Extracto
baicaleína, una medicina herbal china ampliamente utilizado, tiene múltiples actividades farmacológicas. Sin embargo, los mecanismos precisos de los anti-proliferación y anti-metastásicos efectos de baicaleína sobre el cáncer de la vesícula biliar (GBC) siguen siendo poco conocidos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar los anti-proliferación y anti-metastásicos efectos de baicaleína y el mecanismo relacionado (s) en el GBC. En el presente estudio, se encontró que el tratamiento con baicaleína indujo un efecto inhibidor significativo sobre la proliferación y promueve la apoptosis en GBC-SD y SGC996 células, dos líneas celulares de cáncer de vesícula biliar ampliamente usados. Además, el tratamiento con baicaleína inhibe la metástasis de las células GBC. Por otra parte, hemos demostrado por primera vez que baicaleína inhibe el crecimiento celular y la metástasis GBC a través de la regulación por disminución del nivel de expresión de la proteína con dedos de zinc ligada al cromosoma X (ZFX). En conclusión, nuestros estudios sugieren que la baicaleína pueden ser un potencial flavonoide fitoquímico para la terapéutica de GBC y ZFX puede servir como un marcador molecular o diana de predicción para GBC
Visto:. Liu TY, Gong W, Tan ZJ, Lu W, Wu XS, Weng H, et al. (2015) baicaleína inhibe la progresión de las células del cáncer de la vesícula biliar mediante la regulación negativa ZFX. PLoS ONE 10 (1): e0114851. doi: 10.1371 /journal.pone.0114851
Editor Académico: Geun Seok-Lee, de la Universidad de Kyung Hee, Corea, República de
Recibido: Enero 16, 2014; Aceptado: 13 Noviembre 2014; Publicado: 24 Enero 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81172026, 81272402, 81301816 y 81172029), Nacional de investigación de alta Tecnología y Desarrollo (Programa 863) (núm 2012AA022606), Fundación para la investigación interdisciplinaria de la Universidad de Shanghai Jiao Tong (núm YG2011ZD07) , la ciencia y Shanghai proyecto de cooperación internacional de tecnología comisión intergubernamental (Nº 12410705900), Shanghai proyecto de guía de la ciencia médica y la tecnología comisión (Nº 12401905800), Programa de Changjiang estudiosos, la Fundación de Investigación de Ciencias Naturales de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (núm 13XJ10037), programa líder de Talento de Shanghai, el programa de vela de la ciencia y la tecnología comisión de Shanghai (14YF1403000) y la Fundación de Investigación Especializada para el programa de doctorado de Educación Superior con prioridad campo de desarrollo (No. 20130073130014). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de la vesícula biliar (GBC) es el quinto cáncer más común del tracto biliar, que se caracteriza por principios de invasión ganglionar y metástasis a distancia [1-3]. Tiende a ser un tumor agresivo que se disemina temprano y se presentan el 90% de los pacientes del GBC en un estadio avanzado, inoperable [4, 5]. El carcinoma de vesícula biliar temprana es asintomática o se manifiesta sólo como una molestia abdominal. Algunos pacientes pueden desarrollar los síntomas de la colecistitis aguda o crónica, que es fácil pasar por alto o se pierda. En el último período, los pacientes pueden desarrollar dolor abdominal, ictericia y angular, pero la mayoría de los pacientes no tienen oportunidades quirúrgicas. El pronóstico del carcinoma de vesícula biliar avanzada es muy pobre [6-10], y la tasa de supervivencia a 5 años es de sólo alrededor del 5%. Hasta el momento, la resección quirúrgica es el único tratamiento que ofrece una esperanza de curación [11]. Por lo tanto, es muy importante identificar biomarcadores fiables y medicamentos para el control de tanto la progresión y tratamiento de la enfermedad
.
baicaleína es uno de los ingredientes eficaces extraídas de
labiadas
plantas
Scutellaria baicalensis Georgi raíz seca de búsqueda: 's, que tiene muchos efectos farmacológicos tales como,,, anti-alérgico, anti-oxidación antiinflamatorio antibacteriano anti-viral y así sucesivamente [12-14]. Recientemente, el efecto anti-tumor de baicaleína ha causado más y más atención de la gente. experimentos celulares y animales han demostrado que la baicaleína tenían una fuerte actividad anti-tumor. Por ejemplo, baicaleína activado Ahr y obtenerlas de la degradación de la ciclina D1, que causa la detención del ciclo celular en la fase G1, e induce la inhibición de la proliferación celular [15]. Baicaleína inhibe DMBA piel /inducida por TPA tumorigenesisin ratones mediante la modulación de la proliferación, la apoptosis y la inflamación [16]. Baicaleína abroga especies reactivas del oxígeno (ROS) mediada por la disfunción mitocondrial durante la carcinogénesis pulmonar experimental
in vivo
[17]. Baicaleína puede jugar un papel importante en efecto inhibidor sobre la proliferación de células de cáncer de ovario [18]. Debido a su espectro anti-tumor de ancho, fuente de medicina adecuada, poca toxicidad y los efectos secundarios, baicaleína parece ser un marcador molecular prometedor objetivo terapéutico o de cáncer de vesícula biliar.
proteína de dedo de cinc, ligada a X (ZFX) es un factor de transcripción codificado por su gen en el cromosoma X de los mamíferos. El ZFX juega un papel clave en el control de la auto-renovación y mantenimiento tanto de células madre embrionarias y células madre hematopoyéticas [19-23]. El nivel de expresión de ZFX se correlaciona con la agresividad y la gravedad en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata, cáncer de mama, glioma maligno humano y la leucemia. La investigación anterior mostró que ZFX puede jugar un papel crítico en la proliferación celular, la distribución del ciclo celular y la apoptosis en muchas células de cáncer [24-29]. Nuestro anteriormente también resultados encontraron que ZFX puede implicar en la regulación de la proliferación y migración celular en cáncer de vesícula biliar [30]. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para investigar los efectos y mecanismos de baicaleína contra la proliferación de cáncer de vesícula biliar celular, invasión y metástasis
in vitro Opiniones y en un modelo de tumor de vesícula biliar ortotópico
in vivo
. Por otra parte, el ZFX se había demostrado como el blanco de abajo baicaleína, que pueden ofrecer un nuevo enfoque prometedor en el tratamiento eficaz de carcinoma de vesícula biliar.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
ratones desnudos (con un peso corporal inicial de 20-22 g) se obtuvieron de Shanghai SLAC animales de laboratorio Co, Ltd (Shanghai, china). Todos los tratamientos con animales se realizaron en estricta conformidad con las normas éticas internacionales y los Institutos Nacionales de Salud de Guía en relación con el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Shanghai Jiao Tong.
Líneas celulares y cultivo
GBC-SD y SGC996 células fueron adquiridos de la Shanghai Instituto de Células País Banco de Células . Las células GBC-SD se cultivaron en DMEM de alta glucosa (Gibco, EE.UU.) y las células se cultivaron en SGC996 RPMI1640 (Gibco, EE.UU.). Todo de las dos células se complementaron con 10% de suero bovino fetal (Gibco, EE.UU.), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina (Hyclone, EE.UU.), a 37 ° C, bajo una atmósfera de CO2 5,0%.
Drogas y anticuerpos
el baicaleína se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, EE.UU.), disuelto en DMSO como una concentración de reserva de 100 mmol /l, y se almacena en la oscuridad a -20 DO. Higo. La figura 1 muestra la estructura química de baicaleína. Las concentraciones finales baicaleína utilizados para los diferentes experimentos se prepararon por dilución de la solución madre con DMEM de alta glucosa o RPMI1640. Los anticuerpos utilizados para el Western Blot fueron los siguientes: de conejo anti-caspasa-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-ciclina A, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti-MMP2 , anti-MMP9, anti-ZFX y el ratón anti-β-actina. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología.
La fórmula molecular de baicaleína es C15H10O5and su peso molecular es 270,24.
3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -2, 5 difenil tetrazolio (MTT) ensayo de
sensibilidad a los fármacos se determinó usando el ensayo de MTT. Brevemente, las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning, EE.UU.) a una densidad de 5 x 10
3 células por pocillo. Las células se cultivaron durante la noche y después se rellenaron con medio que contenía diversas concentraciones frescas (0, 15, 30, 60, 120, y 240 mmol /L) de baicaleína para 24, 48, y 72 h. A partir de entonces, 20μl de MTT (Sigma-Aldrich) disuelta en PBS a 5 mg /ml se añadió directamente a todos los pocillos, y las placas se incubaron durante 4 horas a 37 ° C. Los cristales de formazán que se formaron se disolvieron en 100 l de DMSO después de la eliminación del sobrenadante. La densidad óptica se registró a 490 nm en un lector de microplacas (Bio-Tek, EE.UU.). Los resultados representan la media de 3 experimentos independientes realizados, sobre varios días. El porcentaje de viabilidad celular se calculó como sigue:
formadoras de colonias ensayo
Las células en la fase de crecimiento logarítmico se digirieron en una suspensión de una sola célula con una solución de tripsina-EDTA (Gibco, EE.UU.) , y después se sembraron 2 ml de la suspensión celular en placas de 6 pocillos (Corning, EE.UU.) a una densidad de 200 células /ml. Después de la adhesión, las células se trataron con baicaleína (0,6,12, y 24μmol /L) durante 48 h y luego se cultivaron durante 15 días. A continuación, las células se fijaron con formalina al 10% y se tiñeron con violeta cristal al 0,1% (Sigma-Aldrich). Después del lavado, las placas se secaron al aire, y las imágenes digitales se tomaron de clones individuales teñidas observadas bajo un microscopio (Leica, Alemania). Los resultados representan la media de 3 experimentos independientes hecho durante varios días.
Análisis del ciclo celular
Las células fueron tratadas con baicaleína (0,30,60 y 120μmol /L) durante 48 h. A continuación, las células se recogieron y se fijaron con etanol frío al 70% y se almacenaron a -20 ° C. Después, las células se lavaron y se resuspendieron en PBS frío y se incubaron a 37 ° C durante 30 min con 10 mg /ml de ARNasa y 1 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich). análisis de contenido de ADN se realizó mediante citometría de flujo (BD, San Diego, EE.UU.). El porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo celular se determinó usando el software de adquisición de Cell Quest (BD Biosciences).
citometría de flujo análisis de apoptosis de las células
Se realizó el ensayo de yoduro de anexina V /propidio de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen, EE.UU.). Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning, USA) y se incubaron durante 48 h con baicaleína (0,30,60, y 120μmol /l). En breve, las células se recogieron y luego se lavaron con PBS frío, se centrifugaron, se resuspendieron en 100 ul de contener 2.5ul FITCconjugatedannexin-V tampón de unión y 1 ul 100 ug /ml PI y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se recogieron y analizaron mediante citometría de flujo (BD, San Diego, EE.UU.). Un total de al menos 10 000 eventos
Detección de la apoptosis morfológica con Hoechst 33342 tinción
Después del tratamiento con baicaleína (0 , 30,60, y 120μmol /L) durante 48 h, las células GBC-SD se lavaron con PBS y se fijaron con metanol: ácido acético (3: 1) durante 15 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron con PBS y se tiñeron con 5 mg /ml de Hoechst 33342 mancha durante 10 min. No se observaron cambios en los núcleos de las células después de la tinción con Hoechst 33342 usando un microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania).
La migración celular y la invasión
GBC-SD3 x 10
4 células y se colocaron SGC996 1 × 10
5 células en la membrana no revestida en la cámara superior (Corning, EE.UU.). Las células se sembraron en medio sin suero. Medio que contiene 10% de FBS se colocó en la cámara inferior para actuar como un quimioatrayente. Después de la adhesión, las células se trataron con varias concentraciones de baicaleína (0, 7,5, 15, 30, 60 mmol /L) en medio libre de suero. Las células se incubaron durante 24 horas; Las células que no invaden a través de los poros se retiraron usando un hisopo de algodón. Las células que migran a través de 8,0 micras de membranas de policarbonato a la superficie inferior se fijaron con 10% de metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Migración de células se cuantificaron contando las células teñidas con un microscopio (x 200) en cinco campos aleatorios para cada pocillo. Cada experimento se realizó por triplicado. ensayos de invasión se llevaron a cabo en una manera similar a los ensayos de migración, a excepción de que se recubrieron previamente con insertos de Matrigel (BD, EE.UU.).
In vitro se cultivaron de cicatrización de heridas ensayo
células GBC-SD en placas de 6 pocillos a una densidad de 1,5 × 10
5 /ml y se cultivaron hasta confluencia. Herida fue creado por raspado de las monocapas de células confluentes con una punta de pipeta. Las células se enjuagaron extensivamente con medio para eliminar los restos celulares antes del tratamiento con diferentes concentraciones (0, 7,5, 15, y 30μmol /L) de baicaleína en FBS condición privado. Las células se dejaron migrar durante 24 h y las imágenes de las células migraron fueron tomadas con el microscopio invertido (Leica, Alemania).
Transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)
Quantitative PCR se utilizó para cuantificar la expresión de mRNA en los grupos experimentales. Brevemente, las células se trataron con GBC baicaleína (15, 30, 60 y 120 mmol /L) durante 48 h. El ARN total fue aislado utilizando el RNA fácil kit (Invitrogen, EE.UU.). cDNA de la primera cadena se sintetizó a partir de ARN total de 500 ng utilizando un PrimeScript de la transcriptasa inversa (Takara, Japón). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en un volumen de reacción de 20 l incluyendo 2 cDNA l. El primer secuencias fueron los siguientes: MMP9 (forward-5'-TGT ACC ATG GCT GTT ACA CTC G-3 ', 5'-reverse-GGC AGG GAC AGT TGC TTC T-3'), la MMP-2 (forward-5'- AAC TAC GAT GAT GAC AAG CGC '; reverse-5'-GAC AGA CGG AAG TTC TTG GTG -3'), ZFX (forward-5'-GGA TGT GTG GGG TGG TAA TTT T '; reverse-5'-ACT GGT GTG TTT TTT CTT TGC G -3 '), y GAPDH (forward-5'-AAG TGG CTC TCA TCC TAT GACA-3', 5'-reverse-TCT TAC TCC TTG GAG GCC ATGT-3 '). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 30 segundos seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 34 seg. deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) se utilizó como un gen de referencia interna para normalizar la expresión de genes de apoptosis. Cuantificación relativa de los genes relacionados con la apoptosis se analizó mediante el método comparativa ciclo umbral (Ct). Para cada muestra, el valor Ct del gen de apoptosis se normalizó utilizando la fórmula: Ct = Ct (genes apoptóticos) - Ct (GAPDH). Para determinar los niveles relativos de expresión, se utilizó la siguiente fórmula: ΔΔCt = Ct (tratado) - Ct (control). Se utilizó el valor para trazar la expresión de genes de apoptosis mediante la fórmula 2-ΔΔCt.
análisis de transferencia de Western
Las células se trataron con varias concentraciones de baicaleína (0, 15, 30, 60 y 120 mmol /l) durante 48 h y después se lisaron en un tampón de muestra, seguido de la desnaturalización. La concentración de proteína total de los extractos celulares se determinó utilizando el sistema de ensayo de ácido bicinconínico (Beyotime, China) con BSA como estándar. Las cantidades iguales de proteínas (80 g por carril) de proteínas totales se separaron por SDS-PAGE (8%, 12% de geles) en condiciones reductoras. Las proteínas después se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada, y se incubaron withanti-caspasa-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-ciclina A, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti- MMP2, anti-MMP9, los anticuerpos anti-ZFX, respectivamente (1: 1000; Cell Signaling Technology) a 4 ° C durante la noche. Esto fue seguido por una incubación con anticuerpo de cabra anti-conejo /anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (1: 5000; Abcam). Una carga igual de cada carril se evaluó por inmunotransferencia las mismas membranas con anticuerpos beta-actina después de la separación de anticuerpos primarios anteriores. Se tomaron fotografías y se escanearon las densidades ópticas de las bandas y se cuantificaron con el Gel Doc 2000 (BioRad, EE.UU.).
in vivo de tumores de xenoinjertos estudio
Seis semanas de edad, macho atímicos desnudos ratones (con un peso corporal inicial de 20 a 22 g) se obtuvieron de Shanghai Laboratory SLAC Animal Co., Ltd. (Shanghai, china) y alojado en condiciones libres de patógenos con temperatura controlada (22 ° C), la humedad, y una 12 horas de luz /oscuridad ciclo. Alimentos y agua fueron dadas ad libitum durante todo el experimento. Se han usado SGC996 células de xenoinjertos de tumor y crecer en cultivo y luego se separan por tripsinización, se lavaron, y se resuspendieron en RPMI 1640 libre de suero. Cada uno de los ratones desnudos atímicos se inyecta por vía subcutánea de 1 x 10
6 de células volumen de 100 ul ina en el área del flanco derecho de iniciar el crecimiento del tumor. Después de SGC996 inoculación, los ratones fueron asignados aleatoriamente a dos grupos (5 ratones /grupo). Un grupo fue tratado con vehículo (10% de DMSO y 90% de glicol de propileno) por vía intraperitoneal, y el otro grupo received0.4mg /ratón por vía intraperitoneal para baicaleína 9 veces. En el día 21, los animales fueron sacrificados y se extrajo el tejido tumoral y se pesaron.
El análisis estadístico
Todos los valores se expresan como la media ± desviación estándar y se analizaron por el Estudiante de
t-test
usando el programa SPSS versión 13.0. Un
p-valor
de menos de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Efecto de baicaleína sobre la viabilidad y la apoptosis de las células de carcinoma de vesícula biliar in vitro e in vivo
los efectos de baicaleína sobre el crecimiento de GBC-SD humana y SGC996, dos líneas celulares más utilizadas de cáncer de vesícula biliar,
in vitro
fueron probados. Como se muestra en la Fig. 2 (A), después del tratamiento durante 24, 48, y 72 h, baicaleína indujo una dosis y una disminución dependiente del tiempo en la viabilidad tanto de la GBC-SD y SGC996 células, tal como se analizó mediante el ensayo de MTT. Como se muestra en la Fig. 2 (B) & amp; (C), la capacidad de GBC-SD y SGC996 células para formar colonias en la presencia de baicaleína se detectó con el ensayo de formación de colonias de placa plana. El recuento de colonias indicó que baicaleína había inducido una disminución dependiente de la dosis en la capacidad de formación de colonias. Los resultados apoyan el hecho de que baicaleína puede ejercer una influencia significativa sobre la proliferación de células SGC996 GBC-SD y. Para confirmar aún más el efecto de baicaleína
in vivo
, hemos probado la tumorigenicidad de células de carcinoma de vesícula biliar usando ratones desnudos estudio de xenoinjerto de tumor. Como se muestra en la Fig. 2 (D), el tamaño del tumor en el grupo de tratamiento baicaleína era más pequeña que la del grupo control.
(A) GBC-SD y SGC996 células se trataron con concentraciones variables de baicaleína, y la proliferación de las células eran determinó por el ensayo MTT en los días 1, 2 y 3. Cada valor representa la media ± SD (n = 3). (B y C) baicaleína suprime la formación de colonias de GBC-SD y SGC996 células. Las células se trataron con baicaleína (6, 12, y 24 mmol /L) y se les permitió formar colonias en medio fresco durante 14 días. La influencia de las colonias (media ± SD, n = 3) en la formación de colonias se muestran. xenoinjertos de tumores tratados con baicaleína (D) eran mucho más pequeños que los tumores de control. (E) El peso de los tumores reveló que el crecimiento del tumor de xenoinjerto en ratones desnudos fue significativamente más lenta en los tumores desnudos baicaleína tratados que los tumores de control. Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0.001.
Para evaluar si baicaleína afecta a la progresión del ciclo celular, citometría de flujo El análisis se llevó a cabo. Los resultados mostraron una disminución significativa en el número de células en la fase G0 /G1 proliferativa y un aumento significativo en el número de células en la fase S, después de 48 h de tratamiento con baicaleína (Fig. 3 (A)). Ciclina A, A /S proteína de promoción de la transición G1, se aumentó de forma dependiente de la dosis por baicaleína tratamiento. Puede ser la razón de la detención de la fase S inducida por baicaleína. CyclinB1 y cyclinD1 que representan S /G2 y el proceso de transición M /G1 respectivamente, fueron dependiente de la dosis disminuyeron baicaleína tratamiento (Fig. 3 (B) y S5 Fig.). Estos resultados indican que las detenciones baicaleína el ciclo celular en la fase S.
Las células (A) se trataron con 30, 60, o 120 mmol /L baicaleína durante 48 h y el contenido de ADN se analizó por citometría de flujo. El porcentaje de células en el G1, /se muestra S, y G2 M fases del ciclo celular. Estos resultados fueron de 1 experimento representativo de 3 ensayos independientes. (B) La expresión de la ciclina B y ciclina D en las células GBC-SD y ciclina A y ciclina D en SGC996 células se cambiaron significativamente después del tratamiento con baicaleína en comparación con el control. Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0.001.
A fin de confirmar estos resultados, se evaluaron los efectos de baicaleína sobre la apoptosis en GBC-SD y SGC996 células mediante el uso de anexina V-FITC y yoduro de propidio tinción. Según la evaluación por citometría de flujo y se muestra en la Fig. 4 (B), un aumento dependiente de la dosis marcada tanto en las etapas tempranas y tardías de la apoptosis era evidente en GBC-SD y SGC996 células después de baicaleína tratamiento en comparación con las células de control.
(A) cambios morfológicos apoptóticos tales morfología como anormal nuclear, la reducción del número de células con la formación de cuerpos apoptóticos, y la contracción celular, inducida por la baicaleína (30,60 y /L 120 mmol) de tratamiento durante 48 h, se observaron por Hoechst 33342 tinción en líneas celulares SGC996 GBC-SD y . (B) Las células se incubaron con baicaleína (30,60 y 120 mmol /L) durante 48 h, seguido por tinción con anexina-V /PI. apoptosis celular se estimó por la citometría de flujo. (C) La baicaleína induce la activación de las proteínas relacionadas con la apoptosis en las células GBC-SD y SGC996. Después del tratamiento con baicaleína (0, 15, 30, 60, y 120μmol /L) durante 48 h, se prepararon lisados celulares y análisis de transferencia Western se realizó contra Bcl-2, Bax, pro-caspasa-3, P53 y PARP. ß-actina se utilizó como control de carga. Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0.001.
cambios morfológicos en las células apoptóticas fueron revelados por la tinción de Hoechst 33342, como se muestra en la Fig. 4 (A). En el no tratado GBC-SD y SGC996 células, los núcleos se tiñeron azul homogénea débil, mientras que en el grupo tratado con baicaleína, condensación de la cromatina y fragmentación nuclear brillante se observaron.
Efecto de la baicaleína de los factores relacionados con la apoptosis
Para identificar qué proteínas están principalmente involucrados en el proceso de apoptosis inducida por baicaleína, se analizaron una serie de factores relacionados con la apoptosis por Western blot. Como se ilustra en la Fig. 4 (C), pro-caspasa-3 y P53 se redujeron regulado por baicaleína tratamiento. PARP escindida se incrementó significativamente. el nivel de proteína de Bax fue hasta reguladas, mientras que el nivel de la proteína Bcl-2 se redujo significativamente.
Efecto de baicaleína en la metástasis de las células de carcinoma de vesícula biliar
Dado que la migración de células de carcinoma de la vesícula biliar y la invasión están asociados con la metástasis, hemos utilizado varios ensayos celulares para evaluar los efectos de la baicaleína sobre el potencial metastásico de células de carcinoma de vesícula biliar. Para examinar el efecto de baicaleína en la movilidad de las células cancerosas, se realizó un ensayo de migración de células usando GBC-SD y SGC996. Como se muestra en la Fig. 5 (A), la migración celular se inhibió por baicaleína tratamiento. Además se realizó un ensayo de curación de la herida para confirmar aún más el efecto de la inhibición de la baicaleína sobre la migración celular. Como se muestra en la Fig. 5 (C), baicaleína visible inhibió la migración de las células GBC-SD de una manera dependiente de la dosis. Para explorar más a fondo si la actividad invasiva se vio afectada en respuesta a baicaleína, se analizó la actividad invasiva utilizando una membrana recubierta matrigel. Los resultados mostraron que baicaleína dramáticamente redujo el número de células invadidas y esta inhibición se produjeron de una manera dependiente de la concentración (Fig. 5 (B)). Además, las capacidades de proliferación y metástasis se potenciaron aún más en las células tratadas tanto con siRNA contra ZFX y baicaleína (S4 Fig.).
Las células se trataron con 7,5, 15, 30 y 60μmol /L baicaleína de 12 h antes a la migración (a) o ensayo de invasión (B). (C) las monocapas celulares fueron heridos por el rascado con una punta de pipeta de 200 l. El área de ocupación en monocapa de células GBC-SD tratados con baicaleína era dependiente de la dosis se redujo 24 h después de cero. Baicaleína afecta a la expresión de metalopeptidasas matriz (MMPs). (D) La expresión de mRNA de MMP-2 y MMP-9 fue detectado por qPCR después tratado con baicaleína durante 48 h. (E) La expresión de la proteína de MMP-2 y MMP-9 se detectó mediante transferencia Western después de tratado con baicaleína durante 48 h. Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0.001.
Las MMP son conocidos por ser crucial para degradar componentes de la matriz extracelular y para la promoción de la invasión celular tumoral
in vitro
y
in vivo
. Después del tratamiento con diferentes concentraciones de baicaleína durante 48 h en GBC-SD y SGC996 células, cuantitativa en tiempo real PCR y análisis de transferencia Western mostraron que la expresión de ARNm y proteína de MMP-9 y MMP-2 significativamente disminuyó en comparación con el grupo control en una forma dependiente de la dosis (figura 5 (D & amp;. e)).
baicaleína las reguladas X-cromosómicas proteína con dedos de zinc (ZFX) y la expresión de mRNA en GBC-SD y SGC996 células
Nuestro estudio anterior encontró que el knock-down de ZFX podría inhibir la proliferación de células GBC-SD y la migración. Así que nos gustaría conocer si el efecto de baicaleína en células de carcinoma de vesícula biliar está conectado a la expresión ZFX. Western blot y análisis de PCR cuantitativa en tiempo real reveló que la expresión de la proteína y ARNm de ZFX era dependiente de la dosis (Fig 6 (A & amp;. B)) se redujeron en baicaleína tratamiento en GBC-SD y SGC996 células y la translocación de ZFX en núcleos fue suprimida por baicaleína tratamiento (S2 Fig.). El efecto sobre la expresión de baicaleína ZFX era específica debido a que el nivel de expresión de NF-kB y STAT3 no fueron afectados por esta molécula (S1 Fig.)
.
(A y B) la expresión ZFX en GBC-SD y SGC996 células inducidas por baicaleína. Las células se trataron con 0, 15, 30, 60 y 120 mmol /L baicaleína durante 48 h, a continuación, el nivel de expresión de proteína y ARNm de ZFX se determinó mediante Western blot (A) y qPCR (B). Las células (C y D) se transfectaron con ZFX-GFP plásmido y el plásmido GFP, respectivamente. 72 horas después de la transfección, las células se trataron con 0, 7,5, 15, 30 y 60 mmol /L baicaleína durante 72 h. ZFX-GFP bloqueado de manera significativa la inhibición de la proliferación de las células GBC-SD por baicaleína usando el ensayo de MTT (C). ZFX-GFP significativamente bloqueado la inducción de la apoptosis de las células GBC-SD por baicaleína estimado por la citometría de flujo (D). (E y F) 72 horas después de la transfección, las células se trataron con 60 mmol /L baicaleína durante 24 h. ZFX-GFP bloqueó significativamente la lucha contra la migración y la invasión efecto de las células GBC-SD por baicaleína. La migración celular se estimó por el ensayo de curación de la herida (E) y la invasión de células se estimó mediante el ensayo transwell (F). (G) ZFX-GFP impidió la expresión de PARP, la inhibición de MMP2, MMP9 y hasta regulado la relación de Bcl2 /Bax en respuesta a baicaleína. 72 horas después de la transfección, las células se trataron con 60 mmol /L baicaleína para los niveles de proteína 48h.The de PARP, MMP-2, MMP-9, Bcl2, Bax y ZFX se determinaron por Western blot. Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0.001.
La sobreexpresión de ZFX alivia el efecto de viabilidad, apoptosis y metástasis de las células en baicaleína GBC-SD
Además, la sobreexpresión de ZFX (S3 Fig.) Dio como resultado el bloqueo parcial de baicaleína inducida por la proliferación y la apoptosis en las células GBC-SD (Fig 6 (C) & amp;. (D)). En consecuencia, la inhibición de la migración (Fig. 6E) y la invasión (Fig. 6F) capacidades de células por baicaleína fueron notablemente invierten por la sobreexpresión de ZFX. Por otra parte, la sobreexpresión de ZFX inhibió en gran medida la activación inducida baicaleína de PARP y el aumento de la proporción de Bcl2 /Bax. Además, la sobreexpresión de ZFX también dio como resultado en el bloqueo de la inhibición inducida baicaleína de MMP-2 y MMP-9 (Fig. 6 (G)). Por lo tanto, los datos sugieren que la proteína ZFX podría participar en la apoptosis celular inducida por baicaleína y anti-metástasis en células de carcinoma de vesícula biliar.
Discusión
Nuestro estudio proporciona nueva información sobre baicaleína utilizado en el terapia contra el cáncer. El efecto anti-cáncer de baicaleína se ha confirmado en muchos otros tipos de cáncer, pero el anti-proliferación y el efecto metastásico y el mecanismo relacionado (s) en las células GBC no está claro. Aquí, hemos demostrado los mecanismos bioquímicos y moleculares de la apoptosis y la inducción anti-metastásico por baicaleína.
En primer lugar, encontramos que baicaleína puede desempeñar un papel importante en la proliferación celular GBC, ciclo celular y la apoptosis
In Opiniones y vitro
in vivo
. El tratamiento con baicaleína dio como resultado una marcada disminución en la viabilidad de células GBC-SD y SGC996 cultivadas y en el número de colonias que se formaron estas células. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para evaluar el papel potencial de baicaleína en
in vivo
modelo animal de xenoinjerto. se observó una reducción significativa de la masa tumoral después de un tratamiento de 3 semanas. El
in vivo
efecto de baicaleína sobre los tumores GBC apoyan firmemente baicaleína como un nuevo fármaco potencial para el tratamiento anti-GBC.
El efecto de baicaleína en la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis en GBC también se evaluó células. Se cree que los efectos anti-tumorales de baicaleína para ser utilizado por influir en detención en el ciclo celular o mediante la interacción con proteínas relacionadas con el ciclo de las células [31]. En nuestro estudio, baicaleína también induce la detención del ciclo celular en fase S y la inhibición de la ciclina B1, ciclina D1, promoción de la ciclina A en GBC-SD y SGC996 células. Dado que la apoptosis es considerado como un mecanismo importante en la inhibición del cáncer, se realizó un ensayo de tinción Hoechst33342, anexina V /ensayo de PI, y la detección de la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis de explorar aún más el mecanismo de la apoptosis inducida por baicaleína. Baicaleína induce notablemente la apoptosis de ambos GBC-SD y SGC996 células, como se ha demostrado por los cambios en la morfología nuclear, un aumento en el porcentaje de células V-tinción de anexina, que fue confirmada por una mayor expresión de la escisión de pro-caspasa-3, la escisión de PARP, Bax y reducción de la expresión de Bcl-2 y P53. Muchos de estos genes están relacionados con la vía apoptótica mitocondrial. La escisión del pro-caspasa-3, la escisión de PARP y, finalmente, la degradación del ADN. proteínas Bax y Bcl-2, que regulan el cambio esencial en la permeabilidad de la membrana mitocondrial de la apoptosis [32]. A partir de estos datos, se puede concluir que baicaleína inducida por apoptosis de las células GBC por activación de la vía mitocondrial intrínseca.
Además de la proliferación celular, la migración y la capacidad invasiva de las células también son dos de las características más importantes del comportamiento de células malignas. Para dilucidar el efecto de la baicaleína sobre la motilidad celular, la migración celular y la invasión se determinó por un ensayo de migración transwell cicatrización de heridas y de ensayo, respectivamente. A partir de estos datos, se encontró que baicaleína podrían suprimir la migración y la invasión capacidad de GBC-SD y SGC996 células. MMPs son una superfamilia muy regulado de endopeptidasas dependientes de zinc que están causalmente relacionada con el desarrollo y la progresión de los tumores [33].