Extracto
La diferenciación de las células madre del cáncer (CSC) en células cancerosas ocasiona un aumento de la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos. Aunque la inhibición de la diana de mamífero de la rapamicina (mTOR) conduce a la supervivencia CSC, el efecto de aminoácidos de cadena ramificada (BCAA), un complejo mTOR 1 (mTORC1) activador sigue siendo desconocido. En este estudio, hemos examinado los efectos de aminoácidos de cadena ramificada en las células de carcinoma hepatocelular (HCC) que expresan un marcador CSC hepática, EpCAM. Se examinaron los efectos de BCAA y /o 5-fluorouracilo (FU) en la expresión de EpCAM y otros marcadores relacionados con el CSC, así como la proliferación celular en células de HCC y en un modelo de xenoinjerto de ratón. También hemos caracterizado relacionados con el CSC y relacionados con la señal mTOR-expresión de la molécula y la tumorigenicidad de células de HCC con desmontables de Rictor o Raptor, o sobreexpresión de rheb constitutivamente activa (caRheb). También se examinó la señal relacionada con la expresión de moléculas mTOR en células de HCC BCAA tratados.
in vitro
BCAA redujo la frecuencia de las células EpCAM positivos y sensibilidad al efecto antiproliferativo de 5-FU mejorado. Combinado 5-FU y BCAA proporciona mejor eficacia antitumoral de 5-FU solo en el modelo de xenoinjerto. La estimulación con altas dosis de BCAA activa mTORC1. desmontables experimentos de sobreexpresión y revelaron que la inhibición de mTOR complejo 2 (mTORC2) o la activación de mTORC1 condujeron a una disminución de la expresión de EpCAM y poco o nada de la tumorigenicidad. BCAA puede mejorar la sensibilidad a la quimioterapia mediante la reducción de la población de cscs a través de la vía mTOR. Este resultado sugiere la utilidad de BCAA en la terapia de cáncer de hígado.
Visto: Nishitani S, M Horie, Ishizaki S, Yano H (2013) aminoácidos de cadena ramificada Suprime ácido cáncer hepatocelular células madre a través de la activación de los mamíferos objetivo de rapamicina. PLoS ONE 8 (11): e82346. doi: 10.1371 /journal.pone.0082346
Editor: Diego Calvisi, Institut für Patología, Greifswald, Alemania, Alemania |
Recibido: 28 Julio, 2013; Aceptado: 31 Octubre 2013; Publicado: 27 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Nishitani et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe.
Conflicto de intereses: Esta investigación pertenece a Ajinomoto Pharmaceutical Company. Los autores declaran que han solicitado una patente relacionada con aminoácidos de cadena ramificada utilizada en este estudio (nombre de la patente: Agente para potenciar la actividad antitumoral del fármaco quimioterapéutico, la solicitud de patente nº WO2012 /111790). SN, MH y SI son empleados por Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd Este estudio se llevó a cabo en modelos animales y no tiene implicaciones directas en sujetos humanos. Sin embargo, el trabajo de este estudio será traducido a sujetos humanos en estudios futuros y por lo tanto esta publicación puede añadir un poco de beneficio para Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd No hay más patentes, productos en desarrollo para declarar. Relación de mezcla de BCAA utilizado en este estudio es la misma que una relación de composición de los gránulos de BCAA que se venden por Ajinomoto Pharmaceuticals Co. Ltd. en Japón con el nombre de LIVACT ® gránulos. Sin embargo, la compañía no extrae un beneficio comercial directo de este estudio, ya que no se lleva a cabo en sujetos humanos. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El término "cáncer de células madre" (CSC) se refiere a una célula de cáncer con la características de una célula madre. Las células madre tienen el potencial de auto-renovación y se diferencian en otros tipos de células, y por lo tanto puede restaurar células que experimentan apoptosis. La hipótesis es que los carcinomas de desarrollo de las células madre se someten a un proceso de división asimétrica. Los CCC fueron inicialmente identificados en la leucemia mieloide aguda [1] y, posteriormente, se han descubierto en otros tipos de cáncer. Un desafío surgió cuando se pensaba que las CSC eran resistentes a la terapia. Muchos agentes quimioterapéuticos se dirigen a las células en proliferación activas y pueden no ser eficaces contra las células sometidas a la proliferación limitada. Sobrevivir a las células cancerosas se determinaron a ser un factor de recrudescencia o metástasis a otros tejidos [2,3]. Los estudios han encontrado muchos marcadores CSC en varios tipos de cáncer. En el carcinoma hepatocelular (HCC), CD133 y EpCAM se han identificado como marcadores CSC [4]. Además, células madre cancerosas expresan transportadores ABC cuando se expone activamente a los agentes quimioterapéuticos, lo que contribuye a la resistencia terapéutica [5]. Un estudio de combinación evaluación de estas células madre cancerosas resistentes al tratamiento encontró que las células cancerosas existentes podrían tener sus raíces completamente fuera [6]
Se han sugerido dos enfoques para la terapia del cáncer:. Despierta la terapia y la terapia del sueño. Despertar terapia mejora la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos mediante la inducción de la diferenciación de células madre cancerosas a las células cancerosas. Oncostatina M, una citocina de IL-6 de la familia, es un inductor conocido de la diferenciación. La combinación de esta citoquina con un agente quimioterapéutico mejoró la eficacia antitumoral en un modelo de xenoinjerto de HCC [7]. Sin embargo, la oncostatina M no ha sido clínicamente probado. La terapia del sueño según los informes, mantiene baja la proliferación de las células madre cancerosas, pero la fisiopatología de este fenómeno no está clara. Los estudios se han centrado principalmente en las células hematopoyéticas con mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) señales asociadas con la diferenciación [8,9]. Es bien conocido que los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA), especialmente la leucina, activan mTORC1 [10,11]. BCAA son necesarios para el metabolismo de amonio en los músculos cuando el hígado no es capaz de realizar esta función. Informes recientes han demostrado que los BCAA activa la síntesis de albúmina en hepatocitos primarios de rata [12] y el hígado de ratas con cirrosis [13] a través de la señalización de mTOR, regulador central de la síntesis de proteínas, mediante la detección de las condiciones nutricionales [14]. En Japón, la suplementación farmacológica con gránulos de BCAA se utiliza para tratar la hipoalbuminemia en pacientes con cirrosis descompensada hepática (CH) [15]. gránulos de BCAA, prescrito tres veces al día después de las comidas para proporcionar una dosis diaria total de 12 g de aminoácidos de cadena ramificada, tienen una proporción de 2: 1,2 en peso de leucina a isoleucina a valina: 1. BCAA suprime la aparición de HCC en modelos animales [16,17] y los pacientes de LC [18]. Nos hemos centrado en inducir la diferenciación de CSC, en particular el aumento de la sensibilidad a la quimioterapia. CSC diferenciación se evaluó mediante la activación de mTORC1 con aminoácidos de cadena ramificada, y se estudió el efecto antitumoral de la combinación de BCAA y el agente quimioterapéutico
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados serán de gran valor para la comprensión de la eficacia clínica de la terapia de carcinoma de hígado en pacientes con LC.
Materiales y Métodos
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes.
Cultivo de células y reactivos
Dos líneas celulares de HCC, HAK1-B [19] y Huh7, se mantuvieron en RPMI1640 (Nacalai Tesque, Japón) y DMEM (Nacalai Tesque, Japón), respectivamente, o medio LC, que es un medio con baja relación Fischer (relación de la concentración de aminoácidos de cadena ramificada sobre la concentración de ácido aromático) [20] que contiene 1% de penicilina /estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS). Los reactivos utilizados incluyen anti-EpCAM FITC anticuerpo conjugado (Abcam, EE.UU.), Hoechst 33342 solución (DOJINDO, Tokio, Japón) para el recuento por el sistema de escaneo matriz (tecnología Thermo Fischer, EE.UU.) tinción nuclear y el número de células; 5-fluorouracilo (5-FU) se obtuvo de Kyowa Kirin, Japón.
Construcción de plásmidos de Rheb constitutiva forma activa
plásmido Bandera-caRheb fue proporcionada por el Dr. Tomohiko Maehama (El Metropolitano de Tokio Instituto de Ciencias Médicas, Tokio, Japón).
plásmidos shRNA
Pequeño horquilla RNA (shRNA) plásmidos se obtuvieron de la terapéutica Igene (USA).
El sistema de lipofectamina shRNA fue diseñado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias diana de shRNA fueron los siguientes: sh-Raptor: 5'-GCGGAAAGGATTATGGGT-3 '; SH-Rictor: 5'-GTAGAAAGTTCAACGAGCT-3 '; y U6RepT7STOP (control vector sh-RNA): 5'-CACCTTTTTTTAAAAAAATCCT-3 '
reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (Q-PCR)
Q-PCR se utilizó para detectar mRNA. niveles de CYP3A4, Bmi1, EpCAM, FOXO3a, Raptor, y Rictor. Un total de 1 × 10
5 células HAK-1B se sembraron en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS durante 24 h antes de los experimentos. Se añadió BCAA (4 mM) al medio y se mantuvo durante 72 h. El ARN se aisló usando el reactivo de aislamiento TriPure (Roche Applied Science) y el ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando los ADNc de alta capacidad de revertir kit de transcripción (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) se realizó usando el Sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems) y la potencia SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) que contiene cebadores específicos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada muestra se normalizó a la expresión de GAPDH
Las secuencias de cebadores para la PCR fueron las siguientes: CYP3A4:. Adelante 5'-TTGGAAGTGGACCCAGAAAC-3 ', 5'-revertir CTGGTGTTCTCAGGCACAGA-3'; Bmi1: adelante 5'-CCAGGGCTTTCAAAAATGA-3 ', 5'-revertir GCATCACAGTCATTGCTGCT-3'; EpCAM: adelante 5'-GCTGGTGTGTGAACACTGCT-3 ', 5'-reverse ACGCGTTGTGATCTCCTTCT-3';
FOXO3a: adelante 5'-TGCTGTATGCAAGAACTTTCCAGTAGCAG-3 ', 5'-reversa ACTCTAGCCCCCATGCTACTAGTG-3'; Raptor: delantero
5'-CCCTGCTACTCGCTTT-3 ', 5'-revertir GTGAGGTGTTTCCCCT-3';
Rictor: adelante 5'-GGAAGCCTGTTGATGG-3 ', 5'-reverse-3 GGCAGCCTGTTTTATG '
recuento celular y EpCAM-positivas de detección de células de ensayo
las células se cultivaron en presencia o ausencia de BCAA durante 72 h, luego se fija con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con Hoechst 33342 (10 mg /ml, Dojindo, Tokio, Japón) durante 1 min. Los recuentos de células se realizaron utilizando el protocolo de activación diana y un sistema de matriz de exploración. células EpCAM positivas se detectaron por tinción de las células fijadas con anticuerpo FITC EpCAM conjugado durante 1 h, y el número de células EpCAM positivas por 5000 células fueron detectados por el sistema de exploración
ensayo de apoptosis
las células se cultivaron con 5-FU (0, 1, 2 mg /ml) en presencia o ausencia de BCAA 2 mM durante 72 h en placas de 96 pocillos (BD Biosciences). Anexina la unión a las membranas celulares V se visualizó con un kit de detección de Anexina V-FITC (TAKARA BIO INC, Tokio, Japón) y solución de Hoechst 33342 por escaneo de matriz.
Western blotting
Un total de 1 × 10
5 Huh7 células fueron sembradas en medio DMEM 24 h antes de estudiar experimentos. El medio se intercambió con medio de LC durante 3 días o medio DMEM con diversos tratamientos: caída durante 5 días, la sobreexpresión de 1 día, y el tratamiento BCAA por 30 min o 3 días. Western Blot se realizó de la manera habitual. Las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron en tampón RIPA que contiene proteasa completa y cóctel inhibidor de fosfatasa (Roche Applied Science, Indianapolis, INC). Las membranas fueron bloqueadas en el bloqueo de One-P (Nacalai Tesque, Japón). Los anticuerpos incluyen de conejo anti-Rictor (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), de conejo anti-raptor (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), de conejo anti-p-70S6 quinasa, anti-Total-p-70S6 quinasa, de conejo anti-p -4EBP1 (T37 /46), de conejo anti-p-Akt (T308 o S473), de conejo anti-p-GSK3 (S9), de conejo anti-β-catenina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), y anti-ratón a-tubulina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Densitometría se llevó a cabo directamente sobre la membrana sometida a transferencia utilizando un sistema de cámara de dispositivo de carga acoplada (LAS-4000 Mini, Fujifilm, Tokyo, Japón).
desmontables experimentos
Huh-7 células fueron transfectadas con el control negativo (CN) u objetivo (mTORC1 o mTOR2 proteína reguladora asociada de Raptor y Rictor) ARN pequeña horquilla (shRNA) utilizando Lipofectamine ™ LTX Reactivo (Invitrogen Technology, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron transfectantes estables, como se describe anteriormente [21], para la resistencia a la puromicina durante 2 días y posteriormente se cultivaron en DMEM que contenía 10% de FBS durante 2 días. Q-PCR y Western Blot confirmó la eficacia de abatimiento.
Los estudios en animales
Animales.
El siguiente protocolo experimental fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de Ajinomoto Co., Inc. hembra Balb /c ratones desnudos o ratones NOD /SCID a la edad de 6 semanas se obtuvieron de Charles River Japón (Yokohama, Japón). Ellos se mantuvieron en jaulas individuales en una habitación limpia, con aire acondicionado (24 ± 1 ° C) con un 12 h-h ciclo de luz-oscuridad de 12 (luces desde 0700 a la 1900). Los animales fueron alimentados con una dieta de polvo estéril de valores (CRF-1, levadura Oriental, Tokyo, Japón).
Quimioterapia.
Se suspendieron un millón de células HAK-1B en 100 l de RPMI 1640 con se realizó FBS, y una inyección subcutánea. La incidencia y el tamaño de los tumores subcutáneos se registraron cuando el volumen promedio había alcanzado los 100 mm
3 como se describió anteriormente [7]. inyecciones tumorales de 50 l de 10% de DMSO /PBS (control), o 5-FU (250 mg /tumor) se les dio dos veces por semana y 3% fue proporcionada BCAA suplementada o 3% de caseína suplementada al día durante 2 semanas a partir de 7 días después de la inyección de células tumorales. Los volúmenes tumorales fueron evaluados utilizando mediciones de la pinza y se calcula con la fórmula V = 1/2 x
a
2 ×
b
donde
a
es el eje corto y
b
es el eje mayor del tumor. En los 14
º día, todos los ratones fueron sacrificados bajo anestesia, se pesaron los tumores aislados, sus volúmenes calculados, y el tejido se analizaron para la expresión de ARNm.
tumorigénesis.
Un millón de células Huh7 transfectadas con partículas que contienen lipofectal NC, Raptor, o Rictor shRNA, cDNA plásmido control (pcDNA), o plásmido Flag caRheb se cosecharon y se inyectaron por vía subcutánea en ratones NOD /SCID (n = 5 en cada grupo). Los volúmenes tumorales se evaluaron como antes. Los ratones que llevan el NC, desmontables (KD), o más de la expresión de xenoinjertos se sacrificaron después de 4 semanas.
Métodos estadísticos.
Los resultados se expresaron como media ± SE. La significación se determinó en la versión 7.7.1 Exsus (CAC Corporation, Tokio, Japón) mediante la realización de la prueba de Dunnett, la prueba de Tukey de Student y
t-test
, y se consideraron diferencias significativas en los valores de P & lt; 0.05
Resultados
El efecto de los aminoácidos de cadena ramificada en EpCAM-positividad en las células HAK-1B
HAK-1B células fueron aproximadamente 10% EpCAM-positivas (Figura S1).; este disminuyó significativamente de una manera dependiente de la dosis en presencia de BCAA 1-4 mM (Figura 1A). BCAA 4 mM dio lugar a un aumento en la expresión CYP3A4 mRNA, un marcador diferenciado, y por el contrario 1-4mm BCAA tendió a disminuir en la expresión de mRNA Bmi1, un marcador no diferenciado (Figura 1B). Estos resultados sugieren BCAA reducida EpCAM-positividad a través de la diferenciación. Por lo tanto, se evaluó la sensibilidad quimioterapéutica de HAK-1B que contiene células EpCAM positivo. expresión V Anexina, que se utilizó para detectar el evento apoptosis primaria, aumentó con el aumento de dosis de 5-FU; este aumento fue mayor en las células tratadas con la combinación de BCAA y 5-FU (Figura 1C). Además, la proliferación HAK-1B estaba más fuertemente inhibida por una combinación de BCAA y 5-FU que por 5-FU solo (Figura 1D).
prueba de Dunnett, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01 n = 6, media ± SE.
El porcentaje de células anexina V-positivos (C) y el número de células viables relativa (D) por la matriz de escanear en las células HAK-1B cultivadas en RPMI 1640 que contiene 10% de SFB con o sin BCAA 2 mM en presencia (1 o 2 mg /ml) o ausencia de 5-FU durante 72 h utilizando el protocolo de activación objetivo de exploración de matriz. Estudiante
t-test
, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, n = 7, media ± SE.
Los mismos resultados se obtuvieron con células Huh7 y se muestran en la Figura S2 AB.
quimioterapéutico sensibilidad
in vivo
Para probar la hipótesis de que la positividad EpCAM aumenta la sensibilidad a la quimioterapia en presencia de aminoácidos de cadena ramificada, hemos utilizado combinado BCAA y el tratamiento con 5-FU en un modelo de ratón BALB /c desnudos trasplantados con subcutánea HAK-1B. eficacia
antitumoral fue significativa con 5-FU solo, y un efecto antitumoral aún más fuerte se consiguió con la combinación de BCAA y tratamiento con 5-FU. Sin embargo, el efecto antitumoral de BCAA por sí solo no fue notable (Figura 2A, B, Figura S3). expresión de ARNm de EpCAM fue significativamente menor en tumores de ratón BCAA tratados (Figura 2C). FOXO mRNA (Figura 2D), informado de que se expresa en células madre cancerosas [22], se redujo significativamente en una manera similar.
La expresión relativa de ARNm de diversas moléculas de cada tumor se asoció con propiedades CSC (C, D). Control: inyección de DMSO /solución salina /tumor 10% + 3% de caseína que contiene la dieta, el 5-FU: 250 g /tumor inyección + 3% de caseína que contiene la dieta, la dieta BCAA: 10% de inyección de DMSO /solución salina /tumor + 3% BCAA contiene, 5-FU + BCAA dieta: 250 g /inyección del tumor + 3% BCAA contiene la dieta durante 14 días. la prueba de Tukey: * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 frente a control, #p & lt; 0.05 vs. 5-FU, $$ p & lt; 0,01 frente BCAA, n = 6, media ± SE.
Mecanismo de BCAA efectos sobre las células Huh7 EpCAM positivos
Teniendo en cuenta la eficacia de transfección experimental de células Huh7, que los usaban para evaluar el mecanismo de BCAA, suponiendo que 40% de Huh7 fueron EpCAM-positivas como [7] se informó anteriormente. Como en HAK-1B, las células EpCAM-positivas en Huh7 se redujeron significativamente por BCAA; Además, mTORC1 se activó tras el tratamiento BCAA e inhibida por la rapamicina (Figura 3A, la Figura S4A). La disminución de las células EpCAM positivos debido a BCAA fue completamente abrogada por el pretratamiento con rapamicina, un inhibidor de mTORC1 (Figura 3A, la Figura S4A). Además, medio LC, un medio de baja relación de Fischer, inhibió la actividad de mTORC1 y el aumento de la tasa de células madre cancerosas (Figura 3B). mTORC1 activación fue suprimida por medio de LC (Figura 3B, Figura S4B).
El cambio en la tasa de células EpCAM positivo en 5000 células con sobreexpresión de caRheb o control plásmido de ADNc (ADN pc) en medio de control (DMEM que contiene 10% de FBS) con y sin estimulación BCAA 4 mM durante 24 h en Huh7 (C).
la detección de la fosforilación de la quinasa p70S6, un miembro de la señalización de mTOR aguas abajo, en presencia de DMEM, tratamiento BCAA, el pretratamiento con rapamicina y el tratamiento BCAA, o la estimulación LC durante 72 h en Huh7 ( A, B).
prueba de Tukey ** p & lt; 0,01 frente a control, $$$ p & lt; 0,001 frente a BCAA, n = 8, media ± SE (A)
t de Student * p & lt.; 0,05, **** p & lt; 0,0001, n = 8, media ± SE (B, C).
Por último, las células EpCAM positivos se redujeron significativamente por la activación mTORC1 a través de la sobreexpresión de caRheb, un factor de activación de mTORC1 sin estimulación BCAA ( Figura 3C). Por lo tanto, el efecto de BCAA en células EpCAM positiva dependía de la activación mTORC1.
La asociación entre la señal mTOR y EpCAM-positividad
Las señales mTOR incluyen dos subtipos: mTORC1 y mTORC2 [23]. En particular, mTORC1 tiene Raptor, una proteína reguladora del complejo mTORC1, y es estimulada por aminoácidos de cadena ramificada, especialmente la leucina. Por el contrario, mTORC2 tiene Rictor, una proteína reguladora de complejo mTORC2, que señala Akt aguas abajo.
La rapamicina inhibe mTORC1 y mTORC2, dependiendo de la duración de la estimulación [24,25]. Por lo tanto, se pueden determinar los efectos de la inhibición mTORC1 solo o inhibición dual de mTORC1 /2 en las células EpCAM positivo por el pretratamiento con rapamicina para 1 h o 24 h, respectivamente. Encontramos que las células EpCAM positivas aumentaron significativamente con la inhibición de mTORC1. En contraste, las células EpCAM positivas disminuyeron con la inhibición dual de mTORC1 /2, especialmente la inhibición mTORC2, por el pretratamiento durante 72 h (Figura 4A).
prueba de Dunnett, * p & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001 frente al control, n = 6, media ± SE
Las expresiones relativas de EpCAM, c-myc, y el ARNm FOXO3a sobre Raptor y desmontables Rictor (BD)
prueba de Dunnett, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 frente al control n = 8, media ± SE.
Estos hallazgos sugieren la presencia o ausencia de células EpCAM positivos depende de mTORC1 o mTORC2, respectivamente. A continuación, examinó la expresión de EpCAM mRNA en presencia de mTORC1 o mTORC2 pérdida de la función por desmontables de Raptor o Rictor, respectivamente. La pérdida de función causada mTORC1 expresión de ARNm de EpCAM para aumentar de manera similar a la inhibición mTORC1 por el pretratamiento con rapamicina para 1 h. Sin embargo, la pérdida de función causada mTORC2 expresión de ARNm de EpCAM a disminuir de manera significativa. Además, c-myc y la expresión mRNA FOXO3a reaccionaron de manera similar a la expresión EpCAM mRNA (Figura 4B-D).
Rictor, Raptor, y β-catenina también se asociaron con señales Wnt /β-catenina (Figura 5A) y mTOR. Cuando mTORC1 fue inhibida por la caída Raptor, la fosforilación de la quinasa p70S6, la señal aguas abajo de mTORC1, disminuido, y la fosforilación de Akt (Ser473) aumentó. Esto sugiere que la inhibición de la fosforilación mTORC2 por P70S6kinase sido abrogada por la caída Raptor. En contraste, cuando mTORC2 fue inhibida por Rictor caída, la fosforilación de la quinasa p70S6 aumentó, y la fosforilación de Akt disminuye.
Rictor o Raptor Desmontables comparación con el control negativo (NC), caRheb comparación con el control de ADNc de plásmido (ADN pc), el tratamiento BCAA en comparación con DMEM (FBS 10%) solamente (Ctrl) (A). La relación de tumor promedio volúmenes y la tumorigénesis en el 4
ª semana en un modelo de xenoinjerto con células trasplantadas con control negativo, desmontables de Raptor, Rictor durante 5 días, o sobreexpresión de ADN plásmido de control, caRheb para 1 día (C), y la tasa de tumorigénesis (B)
prueba de Dunnett, * p & lt;. 0.05, *** p & lt; 0,001 frente a N. C. n = 5, media ± SE.
Cuando mTORC1 fue activado por caRheb sobreexpresión o tratamiento BCAA 4 mM, la fosforilación de la quinasa p70S6 aumentó y disminuyó la fosforilación de Akt. Además, la proteína β-catenina se redujo por la inhibición de la fosforilación de GSK3 través de la activación mTORC1.
Además, se GSK3 fosforilada por Akt (Ser473) en respuesta a la caída Raptor; Sin embargo, la fosforilación de GSK3 y la proteína β-catenina no fue afectada por Rictor caída.
Tumorigénesis de mTOR-desmontables y las células activadas por mTORC1
La activación de mTORC1 o inhibición de mTORC2 postulan para reprimir las células EpCAM positivos. La capacidad tumorigénico de células madre cancerosas se examinó usando un modelo de xenoinjerto implantado subcutáneamente con Raptor o knockdown Rictor, control plásmido de ADNc, o caRheb sobreexpresan células Huh7 en ratones para 4 semanas (Figura 5B y 5C).
BCAA mTORC1 activa; Sin embargo, los BCAA tiene efectos duales en mTORC1. La estimulación con altas dosis de BCAA disminuyó células EpCAM positivo mediante la activación de mTORC1, mientras que la estimulación con dosis bajas aumentó células EpCAM positivo a través de la inhibición de la mTORC1 (Figura 3A y 3B). BCAA de alta dosis no se pudo mantener a través de la implantación del tumor, y la tumorigénesis no se estableció cuando las células tratadas con BCAA alta dosis se implantaron subcutáneamente. En lugar de ello, se utilizó células como células mTORC1 de activación para el estudio tumorigénesis, lo que podría mantener la activación mTORC1 durante al menos una semana caRheb sobreexpresan.
Aunque el tamaño del tumor fue menor en el grupo implantado con células Raptor desmontables que en el grupo de control negativo (Figura 5C), la tumorigénesis se mantuvo en todos los 5 ratones, similar al grupo implantado negativo de células de control de transfección (Figura 5B). Sin embargo, los dos grupos que consisten en desmontables células Rictor y células que sobreexpresan caRheb tenían 0/5 ratones o sólo 1/5 ratones retener potencial tumorigénesis, respectivamente. Además, el tamaño del tumor en el grupo de caRheb sobreexpresión fue menor que en el grupo de ADNc de plásmido de control.
Discusión
Una de las novedosas aportaciones de este estudio fue el descubrimiento de que las células del cáncer experimentaron una mayor sensibilidad a los agentes de quimioterapia después de las células EpCAM positivos diferenciados por el tratamiento BCAA través de la activación mTORC1 (Figura 1). Además, la estimulación de baja BCAA con medio de LC con una relación de Fischer baja (relación de la concentración de aminoácidos de cadena ramificada sobre la concentración de ácido aromático), condujo a la activación mTORC1 suprimido, lo que resulta en un aumento de las células EpCAM positivas (Figura 3B). En pacientes con hepatitis crónica o cirrosis, hipoalbuminemia y disminución de los valores plasmáticos para la relación de Fischer de aminoácidos de cadena ramificada de ácidos aromáticos son comúnmente observados [26]. Estos pacientes pueden desarrollar HCC o tener una recaída de HCC. la suplementación de BCAA es conocido para mejorar la relación de Fischer en la cirrosis hepática [27]. Por lo tanto, una mayor relación de Fischer puede impedir la carcinogénesis del hígado o recaída debido a los CAC. En Japón, los gránulos de BCAA se indican para la cirrosis descompensada en pacientes con hipoalbuminemia a pesar de la ingesta dietética adecuada, y la administración oral de gránulos de BCAA eleva las concentraciones de BCAA plasma a aproximadamente 1 mM [20]. Después de la administración oral de BCAA en ratas, la concentración plasmática de BCAA en la vena portal fue varias veces mayor que la concentración de aminoácidos de cadena ramificada en la sangre periférica (datos no mostrados). Por lo tanto, consideramos que la concentración de aminoácidos de cadena ramificada utiliza
in vitro gratis (2
~ 4 mM) no fue significativamente diferente de la concentración de aminoácidos de cadena ramificada
in vivo
.
También se encontró que la activación mTORC1 mediante tratamiento BCAA suprime las células EpCAM positivos y mejoró la sensibilidad de los agentes quimioterapéuticos en tumores HCC (Figura 2). Examinamos EpCAM mRNA en el hígado después de la administración de BCAA en ratones normales para investigar si hay algún efecto en el hígado. Como resultado, BCAA no mostró ningún efecto sobre la expresión de EpCAM en el hígado (datos no mostrados).
El mecanismo de los efectos del tratamiento sobre las células BCAA EpCAM positiva se evaluó por la diferenciación acelerada para el cáncer células a través de la activación de mTORC1. La fosforilación de GSK3 se inhibió mediante la activación de mTORC1 y la señal Wnt /β-catenina aguas abajo, mientras que la fosforilación de β-catenina se mantuvo, lo que resulta en la degradación de β-catenina. Se infirió que esta inhibe la translocación nuclear de β-catenina, y posteriormente inhibe la transcripción de, c-myc, EpCAM, y Bmi1. Además, las señales de aguas abajo de EpCAM se determinó que una señal de transcripción c-myc [28], que se correlaciona con la expresión de EpCAM y c-myc. Estos sugieren que EpCAM, la expresión de c-myc se redujo y la activación mTORC1 aumento de la sensibilidad a la quimioterapia (Figura 2).
Por otra parte, se encontró que la activación mTORC1 disminuyó la expresión de la proteína de Rictor a través de la sobreexpresión de caRheb (Figura 5A). Los estudios han informado anteriormente de que la activación de p70S6 retroalimentación quinasa inhibe la fosforilación Rictor, resultando en la supresión de la función Rictor [29]. Sin embargo, nuestros datos muestran que la expresión de proteínas de Rictor disminuyó. El mecanismo por el cual la activación mTORC1 disminución de la expresión de proteínas de Rictor sigue sin estar claro y es una dirección potencial futuras investigaciones.
La inhibición de la función mTORC2 por Rictor knockdown dado lugar a la activación de p70S6 quinasa, una señal de mTORC1, disminución de EpCAM, c-myc, y la expresión FOXO3a, y la fosforilación de Akt, pero no tuvo ningún efecto sobre la GSK3 y expresión de la proteína de β-catenina. No estaba claro si p70S6 quinasa fue activada directamente por Rictor caída, aunque es posible que la activación mTORC1 y la inhibición de señales Akt condujeron a la disminución de la expresión de EpCAM. Varios estudios han sugerido que la inhibición de mTORC2, y no mTORC1, suprime la carcinogénesis [19,30]. En otros informes, la fosforilación de Akt (Ser473) correlacionó significativamente con stemness cáncer [31,32]. La investigación clínica ha informado que los pacientes con alta expresión de ARNm o Rictor EpCAM en el cáncer de hígado aislada tuvieron una mayor tasa de recaída [33,34].
En este estudio, nuestros resultados sugieren que el potencial CSC está fuertemente asociado con señales mTORC. Por otra parte, mTORC2 tiene un papel en el mantenimiento del potencial de células madre mientras que mTORC1 suprime este potencial (Figura 6).
La desnutrición o bajo relación de Fischer suprimen la activación mTORC1 lo que llevó a un aumento de stemness cáncer. Por el contrario, mantiene mTORC2 stemness cáncer. Sin embargo, mTORC1 inhibe mTORC2. BCAA suprime stemness cáncer mediante la activación de mTORC1, y mejora los efectos antitumorales de agentes de quimioterapia.
Es posible que la activación de mTORC1 solo por el tratamiento BCAA llevado a una disminución de la expresión de proteínas Rictor, que era similar al Rictor desmontables, lo que inhibe la activación de mTORC2 y mTORC1. Estos hallazgos sugieren que mTORC2 puede ser un verdadero objetivo terapéutico del cáncer, especialmente en la carcinogénesis relacionada con CSC y la activación de mTORC1 solo conduce a la disminución de EpCAM y c-myc expresión. Por lo tanto, se recomienda que las nuevas estrategias de terapia del cáncer tienen como objetivo inhibir mTORC2 y activan simultáneamente mTORC1.
Apoyo a la Información
Figura S1.
la imagen representativa de células positivas EpCAM que fue manchada como un método descrito en Materiales & amp; Métodos
doi: 10.1371. /Journal.pone.0082346.s001 gratis (TIF)
figura S2.
El porcentaje de células anexina V-positivas (A) y el número de células viable relativa (B) por matriz de exploración en las células Huh7 se cultivaron en DMEM que contenía 10% de FBS con o sin BCAA 4 mM en presencia (1 o 2 g /ml) o ausencia de 5-FU durante 72 h mediante el uso de protocolo de activación objetivo de exploración de matriz. Estudiante
t-test
, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, n = 7, media ± SE
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s002 gratis (TIF)
Figura S3. El volumen del tumor
en el modelo de xenoinjerto de ratón HAK-1B en el día 14 después de la administración de BCAA y la inyección de 5-FU. la prueba de Tukey: * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente a control, $$ p & lt; 0,01 frente BCAA, n = 6, media ± SE
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s003 gratis (TIF)
figura S4.
La detección del total-p-70S6 quinasa en presencia de DMEM, tratamiento BCAA, el pretratamiento con rapamicina (A) y el tratamiento BCAA, o la estimulación LC (B) durante 72 h en Huh7
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s004 gratis (TIF)