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PLOS ONE: asociada a cáncer fibroblastos de carcinoma hepatocelular promover la proliferación de células malignas por HGF Secretion


Extracto

fibroblastos asociados al cáncer (CAF) son reportados para apoyar la tumorigénesis mediante la estimulación de la angiogénesis, la proliferación de células cancerosas, y la invasión de la mayoría de los tumores sólidos. Sin embargo, los roles de los CAF en el microambiente del cáncer de hígado no se han estudiado a fondo. En nuestro estudio anterior, hemos aislado con éxito los CAF de un carcinoma hepatocelular (CHC) (H-CAF) y demostró que H-CAF suprime la activación de las células NK y por lo tanto crea condiciones favorables para la progresión del HCC. En nuestro estudio, encontramos que la proliferación de las células Hep 3B MHCC97L y se promovió significativamente por el tratamiento con medio condicionado de H-CAF. El análisis anatomopatológico reveló también que H-CAF aumentó la proporción de Ki-67 células malignas (+) y les impidió someterse a la necrosis. Por otra parte, la concentración de factor de crecimiento de hepatocitos de citoquinas (HGF) en el medio de H-CAF acondicionado fue mayor que medio condicionado de fibroblastos de piel normal (NSF). Anti-HGF redujo significativamente la capacidad de proliferación de la promoción de H-CAF. Además, encontramos que la abundancia de H-CAF correlacionó positivamente con el tamaño del tumor. Estos resultados indican que los CAF-H son un factor importante para promover el crecimiento del CHC
in vitro
y
in vivo
, y que el HGF desempeña un papel clave en la proliferación inducida por HCC-H CAF .

Visto: Jia CC, TT Wang, Liu W, Fu BS, Hua X, Wang GY, et al. (2013) asociada a cáncer fibroblastos de carcinoma hepatocelular promover la proliferación de células malignas por HGF secreción. PLoS ONE 8 (5): e63243. doi: 10.1371 /journal.pone.0063243

Editor: Canción Guo Zheng, de la Universidad del Sur de California, Estados Unidos de América

Recibido: 10 de noviembre de 2012; Aceptado: April 1, 2013; Publicado: May 7, 2013

Derechos de Autor © 2013 Jia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por: 973 Estado del Programa Nacional de Investigación básica de China (2009CB522404), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF-30972914, 81000936, 81172036, 81170451, 81170452), Proyecto 985 (82.000 a 3.281.901), Fondos de Investigación Fundamental para la central universidades (10ykpy05), Proyectos llave Estado de enfermedades infecciosas de china (2012ZX10002016-023, 2012ZX10002010-001-007), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (10151008901000208), así como proyecto clave de Ciencias Médicas de la Universidad Sun Yat-sen ( 10YKJC03). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la marcada influencia del estroma tumoral en el crecimiento de las células cancerosas malignas se ha demostrado y se investigaron con entusiasmo en esta era de la terapia dirigida [1], [2]. Como componente principal del estroma tumoral, el aumento de la evidencia ha mostrado que los fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) son un modificador importante de la evolución del cáncer [3], y promover la tumorigénesis [4], la progresión [5], invasión [6] y quimio-resistencia [7] de las células cancerosas por diversos mecanismos. Esto es especialmente cierto para el carcinoma hepatocelular (HCC) [8], [9], porque la mayoría de los casos de CHC pueden derivar de la cirrosis hepática [10]. CAF son principalmente resistentes a la quimioterapia y radioterapia debido a una pequeña proporción de células en proliferación, en contraste con las células malignas [11], lo que hace que los CAF una fuente potencial de progresión tumoral y la recaída [12]. La terapia dirigida hacia la CAF ha mostrado una eficacia prometedora contra el cáncer [6], lo que ha reforzado aún más la necesidad de estudiar la relación entre CAF y sus anfitriones [13].

Sin embargo, poco se conoce acerca de los CAF en el CHC (H-CAF). H-CAF se aislaron y se caracterizaron en nuestro estudio anterior [8], que era comparable al estudio de Antonio [9] Mazzocca. Se encontró que el H-CAF células NK educados para adquirir un fenotipo desactivado y crean una condición que no responde en los tumores [8]. Además, el estudio de Antonio [9] Mazzocca indica que el ácido lisofosfatídico (LPA) acelera la progresión de la HCC mediante el reclutamiento de fibroblastos peri-tumorales (PTF) y la promoción de su transdiferenciación en miofibroblastos. Sin embargo, ese estudio no determinó el impacto de la CAF sobre las células de cáncer de hígado in vitro. El papel de la H-CAF en el CHC es desconocido. Se necesitan más estudios para obtener la vista completa de la diafonía entre H-CAF y HCC en el huésped.

Se cree que los CAF para ser activado, el cual se caracteriza por la expresión de α-actina de músculo liso (α -SMA), proteína de activación de fibroblastos (FAP), proteína de la superficie de fibroblastos (FSP), y vimentina [1] - [3]. Esto concede activación CAF múltiples funciones en la promoción del desarrollo del cáncer, tales como facilitar la angiogénesis, la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [14], la quimio-resistencia [5], [7], la disfunción del sistema inmune local [6], [8], e incluso más fundamentalmente, la proliferación de células malignas [1] - [3]. Sin embargo, la clave mecanismo molecular y funcional vía de señalización que participan en estos procesos biológicos son poco conocidos y lejos de ser investigado a fondo.

En el presente estudio, hemos tratado de dilucidar el papel de CAF-H en la promoción de la proliferación celular HCC y el mecanismo subyacente.

Materiales y Métodos

pacientes y la elegibilidad

Hemos investigado una serie consecutiva de 43 pacientes con diagnóstico histológico de carcinoma hepatocelular, que fueron admitidos en la Tercera Afiliado el hospital de la Universidad Sun Yat-sen (Guangzhou, china) entre noviembre de 2008 y agosto de 2011. los pacientes fueron incluidos con los siguientes criterios de inclusión: (a) confirmado patológicamente como HCC, (b) age≥18, (c) tratado con escisión radical para el CHC, (d) la disponibilidad de datos de la TC para la morfología del tumor, (e) la falta de terapia contra el cáncer, tales como la quimioembolización arterial transcatéter (TACE), sorafenib, quimioterapia y radioterapia antes de la cirugía. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, China. Un escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes en el momento de la admisión. Las muestras incluidas en parafina y los datos clínicos fueron recuperados para cada paciente.

El aislamiento de los fibroblastos primarios de muestras de HCC

Las muestras tumorales fueron obtenidas de pacientes con HCC, muestras hepáticas normales se obtuvieron de pacientes hemangioma hepático y las muestras de prepucio se obtuvieron de donantes sanos que pertenecen al Tercer hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen. El diagnóstico de CHC en todos los pacientes que se sometieron a hepatolobectomy fue confirmada por pruebas clínicas y patológicas. Las muestras fueron codificadas de manera anónima, de acuerdo con las directrices éticas locales (como se estipula en la Declaración de Helsinki), y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los pacientes y voluntarios sanos. El trabajo se llevó a cabo en estricta conformidad con el diseño del estudio tal como fue aprobado por el Comité de Ética Clínica de Investigación del Hospital Afiliado En tercer lugar en la Universidad Sun Yat-sen en Guangzhou, China.

H-CAF fueron aisladas de la región cancerosa y fibroblastos no cancerosos (NFS) incluyen tres tipos de fibroblastos: fibroblastos peritumoral (PTF) tomadas de tejido al menos 2 cm distal al margen exterior de la masa de cáncer, fibroblastos derivados de hemangioma benigno hepática como fibroblastos normales del hígado (SNL) y fibroblastos obtenido a partir de prepucio como fibroblastos de piel normal (NSF). Los tejidos se desmenuzaron y se digirieron en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco-BRL, Grand Island, NY), 1 mg /ml de colagenasa tipo I ( Sigma, St. Louis, MO) y 100 U /ml de hialuronidasa (Sigma, St. Louis, MO) a 37 ° C durante 6 a 8 horas, se lavaron dos veces con PBS (Sigma, St. Louis, MO) y se centrifugó a 450 g durante 8 minutos cada vez. Finalmente, se resuspendieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, 100 UI /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, y luego se cultivó a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 medio ambiente. tripsinización diferencial se aplicó durante sub-cultivo para seleccionar para el crecimiento de los fibroblastos. El porcentaje de fibroblastos purificado fue 95% después de 2-3 pasajes, que se determinaron por inmunofluorescencia, transferencia de Western y citometría de flujo usando anticuerpos contra vimentina, citoqueratina, FAP, y α-SMA. los experimentos se llevaron a cabo utilizando estas células dentro de 3-10 pasajes.

Células y cultivo celular

La línea celular HCC Hep3B (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU.) fue cultivada en Medio esencial mínimo (MEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY) suplementado con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml) y 10% de FBS. células MHCC-97L (97L; Instituto del cáncer de hígado, Zhongshan Hospital, la Universidad de Fudan, Shanghai, China) se mantuvieron en Dulbecco modificada de Eagle (DMEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY) suplementado con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml), L-glutamina (300 mg /ml) y 10% de FBS. células LO2 (obtenidos de nuestro laboratorio de almacenamiento) se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY) suplementado con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml) y 10% de FBS. Todas las células se pasaron a una relación de 1:4 cada 4-5 días.

Colección de medio condicionado y ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

Para la recogida de medio condicionado de estos fibroblastos, células de fibroblastos se sembraron en 75 cm
2 frascos, se lavaron dos veces con PBS 4 días más tarde, y se incubaron durante 48 horas con DMEM libre de suero. A continuación, se recogió el sobrenadante, se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos, pasado a través de un sistema de filtración Millipore ml estéril 50 con un difluoruro de polivinilideno de membrana de 0,45 micras y se almacena en un -80 ° C refrigerador para su uso posterior.

Para medir las citocinas solubles en el medio condicionado, 2 × 10
5 fibroblastos se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 horas, y se recogió el medio acondicionado para ELISA. El mismo método se utilizó para obtener un medio acondicionado a partir de células LO2. Los niveles de estroma humano factor derivado de células-1 (SDF-1), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se determinaron usando kits de ELISA humanos (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) según las instrucciones del fabricante.

Immunoblotting

la proteína total se extrajo utilizando tampón RIPA después los pocillos se lavaron al menos 3 veces con tampón PBS. Las proteínas se separaron en un 12% SDS-PAGE, inmunotransferencia con un anticuerpo contra la α-SMA (Abcam, Cambridge, MA), FAP (Abcam, Cambridge, MA), vimentina (Abcam, Cambridge, MA) y β-actina (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA) y luego se visualizaron con el sistema de quimioluminiscencia (GE, Buckinghamshire, Reino Unido).

inmunofluorescencia (IF)

las células se fijaron en metanol enfriado con hielo (en 4 ° C durante 15 minutos), se lavaron con PBS, se bloquearon con 3% de BSA, y se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se inmunotiñeron para la α-SMA, FAP, vimentina, FSP (Sigma, St. Louis, MO) y citoqueratina (Dako, Carpinteria, CA). Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 488 de cabra anti-IgG de ratón (H + L) y Alexa Fluor 546 de cabra anti-IgG de ratón (H + L) (Molecular Probes, Grand Island, NY). Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO). Las imágenes fueron vistos bajo un microscopio de fluorescencia (Leica DMI 4000B, Solms, Alemania) y se analizaron mediante el software Leica Application Suite (versión 4.0).

La inmunohistoquímica

Los tejidos fueron fijados en el 4% paraformaldehído (PFA; Sigma, St. Louis, MO), se incluyeron en parafina y se cortan en secciones de 4 micras de espesor. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada, se llevó a cabo la recuperación de antígenos, y los portaobjetos se tiñeron con anticuerpos primarios contra Ki-67 (Abcam, Cambridge, MA), α-SMA y CD31 (Abcam, Cambridge, MA), que fueron utilizados en las diluciones indicado por el fabricante. Inmunorreacciones fueron detectados por el sistema Dako Envision-Cytomation HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca), y las secciones se contratiñeron con hematoxilina (Sigma, St. Louis, MO). Los controles negativos únicamente se tiñeron con el anticuerpo secundario.

H-CAF fueron identificados por α-SMA inmunoreactividad. La población de H-CAF se clasificó en los patrones de intensidad alta o baja intensidad de tinción de acuerdo con los criterios descritos anteriormente [14].

La proliferación celular ensayo

HCC células (células 97L) se chapada en una densidad de 2 × 10
3 células por triplicado en una placa de 96 pocillos (Corning Life Sciences, Lowell, MA). Se añadió medio acondicionado que contiene 10% de FBS de las muestras de fibroblastos o de células LO2 y intercambiado por 4 a 5 días, y DMEM suplementado con 10% FBS se utilizó como control. La proliferación celular se midió utilizando el Recuento celular Kit-8 (Dojindo, Rockville, MD) de acuerdo con el protocolo del fabricante.


In vivo
efecto de H-CAF sobre el crecimiento tumoral

Un modelo de xenoinjerto de cáncer de hígado se estableció con éxito para evaluar el efecto de H-CAF sobre el crecimiento tumoral en el presente estudio. De cuatro a seis semanas de edad, de sexo masculino ratones BALB /c desnudos fueron adquiridos de Tong Wei Li Hua Company (Pekín, China) y se mantuvieron en jaulas ventiladas de presión en el Instituto de Investigación de Vacunas de la Universidad Sun Yat-sen. Las células 97L (5 × 10
6) solo como control o mezclado con cualquiera de los CAF (5 × 10
6) o NFS (5 × 10
6) se suspendieron en un tubo de 0,5 ml y se inyecta por vía subcutánea (sc) en ratones desnudos. tamaños tumorales se midieron de forma rutinaria con VERNIER cada 3 días, y los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la siguiente fórmula: π /6 x diámetro mayor x diámetro menor)
2. Los datos fueron presentados como una gráfica de los volúmenes tumorales medios en función del tiempo en días. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Sun Yat-sen y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Tercer Hospital Afiliado (Permiso Número: 0021942).

el análisis estadístico

los datos se presentan como la media ± SEM, y se utilizó la prueba t de Student para comparar la diferencia entre dos grupos.
P
los valores inferiores a 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Las diferencias significativas para los datos continuos en las características clínicas entre los dos grupos (H-CAF de alta intensidad frente a H-CAF baja intensidad) se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney.

Resultados

Aislamiento, cultivo y caracterización de H-CAF

H-CAF se aislaron a partir de tejidos tumorales primarias y se cultivaron de acuerdo con los métodos descritos en nuestro estudio anterior [8]. H-CAF mostró la expresión de alto nivel de α-SMA, FAP, FSP, vimentina y fibronectina de acuerdo con el análisis de inmunofluorescencia (Fig. 1A), que se confirmó por transferencia Western (Fig. 1B). Además, como la característica clave de H-CAF y fibroblastos activados, se detectó la expresión de α-SMA en los tejidos tumorales primarios mediante inmunohistoquímica para confirmar la presencia de H-CAF en muestras de tumor. la expresión de CD31 fue evaluada para descartar la presencia de células endoteliales vasculares, que co-expresan α-SMA y CD31. Los resultados demostraron que los CAF-H fueron más abundantes en los tejidos tumorales en comparación con peri-tumoral y tejido normal del hígado (fig. 1C).

(A) La expresión de α-SMA, FAP, FSP, vimentina, fibronectina y citoqueratina en los cuatro tipos de fibroblastos purificadas cultivadas durante 3-10 pasajes se determinó mediante la tinción de inmunofluorescencia. Todos los cuatro tipos de fibroblastos mostraron alta expresión de los marcadores mesenquimales FSP, vimentina y fibronectina. SNL, H-CAF, PTF y SNL muestran alta expresión de α-SMA, lo que sugiere que existen estos fibroblastos en un estado activado en condiciones de cultivo celular. Sin embargo, otra característica de activación FAP fue altamente expresado en H-CAF y PTF, pero no en los archivos NSF y los SNL. (B) Western Blot mostró diferencias en α-SMA y FAP expresión entre los cuatro fibroblastos. En consonancia con los resultados de la tinción de inmunofluorescencia, H-CAF, PTF y SNL muestran alta expresión de α-SMA. FAP fue altamente expresado en H-CAF y PTF, pero no en los archivos NSF y los SNL. (C) La distribución de los CAF-H identificados por α-SMA (+) CD31 (-) expresión en cada muestra de maligno, peri-tumoral y regiones normales del hígado se detectó mediante inmunohistoquímica en secciones patológicas de serie. expresión α-SMA se detectó para confirmar la presencia de H-CAF. Además, se evaluó la expresión de CD31 para excluir la presencia de células endoteliales vasculares, que co-expresan α-SMA y CD31. H-CAF fueron más abundantes en el tejido tumoral, en comparación con la peri-tumoral y tejido normal del hígado.

Sin embargo, los PTF expresa un nivel similar de α-SMA, FAP, FSP, vimentina y fibronectina a H -CAFs
in vitro gratis (Fig. 1A), el cual fue confirmado por Western Blot (Fig. 1B). SNL muestra una expresión significativamente menor de FAP en comparación con H-CAF
in vitro
, y no hubo diferencias significativas en los otros biomarcadores (Fig. 1A y la Fig. 1B). La expresión de α-SMA y FAP fue extremadamente baja en los archivos NSF en contraste con H-CAF, que se demostró por inmunofluorescencia y Western Blot (Fig. 1A y la Fig. 1B).

H-CAF promueve la proliferación de células de HCC tanto
in vivo
y en
in vitro

CCK-8 pruebas demostraron que la proliferación de las células Hep 3B 97L y se incrementó significativamente por el tratamiento con medio condicionado de los SNL , PTF y H CAF en comparación con el medio condicionado de los archivos NSF o el grupo de control
in vitro
. Estos resultados sugieren que la H-CAF poseen un efecto pro-proliferativa en células de HCC (Fig. 2A y Fig. 2B).

(A y B) células 97L (A) y células Hep 3B (B) se cultivaron en medio condicionado de fibroblastos diferentes, y la proliferación de células malignas se ensayó por análisis de CCK-8. SNL, PTF y H-CAF aumentó significativamente la proliferación de células HCC con relación a NSFs y el grupo control. (C y D) un modelo de xenoinjerto /c nude mouse BALB basado en la co-inyección de células HCC con o sin dos tipos de fibroblastos (NSFs o H-CAF) se utilizó para investigar la
in vivo
interacción entre Las células H-CAF y el CHC. Los volúmenes tumorales de los nodos de tumor generados por la co-inyección de células de HCC y H CAF fueron consistentemente significativamente más grandes que las formadas por las células de HCC sin co-inyección de H-CAF. NSFs no aumentó significativamente el crecimiento tumoral con respecto al control. Además, los fibroblastos no generaron tumores cuando se inyectan solos. (C) los especímenes de tumor macroscópico al final del experimento se muestran. tumores de HCC más grandes se forman cuando las células de HCC son co-inyectados con H-CAF (n = 5 por grupo) (D). (*
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01).

Para evaluar la contribución de H-CAF y los archivos NSF en términos de tumor el crecimiento
in vivo
, se estableció un sistema de xenoinjerto de cáncer de hígado como se describe en la sección Métodos. Los ratones desnudos se inyectaron por vía subcutánea con células de HCC, células de fibroblastos, o con células de HCC y células de fibroblastos. El crecimiento del tumor registran para un máximo de 28 días después de la inyección de células. la medida del tamaño del tumor mostró que la implantación de H-CAF o NSFs puros no dio lugar a la formación de tumores. Además, co-inyección de H-CAF contribuyó a la generación de tumores más grandes (HCC + H-CAF
vs
HCC,
P
. & Lt; 0,05, n = 5) en contraste con la co-inyección de NSF, que no mejoran la formación de la masa del tumor o crecimiento (CHC + NSFs
vs
HCC,
P Hotel & gt;.; 0,05, n = 5). (figura 2C y Fig. 2D).

Además, esta capacidad promoción fue confirmada por el porcentaje de células tumorales Ki-67-positivas en los nodos de tumor. El Ki-67 (+) abundancia refleja directamente la creciente fracción de los tejidos tumorales. Como era de esperar, los tumores formados por HCC y H-CAF muestran expresión Ki-67 fuerte y densa, mientras que los otros dos grupos mostraron moderadas y dispersas Ki-67 tinción (Fig. 3A). Curiosamente, se encontró una alta incidencia de células Ki-67-positivas alrededor de fibroblastos dentro de secciones en serie, en particular en regiones con necrosis masiva, lo que sugiere además la función promotora de los fibroblastos en la supervivencia de células tumorales (Fig. 3B).

(a) Ki-67 expresión en células de HCC fue sustancialmente más alta en los nodos de tumor formado por la co-inyección de células 97L y H CAF, que estaba en contraste con los resultados de los tumores formados por la co-inyección de 97L y NSFs o células 97L solo. células (B) Ki-67-positivas eran abundantes α-SMA (+) CD31 cerca de (-) fibroblastos dentro de las secciones tumorales de serie. En las muestras que fueron doble immunostained con α-SMA (de color rojo, negro fila) y CD31 (de color marrón, rojo fila), CD31 no se expresa en las células α-SMA-positivas (panel superior). Cuando doble inmunotinción con α-SMA (color rojo) y Ki-67 (color marrón), una alta incidencia de células tumorales con Ki-67 expresión (de color marrón, la fila de color rojo) se observó que se encuentra en las proximidades de H-CAF con α -SMA-positivas tinción (de color rojo, negro fila) (panel inferior). (C) Necrosis se redujo masivamente en los nodos de tumor generados por la co-inyección de fibroblastos (+ NSFs o + H CAF), en comparación con los tumores formados por la inyección de células 97L solo (control). expresión (D) α-SMA se observó en todos los xenoinjertos de tumores, incluyendo los ganglios tumorales formados sin fibroblastos co-inyección (grupo de control).

Este crecimiento tumoral mejorado nodo podría ser no sólo reforzada por la proliferación promoción, sino también el apoyo de evitar necrosis. Necrosis se produjo en los nodos de tumor de los tres grupos cuando el diámetro nodo aumentó a un cierto nivel. Curiosamente, las regiones necróticas dentro de las secciones en serie eran mucho más pequeños en las masas tumorales desarrolladas con fibroblastos (Fig. 3C). Además, las células tumorales remanentes en las regiones necróticas se distribuyeron alrededor de fibroblastos que expresan α-SMA, lo que indica fuertemente el papel de supervivencia de los fibroblastos para células malignas (Fig. 3B)
.
Además, se observó un fenómeno interesante en nuestro experimento. H-CAF también se observaron en los nodos de tumor formado por sólo las células de HCC, lo que sugiere que las células tumorales pueden inducir ciertas células con origen desconocido para transformar en CAF (Fig. 3D).

HGF está implicado en la mejora de la proliferación de células de HCC

fue altamente indicó que H-CAF podría comunicarse con las células de HCC por los modos paracrinos debido H-CAF medio condicionado promovió la proliferación de células de HCC. Por lo tanto, los factores de crecimiento y quimiocinas pueden ser los principales mediadores a través del cual los fibroblastos se comunican con las células cancerosas. Medimos los niveles de citoquinas cuatro informes anteriores, SDF-1 [15], el HGF [16], el TGF-β [1], [3] y EGF, en el medio de la H-CAF acondicionado. El ELISA demostró que la concentración de HGF en el medio de H-CAF acondicionado era el más alto entre los cuatro tipos de fibroblastos. PTF también ha demostrado un alto nivel de secreción de HGF, sin diferencia significativa en comparación con el H-CAF. HGF secretado por los SNL se redujo significativamente en comparación con el H-CAF y presentó una tendencia a la baja en comparación con los PTF. Por otra parte, NSFs no segregan HGF. Estos resultados indican que la secreción de HGF se correlacionó con el tipo de fibroblastos. Sin embargo, esta tendencia similar que no se observó en las concentraciones de SDF-1, TGF-β o EGF secretada por las diferentes fibroblastos (Fig. 4A).

(A) El nivel de SDF-1, HGF, TGF-β y EGF en el medio condicionado derivado de H-CAF se determinó por ELISA. H-CAF y PTF secretan HGF a niveles significativamente más altos que los SNL, mientras que los archivos NSF secretada HGF casi no detectable. Sin embargo, NSFs secretada un mayor nivel de SDF1 que los otros tres tipos de fibroblastos. TGF-β y la secreción de EGF fueron similares para los cuatro tipos de fibroblastos. proliferación (B) de la célula aumentó tras la exposición a diferentes concentraciones de HGF, como se demuestra por CCK-8 pruebas. HGF promueve la proliferación celular HCC en todos los niveles de concentración. (C) El aumento de la proliferación de células de HCC como mediada por H-CAF medio acondicionado se antagoniza significativamente por el anticuerpo HGF neutralizante. Por otra parte, anti-HGF no interfirió con la proliferación de células 97L. (*
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01).

Es interesante observar que la tendencia de la producción de HGF fue consistente con la de el crecimiento del volumen del tumor, lo que condujo a la hipótesis de que HGF jugó un papel mediador en la proliferación HCC facilitado por H-CAF (Fig. 2D y Fig. 4A). De acuerdo con ello, el HGF se analizó con CCK-8 pruebas para determinar su potencial proliferativo. Los resultados fueron positivos para todos los grupos a diferentes concentraciones de HGF (Fig. 4B). Además, anti-HGF se administró a antagonizar el efecto de H-CAF medio acondicionado en las células de HCC y redujo significativamente la proliferación (Fig. 4C). Además, el HGF no se detectó en el medio acondicionado de las células 97L, que excluía el HGF autocrina vía estimulante de células de HCC. Este hallazgo se evidenció por el hecho de que el anti-HGF no interfirió con la proliferación de células 97L (Fig. 4C). Sin embargo, la proliferación no se eliminó completamente, lo que implicaba que el HGF no es la única citoquina implicada en el mecanismo molecular de la proliferación de células malignas mediada por H-CAF.

HGF secretado-H-CAF inducida por la proliferación de células HCC

Además, se analizaron los niveles de HGF en medio condicionado de H-CAF, los hepatocitos normales (LO2) y células de HCC (97L y Hep 3B) por ELISA para excluir la posibilidad de un mecanismo autocrino HGF. Nuestros resultados muestran una gran diferencia en la secreción de HGF entre H CAF y las células del hígado derivadas independientemente de la naturaleza maligna. Además, el HGF no se detectó en LO2 medio acondicionado (Fig. S1A). Para examinar el papel específico de los CAF-H en la progresión del HCC más, se comparó la capacidad de proliferación de la promoción de H-CAF a la de las células LO2. Nuestros resultados muestran que H-CAF tuvo un efecto mucho más fuerte sobre la proliferación de células HCC que LO2. Todos nuestros hallazgos sugieren que la proliferación celular HCC no es causada de una manera autocrina (Fig. S1B). Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la proliferación de HCC se promueve de una manera paracrina por HGF secretado por H-CAF.

activación patológica es una de las características clave de H-CAF

Se encontraron similitudes en la mejora fenotipo y la proliferación entre los SNL, PTF y H-CAF (Fig. 1A, Fig. 1B, Fig. 2A y Fig 2B) en
in vitro
experimentos, incluyendo la expresión α-SMA. Sin embargo, los fibroblastos derivados de las regiones del tejido tumoral, el tejido peri-tumor y los tejidos normales del hígado expresaron diferentes niveles de α-SMA, el marcador específico de la activación de fibroblastos. Esta inconsistencia en los resultados podría ser causado por el hecho de que los fibroblastos se transformará de un fenotipo estática, pericitos parecido a un fenotipo activado se asemeja a miofibroblastos después de unos días de cultivo
in vitro
. En comparación con un estudio anterior, los fibroblastos normales se activan después de 1 semana de la cultura
in vitro
, que se caracteriza por la expresión de α-SMA (figura 1A y la Fig. 1B). Por lo tanto, era lógico que la hipótesis de que los PTF y los SNL eran estáticas en los tumores y se activan durante el cultivo. Además, H-CAF fueron relativamente activan en tumores. Consistente con esta hipótesis, el presente estudio mostró que los PTF y los SNL eran "como pericitos", mientras que H-CAF eran "miofibroblastos como" cuando fueron originalmente aisladas de muestras de tumor (Fig. 5A). A fin de probar esta hipótesis, se utilizó inmunofluorescencia para detectar la expresión de α-SMA entre diferentes tipos de fibroblastos se incubaron durante 24 horas después del aislamiento de tejido original. Como se muestra en la figura 5B, H-CAF estaban en una fase activa, como se indica por la expresión de α-SMA, mientras que los PTF y SNL presentan un fenotipo de reposo, como se demuestra por tinción negativa α-SMA, lo que indica que la activación patológica puede ser la razón principal por la diferencia entre los fibroblastos normales y H CAF.

(a) imágenes microscópicas de H-CAF, PTF y NSFs incubadas durante 24 horas. Cuando originalmente aislado de las muestras de tumor, los PTF y los SNL presentados con un fenotipo estática, pericitos similar, mientras que H-CAF albergaba un fenotipo activado se asemeja a miofibroblastos. (B) La expresión de α-SMA, FAP, FSP y fibronectina en H-CAF, PTF y NSFs se incubaron durante 24 horas se determinó mediante la tinción de inmunofluorescencia. α-SMA expresión fue notablemente mayor en H-CAF y relativamente inexistente en los otros tipos de fibroblastos cuando se analizan inmediatamente después de la cosecha a partir de muestras tumorales. Esta diferencia sugiere la naturaleza patológicamente activado de H-CAF y la naturaleza relativamente estática de los otros fibroblastos dentro de los tejidos originales.

La presencia de H-CAF se correlaciona positivamente con el tamaño del tumor

Para determinar la importancia clínica de H-CAF en el contexto del crecimiento del tumor, se determinó la presencia de CAF-H en las muestras tumorales obtenidas de 43 pacientes por α-SMA inmunoreactividad. Nuestros resultados muestran que veintisiete muestras de los pacientes muestran un alto nivel de tinción para H-CAF, mientras que las muestras restantes dieciséis presentados con un bajo nivel de tinción para H-CAF (Fig. 6A). En particular, la agregación de H-CAF se asoció significativamente con un mayor tamaño del tumor (Fig. 6B y el cuadro S1), lo que sugiere una correlación positiva entre la abundancia relativa de H-CAF y el crecimiento tumoral en el nivel clínico.

(A) La abundancia de H-CAF fue dicotomizada en dos niveles, de alta densidad y baja densidad. (B) Los volúmenes del tumor del grupo de alta densidad (n = 27) fueron significativamente superiores a los volúmenes tumorales del grupo de baja densidad (n = 16,
P
= 0,006).

Discusión

el carcinoma hepatocelular (CHC) es la quinta forma más frecuente de cáncer y la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer, que representan el 90% de todos los casos de cáncer primario de hígado. El papel del microambiente del tumor durante la carcinogénesis se ha estudiado ampliamente como un sistema dinámico orquestado por células inflamatorias, incluyendo las células cancerosas. El microambiente de HCC se compone de fibroblastos, la invasión de células inflamatorias, células endoteliales (EC), pericitos adyacentes a la ECs, y componentes amplios de la matriz extracelular (ECM). fibroblastos Carcinoma-asociado (CAF) son uno de los componentes más importantes del microambiente HCC. En nuestro estudio anterior, hemos aislado con éxito fibroblastos específicos de carcinoma asociada de HCC (H-CAF) de HCC tejidos primarios y demostró que H-CAF suprime la activación de las células NK y creó un escudo inmunosupresor favorable para las células de HCC.

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