAC en oridonin inducida por apoptosis de las células KYSE-150, *** p & lt;. 0.001

Para determinar si la disfunción de las mitocondrias también estuvo implicado en oridonin inducida KYSE- 150 apoptosis de las células, se analizó el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en respuesta a oridonin exposición por citometría de flujo usando rodamina 123 como una sonda de fluorescencia. Los resultados implican que oridonin podrían inducir la interrupción de la MMP-KYSE 150 células de una manera dependiente de la dosis, y el NAC también podrían revertir este efecto (figura 3A). El análisis estadístico mostró que la señal de fluorescencia relativa de rodamina 123 se redujo de 100,0 ± 1,6% para el control de las células a 98,1 ± 4,7%, 93,4 ± 1,5% y 77,0 ± 8,2% después de 10 mM, 30 mM y 50 mM oridonin tratamiento, respectivamente ( Fig 3B). El pretratamiento con NAC no tuvo efectos significativos sobre la MMP-KYSE de 150 células, que mostró un valor relativo de 99,96 ± 1,82% (figura 3B). Y la señal de fluorescencia relativa de rodamina 123 también aumentó a 97,7 ± 4,4% con el tratamiento previo con NAC y el tratamiento con 50 mM oridonin, lo que indica que oridonin también podría inducir MPP interrupción de KYSE-150 células por vía mediada por ROS. Además, el análisis de la distribución del ciclo celular también demostró que oridonin también podría inducir la detención del ciclo celular de KYSE-150 células en fase G2 /M (Fig A en S1 File). Aunque las tasas de las células en la fase G2 /M no eran dependientes nivel de ROS, pero el pretratamiento con NAC también podría revertir oridonin inducida por la detención del ciclo celular (Fig A en S1 Archivo).

(A) Rodamina 123 de ensayo los efectos de NAC en oridonin indujeron alteración del potencial de membrana mitocondrial en KYSE-150 células. (B) El análisis estadístico de los efectos de NAC en oridonin inducida por la interrupción del potencial de membrana mitocondrial en las células KYSE-150, ** p & lt;. 0.01

El tratamiento de oridonin aumentó significativamente el nivel de ROS en KYSE -150 células, y la sobre-ROS producido indujeron además la interrupción de MMP, la detención de ciclo celular y la apoptosis de KYSE-150 células. Con el pre-tratamiento de la NAC, que no tuvo efectos significativos sobre el estado fisiológico de KYSE-150 células, pero podría quitar el exceso de producción de ROS, oridonin inducida por la interrupción de MMP, la detención del ciclo celular y la apoptosis de las células KYSE-150 se invirtieron de forma espectacular. Estos resultados sugieren fuertemente que las actividades contra el cáncer de oridonin en células KYSE-150 fueron mediados principalmente por el nivel intracelular de ROS de KYSE-150 células inducida por oridonin.

daño morfológico ROS-dependiente de las células KYSE-150

en los últimos años, AFM ha surgido como una poderosa herramienta para obtener imágenes de la morfología a nanoescala y la medición de la fuerza de sensibilidad pico-Newton de células en diferentes estados fisiológicos [26-29]. La súper resolución y alta sensibilidad de la fuerza de AFM también muestran muy amplias aplicaciones para la detección de la apoptosis de células de cáncer tras el tratamiento de drogas, proporcionando una novela información sobre la morfología celular, la biomecánica de células y las funciones de los receptores de la membrana [16, 18, 28]. La morfología de las células está estrechamente relacionada con el estado fisiológico celular y funciones. la apoptosis celular se asocia siempre con una gran cantidad de cambios morfológicos típicos, tales como la condensación del núcleo, formación de ampollas de la membrana y reducir el tamaño del cuerpo celular.

Para resolver los cambios morfológicos precisos de células KYSE-150 inducidos por el tratamiento oridonin y las funciones de los ROS en oridonin inducida por cambios morfológicos de KYSE-150 células, de alta resolución AFM se hizo funcionar durante el estudio de KYSE-150 células. Como se muestra en la figura 4A, controlar KYSE-150 células mostraron formas ovales típicas y las células estrechamente en contacto con otras células. Después se trató con 10 oridonin mu M durante 24 h, no hubo cambios notables en la morfología de KYSE-150 células (Fig 4B). Después de 24 h de tratamiento con 30 mM oridonin, KYSE-150 células mostraron algunas características morfológicas típicas de la apoptosis, incluyendo los cuerpos celulares encogido y el citoplasma condensada (figura 4C). Y por 50 M oridonin células tratadas KYSE-150, se podían observar las características morfológicas más típicos de la apoptosis, tales como la contracción de los cuerpos celulares, la condensación del citoplasma, la condensación y fragmentación del núcleo, la aparición de cuerpos apoptóticos (indicado por las flechas verdes) y las estructuras dañadas pseudopodium para conexiones de las células (figura 4D). Para demostrar el papel de un aumento intracelular nivel de ROS en oridonin inducida por cambios morfológicos de KYSE-150 células, la morfología de KYSE-150 células con el tratamiento previo de NAC 2,5 mM durante 1 h y 50 oridonin mu M durante 24 h también fue investigado por AFM. Las imágenes AFM (Fig 4E) implicado que KYSE-150 células no tenían cambios morfológicos significativos sobre 50 mM oridonin tratamiento debido a la pre-tratamiento de NAC 2,5 mM. Y el tratamiento previo de NAC también no tuvo efectos notables sobre la morfología de KYSE-150 células (Fig 4F). Además, también se encontró que el control KYSE-150 células siempre mostraron zonas claras núcleo (indicado por las flechas azules en la figura 4), que también desaparecieron después oridonin tratamiento y revocados por el pretratamiento con NAC. Estas imágenes de AFM de alta resolución sugirió que oridonin podría inducir daños morfológicos de las células KYSE-150 y estos daños morfológicos también podría ser revertido por NAC tratamiento previo, indicando que AFM se puede utilizar como un NanoTool cualitativa para determinar los cambios morfológicos de células mediada por ROS en células de cáncer apoptosis. Sin embargo, este método de formación de imágenes morfológica basado en AFM se limita al análisis cualitativo de la apoptosis de células cancerosas mediada por ROS, y no es adecuado para el análisis cuantitativo.

imágenes AFM morfología de control (A), (B) 10 M oridonin tratados, (C) 30 M oridonin tratados, (D) 50 mM oridonin tratados, (e) NAC 2,5 mM + 50 mM oridonin tratados y (F) 2,5 mM NAC tratados KYSE-150 células. (A1-F1) imágenes topografía y (A2-F2) su imágenes en 3D de KYSE-150 células correspondientes; (A3-F3) imágenes topografía agrandados en (A1-F1) y (A4-F4) de sus imágenes en 3D de KYSE-150 células correspondientes, barra de escala:. 20 micras

ROS membrana dependiente ultraestructural cambios en las células KYSE-150

ultraestructura de la membrana celular se también se usa ampliamente para evaluar la apoptosis de las células cancerosas por AFM porque los cambios de componentes de la membrana, tales como balsa de lípidos, proteínas de membrana y fosfolípidos, se asocia también con la célula apoptosis [16, 18, 28, 30, 31]. Con la alta resolución de imágenes de AFM, algunos parámetros que describen la propiedad de la membrana celular podrían ser extraídos de las imágenes de AFM ultraestructura para aclarar los cambios en la membrana celular durante la apoptosis. Los efectos de oridonin sobre la ultraestructura de la membrana de KYSE-150 células también se determinaron mediante análisis AFM para investigar los cambios morfológicos más detallados de oridonin inducidas KYSE-150 apoptosis celular. Por imagen ampliada de la membrana celular alrededor de las áreas núcleo, los parámetros ultraestructurales de membrana podrían ser extraídos para el análisis cuantitativo de oridonin inducida KYSE-150 apoptosis celular. Como se muestra en la figura 5, los cambios de estructura de la membrana fueron difíciles de aclarar por la observación directa de imágenes ultraestructura de la membrana de KYSE-150 células. Como se muestra en la Fig 5A4-5F4, la distribución de la altura en la membrana celular y la rugosidad de la membrana celular (incluyendo Rq y Ra) aumentó después de oridonin tratamiento, que luego se invierte con el tratamiento previo de NAC.

morfología AFM y formación de imágenes ultraestructura de la membrana de control (A), (B) 10 M oridonin tratados, (C) 30 M oridonin tratados, (D) 50 mM oridonin tratados, (e) NAC 2,5 mM + 50 mM oridonin tratados y (F) 2,5 mM NAC tratada KYSE-150 células. (A1-F1) Topogrphy imágenes de células KYSE-150, barra de escala: 20 m; (A2-F2) de imágenes ampliadas membrana ultraestructura en (A1-F1) y (A3-F3) su imágenes en 3D de células KYSE-150, la barra de escala correspondiente: 500 nm; (A4-F4) Altura de distribución y la rugosidad de la superficie de la célula ultraestructura analizada a partir de (A2-F2).

Mediante el cálculo de 30 lugares diferentes en 15 celdas diferentes en cada grupo, la altura media, Rq (raíz rugosidad -mean cuadrado) y Ra (rugosidad media) se presentan en la Figura 6. La altura media de la membrana celular KYSE-150 aumentó de 28,9 ± 9,9 nm para el control de las células a 37,1 ± 14,5 nm, 52,7 ± 25,7 nm y 73,7 ± 31,0 nm durante 10 mM, 30 mM y 50 mM oridonin células tratadas KYSE-150, respectivamente (figura 6A). El dramático aumento de tamaño partcle membrana en KYSE-150 células después de 50 M oridonin tratamiento también podría eliminarse con el tratamiento previo de NAC, que mostró una altura media de 29,3 ± 9,0 nm (Fig 6A). Y la altura media de NAC tratada KYSE-150 células fue de 29,0 ± 10,5 nm, que no muestran efectos significativos sobre la membrana distribución de la altura de KYSE-150 células (Figura 6A). Los valores Rq de KYSE-150 células también aumentó, de 8,9 ± 2,8 nm para el control de las células a 10,99 ± 0,69 11,0 ± 3,7 nm, 13,87 ± 1,02 13,9 ± 5,4 nm y 22,6 ± 9,5 nm para 10 mM, 30 mM y 50 mM oridonin células tratadas KYSE-150, respectivamente (Fig 6B). Y si se pretrataron las células con NAC, los valores Rq fueron 9,6 ± 2,7 nm y 9,1 ± 2,7 nm con y sin 50 mM oridonin tratamiento, respectivamente (Fig 6B). Del mismo modo, el valor Ra era 7,1 ± 2,3 nm para las células de control, y aumentó a 8,6 ± 2,8 nm, 10,7 ± 4,1 nm y 18,0 ± 7,7 nm después de 10 mM, 30 mM y 50 mM oridonin tratamiento, respectivamente (figura 6C). El aumento significativo de la AR en KYSE-150 células después de 50 M oridonin tratamiento también podría invertirse con el pre-tratamiento de la NAC para mostrar un valor Ra de 7,5 ± 2,1 nm (Figura 6C). Y la NAC tratada previamente KYSE-150 células sin tratamiento oridonin mostró un valor Ra de 7,2 ± 2,1 nm (Figura 6C). Estos resultados indican que, de forma similar con el nivel de ROS intracelular, tanto la distribución de la altura de la membrana y la rugosidad de membrana de las células KYSE-150 aumentó después oridonin tratamiento de una manera dependiente de la dosis, y el aumento de la distribución de la altura de la membrana y la rugosidad de membrana también podrían invertirse por NAC pretratamiento.

(A) Altura de distribución, (B) raíz media cuadrada rugosidad (Rq) y (C) rugosidad media (Ra) estudió a 2 × 2 micras imágenes ultraestructurales marco de KYSE-150 células, n = 30, * p & lt; 0,05, *** p & lt;. 0.001

es bien sabido que la ultraestructura de la membrana celular está influenciada por varios factores ambientales del estado y subcelulares tales como la motilidad, la adhesión, e intracelular de contactos, por lo que podría convertirse en muy buenos indicadores de la salud o el estado unnormal de las células [32]. La distribución de la altura y la aspereza de la membrana de la célula determinada por AFM son parámetros que describen la estructura de la membrana celular. El aumento de la distribución de la altura de la membrana podría atribuirse a la agregación de las biomoléculas de membrana. Como se informó, el agujero como estructuras llevaría una superficie más rugosa de las células [18]. Y, en general, más moléculas situadas en las membranas plasmáticas, mayor rugosidad de la superficie celular se detectaron mediante AFM [33]. apoptosis de la célula se asocia con la exposición de los fosfolípidos de la membrana interna en la superficie celular, que de este modo produce cambios integrados de potencial electrostático y la hidratación en el prospecto exterior de la membrana celular [34]. Y en la apoptosis mediada por ROS, también se encuentran altos niveles de ROS intracelulares para afectar la estructura o expresión de algunos componentes de la membrana importantes, como los canales transmembrana, receptores y balsa lipídica [35-37].

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