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PLOS ONE: celastrol suprime el crecimiento de células tumorales a través de Orientación de un AR-ERG-NF-kB Camino en TMPRSS2 /ERG gen de fusión Expresando cáncer de próstata

2014/4/20


Extracto

El gen de fusión TMPRSS2 /ERG (T /E) está presente en la mayoría de los cánceres de próstata (CaP). Hemos demostrado anteriormente que la señalización de NF-kB es muy activa en estos T /E de fusión de células a través de la fosforilación de NF-kB p65 Ser536 (P536) que expresa. Por lo tanto, la hipótesis de que la orientación de señalización NF-kB puede ser un método eficaz para el subgrupo de los PCA que realizan fusiones T /E. Celastrol es un conocido inhibidor de NF-kB, y por tanto pueden inhibir la fusión T /E expresar el crecimiento de células de CaP. Por lo tanto, se evaluaron los efectos de celastrol
in vitro
y
in vivo en las células
VCAP, que expresan el gen de fusión T /E. células VCAP se trataron con diferentes concentraciones de celastrol y se evaluaron la inhibición del crecimiento y la expresión objetivo. Para probar su capacidad para inhibir el crecimiento
in vivo
, se usó 0,5 mg /kg celastrol para tratar los ratones con tumores subcutáneos de xenoinjerto VCAP. Nuestros resultados muestran celastrol puede inhibir significativamente el crecimiento de la fusión T /E expresando células de CaP tanto

e in vitro
in vivo
través de la orientación tres vías de señalización críticos: AR, ERG y NF-kB, en estas células. Cuando los ratones recibieron 0,5 mg /kg celastrol por 4 veces /semana, inhibición del crecimiento significativa se observó con ninguna toxicidad obvia o pérdida de peso significativa. Por lo tanto, celastrol es un fármaco candidato prometedor para la fusión T /E expresar CaP. Nuestros resultados proporcionan una nueva estrategia para la terapia dirigida que pueden beneficiarse más de la mitad de los pacientes con CaP que tienen /E de la fusión T que expresan PCAS

Visto:. Shao L, Zhou Z, Y Cai, Castro P, Dakhov O, Shi P, et al. (2013) celastrol suprime el crecimiento de células tumorales a través de Orientación de un AR-ERG-NF-kB Camino en TMPRSS2 /ERG Fusión gen que expresa el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (3): e58391. doi: 10.1371 /journal.pone.0058391

Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América

Recibido: 5 de diciembre de 2012; Aceptado: February 4, 2013; Publicado: 6 Marzo 2013

Derechos de Autor © 2013 Shao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa del Departamento de Investigación del cáncer de próstata Defensa (DOD W81XWH-08-1-0055; JW) y el Instituto Nacional del cáncer al tejido Dan L. Duncan Cancer Center de humana y Patología Core (NCI: P30CA125123). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de próstata (CaP) es una enfermedad heterogénea que aún se conoce poco. Las vías alteradas a alta frecuencia en los tipos de tumores específicos de pacientes necesitan estar mejor definidos antes de diseñar la terapia dirigida de forma individual. Alentador que, en la última se ha hecho unos pocos años un progreso importante en la subclasificación de CaP, en particular, el hallazgo de que la TMPRSS2 /ERG (T /E) gen de fusión está presente en la mayoría de los PCA y es por tanto la lesión genética más común descubierto en CaP [1], [2], [3]. Muchos estudios han demostrado que el gen de fusión T /E puede promover la invasión y el CP a una proliferación en menor medida, y disminuir la diferenciación [4], [5]. La alta frecuencia de esta alteración y su importante papel en la biología del tumor CaP hace que sea una diana terapéutica destacada en el CaP. Hemos demostrado que la expresión de shRNA estable que se dirige específicamente a transcritos de fusión T /E disminuye significativamente el crecimiento del tumor
in vivo
, pero no eliminan por completo [6], lo que indica la necesidad de la terapia de combinación que puede superar la resistencia y /o la débil respuesta al tratamiento dirigido solo. Nuestros estudios muestran que NF-kB de señalización, en particular la fosforilación de NF-kB p65 Ser536 (P536) es muy activa en estas células que expresan /E de fusión T a través de ERG [7]. la señalización de NF-kB se ha demostrado previamente para jugar un papel importante en el crecimiento de PCa, la angiogénesis, tumorigénesis y progresión metastásica [8], [9], [10], [11], [12]. Dados los efectos pleiotrópicos de NF-kB en la progresión tumoral, la hipótesis de que la orientación de señalización NF-kB puede ser un método eficaz para el subgrupo de los PCA que realizan fusiones T /E.

En los últimos años, hay una creciente interés en la identificación de moléculas potentes y bioactivos a partir de fuentes naturales, incluyendo la medicina tradicional china [13], [14]. Algunas de estas moléculas pueden ofrecer a los pacientes opciones terapéuticas más seguras a largo plazo [15]. Celastrol, un compuesto farmacológicamente activo a partir del extracto del Dios del Trueno Vid china que se ha utilizado en China durante cientos de años, ha atraído mucha atención recientemente debido a sus actividades anti-inflamatorias y anti-cáncer significativas [16], [17] . Muchos estudios han demostrado que celastrol puede modular múltiples vías de señalización implicadas en la enfermedad y por lo tanto presentar un potencial valor terapéutico contra varias enfermedades crónicas y cáncer [16], [17]. Celastrol se ha demostrado que inhibe el crecimiento de muchos tipos de células cancerosas y suprimir tumor iniciación, progresión y metástasis en diversos modelos animales
in vivo
, incluyendo el cáncer de mama [18], cáncer de pulmón [19], cáncer de páncreas [20], glioma [21], y el melanoma [19], así como el CP [22], [23], [24], y hasta el momento no se han reportado efectos adversos significativos. Se han identificado muchas dianas moleculares importantes de celastrol, incluyendo NF-kB, Hsp90, el proteasoma, VEGFR, AKT /mTOR, c-Jun y otros [16], [18], [22], [25], [26] , [27], pero la inhibición de la ruta de NF-kB parece dar cuenta de la mayor parte de sus efectos terapéuticos.

a pesar de la alta frecuencia de la fusión T /E detectado en pacientes con CaP, sólo una línea de células de CaP de uso común ( VCAP) expresa endógenamente /la fusión T E. Es una línea celular dependiente de andrógenos y expresa alto nivel de AR, lo que puede conducir la expresión de ERG bajo el control del promotor dependiente TMPRSS2 AR. También muestra alto nivel de P536 en comparación con la expresión casi indetectable en otras líneas celulares de uso común CaP, incluyendo LNCaP, PC3 y DU145 [7]. Por ello, utilizó VCAP en nuestros estudios. Aquí, mostramos que celastrol es un inhibidor potente P536 que puede inhibir significativamente el crecimiento celular VCAP tanto
in vitro
y
in vivo
. Además, nuestros datos revelaron una cascada de AR-ERG-P536 dirigidos por celastrol señalización novela. La focalización de AR-ERG-NF-kB por celastrol es novedoso y se observa incluso cuando /E de fusión T que expresan células de CaP están expuestos a concentraciones muy bajas de celastrol. En tales condiciones, el otro informó vías principales no se ven afectadas. Sobre la base de todas las pruebas y sus efectos biológicos potentes, celastrol puede tener un potencial uso clínico para los pacientes que llevan /E de la fusión T en sus tumores CaP.

Materiales y Métodos

Cell Culture

células VCAP se mantuvieron en el medio DMEM (alta glucosa) con suero bovino fetal al 10% (FBS). células VCAP-Luc que expresan luciferasa utiliza para la imagen animal vivo se mantuvieron en el mismo medio DMEM pero con 2 g /ml de puromicina [6]. LNCaP, PC3 y DU145 se cultivaron en RPMI con 10% de FBS.

Western Blotting

ERG anticuerpo anti-conejo (1:2000) se obtuvo de Epitomics, Inc (Burlingame, CA, EE.UU. , cat#2805-1). AR-V7 anticuerpo (AR3) se adquirió de A & amp; G Precision ™ de anticuerpos (Columbia, MD, EE.UU., cat#AG10008) y se utilizó como dilución 1:1000. Anti-p65, p65 fosfo-Ser536, AR, IKBα, HSP90, el total de AKT-fosfo-AKT y Ser473 se obtuvieron todos de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE.UU.) y se utilizaron a una dilución 1:1000 para el Western Blot usando los procedimientos descritos anteriormente [28]. Control anti-β-actina se realizó como se describió anteriormente [28]. blot señales se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Thermo Fisher Scientific, Inc) y se expusieron y se desarrollaron con películas o sistema de imagen Bio-Rad y se cuantificaron mediante un densitómetro usando Quantity One (Versión 4.5.2, Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA ).

cuantitativo PCR en tiempo real

la fusión T /e y cebadores β-actina fueron como se describe anteriormente [3]. Se han usado 5 l de la plantilla de cDNA (dilución 1:20) en un volumen final de reacción de 15 ul. La mezcla maestra para PCR en tiempo real contenía MgCl2 2 mM, 0,4 mM cada uno hacia adelante y cebadores y 7,5 l de ADN Maestro SYBR Green (2 ×; Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE.UU.) a revertir. PCR en tiempo real se realizó utilizando el instrumento ABI desde seguido de un protocolo de PCR de 3 pasos con diferente temperatura de recocido se muestra a continuación. Los cebadores para la AR, AR3, p65 y CCL2 fueron: AR RTF: 5'-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 '; AR RTR: 5'-GGGCTGACATTCATAGCCTTCAATGTGTGAC-3 '; AR3 RTF: 5'-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 '; AR3 RTR: 5'-TGCCAACCCGGAATTTTTCTCCC-3 '; P65 RTF: 5'-CTGCAGTTTGATGATGAAGA-3 '; P65 RTR: 5'-TAGGCGAGTTATAGCCTCAG-3 '; CCL2 RTF: 5'-TCTCAGTGCAGAGGCTCG -3 '; CCL2 RTR: 5'-GTTTGGGTTTGCTTGTCCAG -3 '. Se recogió la expresión relativa de? Ct entre los diferentes grupos experimentales y normalizados expresiones de ß-actina.

Ensayo de proliferación

1 × 10
5 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos, por triplicado y las células unidas se contaron usando un contador de células como se describe anteriormente [29]. Celastrol se adquirió de Sigma-Aldrich Co. LLC. (Cat#c0869) y se disolvió en DMSO como se recomienda. Para las células VCAP se inició el tratamiento celastrol 48 h después de la siembra. LNCaP, PC3 y DU145 células se trataron con celastrol 24 h después de la siembra inicial. Diferentes dosis de celastrol se aplicaron a cada grupo experimental. El experimento se repitió tres veces.

VCAP-Luc subcutánea Ratones Modelo

Doce semanas se utilizaron ratones desnudos viejos. 4 × 10
6 células que expresan VCAP luciferasa (Luc VCaP- células) se mezclaron con 100 ul de Matrigel (BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.) en un volumen total de 200 ul y se inyecta por vía subcutánea. El crecimiento tumoral se controló semanalmente después de la inyección inicial utilizando el sistema de formación de imágenes IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EE.UU.) [6]. Dieciséis ratones mostraron un 1 × 10
5 luminancia leer una semana después de la inyección y se incluyeron en los experimentos de tratamiento. Ellos se separaron aleatoriamente en 2 grupos experimentales de 8 ratones en cada grupo. Los ratones en el grupo de tratamiento se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) con 200 ul de 0,5 mg /kg celastrol disolvió en 3% de DMSO y PBS, mientras que los animales de control recibieron 200 ul de vehículo (3% de DMSO y PBS). El tratamiento se llevó a cabo 4 veces por semana durante 3 semanas. pesos de los ratones se controlaron dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados 24 horas después de la inyección final y se extirparon los tumores primarios, se pesaron, y una porción del tumor se congeló en nitrógeno líquido para el análisis molecular y otra parte fija y embebido en parafina. La necropsia se realizó también en ratones para descartar efectos secundarios del tratamiento. Las diferencias en el tamaño medio del tumor son examinadas mediante la prueba t. Extractos de proteínas y de ARN se prepararon para el análisis adicional. Un microarray tisular (TMA) se preparó para el análisis IHC. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Colegio Baylor de Medicina Institucional Uso de Animales y Comité de Cuidado (IACUC número de protocolo#AN-4542).


La inmunohistoquímica Opiniones y Análisis de la apoptosis

La inmunohistoquímica (IHC) de los tumores subcutáneos VCAP se realizó con anti-fosfo-p65-Ser536 y ERG como se describe anteriormente [7], [29]. Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-AR desde Biocare médica, Concord, CA, EE.UU. (Cat#CM109) se utilizó para IHC para evaluar la expresión de AR en las secciones del tumor utilizando una dilución 1:50. Las láminas fueron fotografiados utilizando un microscopio Nikon Eclipse E400 conectada con Nuance sistema multiespectral en 40 × 200 × aumentos o con una resolución de 3,3 megapíxeles. Para Ki-67 y CD31 IHC y TUNEL, las imágenes se guardan como archivos JPEG con imágenes fueron tomadas 4-6 para cada diapositiva, que cubre toda el área del tumor. El valor numérico para el teñido por ciento (PS) se determina utilizando el software Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) y se comparó mediante pruebas t.

Resultados

celastrol P536 es un potente inhibidor

Dado el hallazgo de que la señalización de NF-kB es muy activa en /E de la fusión T células que expresan, hemos tratado de probar la hipótesis de que la orientación de señalización NF-kB puede ser una terapéutica viable enfoque para la fusión de T /E expresar CaP. Por lo tanto, se evaluaron los inhibidores de NF-kB varios candidatos entre ellos dos inhibidores de la activación de NF-kappa B (481.407 compuestos y celastrol) y MG132, un NF-kB con inhibidor que funcionan a nivel de la inhibición del proteasoma [9], [30]. Como se muestra en la Fig. 1A, celastrol puede abolir significativamente P536 en las células VCAP cuando se usa a una concentración de 2 mM durante 18 h, mientras que los otros dos NF-kB inhibidores 481407 (2 M) y MG132 (2,5 M) [9] no mostraron tal efecto, como lo hizo PS1145 (datos no mostrados). La inhibición de la expresión P536 por celastrol era evidente incluso con un tratamiento de 2 h a 0,05 M celastrol que resulta en una reducción de más del 60% de la expresión de P536 (Fig. 1B), lo que indica celastrol es un inhibidor potente P536.

células VCAP (a) fueron tratados con inhibidores de NF-KB diferentes para 18 h. Western blot muestra que celastrol 2 M durante 18 h de tratamiento pueden inhibir significativamente la expresión de P536, mientras que 481.407 (2 M) y MG132 (2,5 M) casi no tuvieron un impacto sobre la expresión de P536. Además de P536, disminuido dramáticamente AR y ERG expresión en los niveles de proteína se observaron en el grupo tratado celastrol, pero no se reducen por otros dos inhibidores. pocillos duplicados se muestran para cada grupo. β-actina se utilizó como control. (B) células VCAP se trataron con diferentes concentraciones de celastrol durante 2 h. Significativa disminución de la expresión P536 se observó en todos los grupos de western blot, incluyendo el grupo de menor concentración de 0,05 M, sugiriendo fuertemente celastrol es un inhibidor potente P536. β-actina fue el control.

Se ha informado de que celastrol puede inhibir la expresión de AR en las células LNCaP [22]. Si se dirige a AR en las células VCAP que podría causar downregulated expresión ERG que a su vez podría dar lugar a una disminución de expresión P536 como se ha descrito anteriormente por nuestro grupo [7]. Como se muestra en la Fig. 1A, celastrol a 2 M durante 18 h pueden inhibir significativamente AR y expresión ERG, además de abolir totalmente la expresión en células P536 VCAP, mientras que los otros dos inhibidores no mostraron tales efectos.

AR-ERG-P536, una novela de señalización en cascada blanco de celastrol in vitro

Hubo muchos otros objetivos de celastrol reportados en diferentes sistemas /células, incluyendo la vía AKT y Hsp90. Con el fin de demostrar la inhibición de la AR-ERG-P536 es único en células /E de fusión que expresan T, células tratadas con VCAP celastrol de 2 h y 24 h utilizando diferentes concentraciones que varían de 0,05 M a 2 M. Como se muestra en la Fig. 2A, el tratamiento celastrol de 2 h se puede inhibir la expresión de P536 significativamente incluso a la muy baja concentración de 0,05 M, pero esta concentración casi no mostraron efectos sobre la AR (incluyendo AR3, una isoforma activa de AR) o expresión ERG, así como otras proteínas, incluyendo p65 total IKBα, total-AKT, fosfo-AKT 473 y Hsp90. En un experimento de tratamiento 24 h, la menor concentración de 0,5-1 M, celastrol puede inhibir significativamente AR, expresión de la proteína AR3andERG además de expresión P536, mientras que p65, IKBα, fosfo-Akt473, Total-Akt y Hsp90 son casi no se ven afectadas. Debido a sus actividades biológicas pleiotrópicos, se debe tener cuidado en cuanto a la dosis de celastrol utilizado para
in vitro
o
in vivo
. A mayor concentración, múltiples vías importantes pueden verse afectados desde 2 M celastrol comienza a regular a la baja fosfo-AKT473 (Fig. 2B). También se encontró que sólo se requiere 0,75 M celastrol durante 24 h para abolir p-AKT473, AKT total y la expresión total de AR en las células LNCaP (datos no mostrados), mientras que el anterior estudio utilizó 5 M para mostrar la supresión de AR y otros efectos biológicos causados ​​por celastrol en la misma línea celular [22]. Por lo tanto, la definición de la concentración /dosis mínima es crítica para evitar cualquier toxicidad potencial causado por la inhibición de múltiples vías afectadas. Nuestro
in vitro
datos indican que celastrol, cuando se utiliza entre 0,5 M a 1 M, puede dirigirse a AR-ERG-P536 cascada de señalización casi exclusivamente sin afectar a otras vías principales. Hemos probado más ERG, AR y expresión AR3 a nivel de ARN en estas células tratadas celastrol por RT-PCR cuantitativa [3]. Como se muestra en la Fig. 3, se confirmó la inhibición de T /E de fusión, AR y AR3 la expresión génica por celastrol a nivel de ARN de una manera dependiente de la dosis.

(A) de transferencia de Western muestra que celastrol 2 h Treament puede apuntar significativamente la expresión en las células P536 VCAP. celastrol concentraciones se muestran en la parte superior de cada carril. tratamiento de corta duración de celastrol no afecta AR, AR3, la expresión de ERG, y p65 total, el IKBα, así como otros objetivos celastrol bien conocidos tales como AKT total de, fosforilada AKT-473 y Hsp90. (B) Cuando los tratamientos celastrol una duración de 24 h, la señalización P536 fue casi abolida en todos los grupos. En los grupos en los que la concentración celastrol es igual o mayor que 0,5 M, significativa disminución de la AR y ERG así como la expresión AR3 se observaron. Cuando la concentración llega a los 2 M, 24 h de tratamiento puede afectar a múltiples señalización tales como fosfo-AKT. β-actina se utilizó como control.

Cuando las células VCAP se trataron con diferentes concentraciones de celastrol durante 24 h, la inhibición de genes específicos se evaluaron por cuantitativa en tiempo real PCR. β-actina se utilizó como gen de control. expresión de la fusión /E T (A), AR (B) y AR3 expresión (C) se muestran en cada figura. La inhibición de estos genes en los niveles de ARN por celastrol son significativos de una manera depedent de la dosis. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado celastrol y el control de la prueba t.

celastrol puede inhibir la expresión de CCL2, tanto a nivel de ARN y proteínas

Como se informó anteriormente un candidato gen, CCL2, está regulada positivamente en la fusión de T /E células que expresan PNT1a [7]. Esta regulación al alza de CCL2 podría resultar de la señal elevada NF-kB en estas células por parte del /de la fusión T E. CCL2 (también llamada MCP-1) es una quimiocina que es un potente regulador de la migración celular PCa y la proliferación [31], [32], [33]. CCL2 se expresa por las células endoteliales en el microambiente del tumor, pero también puede ser expresado por las células tumorales directamente [31], [32]. Más importante aún, la evidencia emergente sugiere CCL2 es un objetivo transcripcional directa de NF-kappa B [34]. Sobre la base de esta evidencia, la hipótesis de que celastrol puede tener un impacto directo sobre la expresión de CCL2. Se han tratado las células VCAP con diferentes concentraciones de celastrol de 2 h o 24 h. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento celastrol por sólo 2 h puede reducir significativamente la expresión de ARNm en las células CCL2 VCAP evaluada por Q-RT-PCR y tal inhibición es dependiente de la dosis. Si los tratamientos duración de 24 h, incluso 0,05 M celastrol pueden disminuir significativamente la expresión mRNA CCL2 (Fig. 4B). Es de destacar que otros estudios han demostrado CCL2 puede ser secretada en el medio de cultivo por las células VCAP [31]. Por lo tanto, hemos recogido medio de cultivo de cada grupo de tratamiento y la prueba de concentración CCL2 celastrol usando el kit de Elisa CCL2 ebioscience.com. Como se muestra en la Fig. 4C, todos los grupos de tratamiento celastrol (24 h de tratamiento), incluyendo el grupo de tratamiento más baja concentración de 0,05 M mostraron una disminución significativa CCL2 en el medio de cultivo. Por lo tanto, tenemos evidencia adicional de que celastrol, como un inhibidor de NF-kB potente, puede afectar significativamente a los objetivos de abajo de NF-kB. Sin embargo, si la fosforilación de ser536 juega un papel en la regulación de la expresión de CCL2 es actualmente desconocido.

células VCAP (A) se trataron con celastrol durante 2 h, la inhibición de CCL2 a nivel de ARN se muestra en una dosis-depedent forma por PCR en tiempo real; (B) cuando los tratamientos celastrol se realizaron durante 24 h, incluso de 0,05 M puede disminuir dramáticamente la expresión CCL2; (C) cuando se expone a celastrol durante 24 h, la proteína CCL2 secretada en medio de cultivo por las células VCAP se redujo significativamente. se muestran los datos de ELISA. Cada concentración se ensayó por triplicado y se repitió el experimento tres veces. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado celastrol y el control de la prueba t.

celastrol Significativamente puede inhibir T /E Fusión Expresando crecimiento celular in vitro VCAP

celastrol puede inhibir significativamente el crecimiento de células CaP
in vitro
incluyendo líneas celulares de CaP más utilizadas de LNCaP, PC3 y DU145 [22], [35]. Sin embargo, celastrol nunca ha sido probado en células VCAP. Desde celastrol puede apuntar AR-ERG-NF-kB, tres vías principales en las células VCAP, razonó que es probable que exhiben una fuerte inhibición del crecimiento celular VCAP. Se han tratado las células VCAP con diferentes concentraciones de celastrol para 24 h y el número de células se contaron usando un contador de células. Como era de esperar, el crecimiento celular VCAP puede ser inhibida significativamente por celastrol de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5A). Dado que las células VCAP expresan alto nivel de P536 (en comparación con la señal casi imperceptible de otras células de CaP), y AR, que postula que la fusión T /E células que expresan VCAP sería la línea más sensible de células CaP a celastrol tratamiento mientras LNCaP sería sensible debido a AR expresión y las células PC3 y DU145 negativos AR deben ser relativamente insensibles. Para probar esta hipótesis, se utilizó 0,5 M celastrol, la dosis efectiva más baja que muestra un impacto significativo en AR, ERG, y la expresión de P536 (ver
in vitro
datos en la Fig. 2B), para el tratamiento de LNCaP, PC3, células DU145 y VCAP para 24 h. En nuestra condición experimental, las proporciones de supervivencia celular son 55%, 72%, 83% y 100% para VCAP, LNCaP, PC3 y DU145, respectivamente (Fig. 5B). Estos datos sugieren fuertemente de nuevo celastrol puede ser un buen candidato a fármaco /E de la fusión T que expresan CaP
.
Las células (A) (1 × 10
5) se sembraron en placas de 35 mm en medio completo y tratada con diferentes concentraciones de celastrol durante 24 h. Proliferación de los 8 grupos de células VCAP se midieron usando un contador Coulter. Las células se trataron con tripsina y se contaron en triplicado. El número de células para cada grupo se dividen por el número total de células en el grupo de control sin tratamiento celastrol. El experimento se repitió tres veces. La media +/- desviación estándar se muestra. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado y el celastrol control. (B) 1 × 10
5 de VCAP, LNCaP, PC3 y DU145 fueron exposured a 0,5 M celastrol durante 24 h, el número de células se contaron para cada grupo y dividido por el número total de células en los grupos control para obtener la relación de supervivencia .El experimento se repitió tres veces. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre las distintas líneas celulares y las células VCAP.

celastrol puede inhibir T /E Fusión Expresando crecimiento celular in vivo VCAP

Sobre la base de estos
in vitro
resultados, se mueve hacia adelante para
in vivo
experimentos utilizando celastrol para tratar tumores VCAP en un modelo de tumor subcutáneo. Una semana después de la inyección subcutánea de 4 × 10
6 luciferasa que expresan las células VCAP en ratones desnudos, se inició el tratamiento celastrol. Dieciséis ratones mostraron más de 1 × 10
5 luminancia lectura de una semana después de la inyección y se incluyeron en para los experimentos. Los ratones en el grupo de tratamiento se inyectaron con 0,5 mg /kg celastrol I.P. El tratamiento se llevó a cabo 4 veces por semana durante 3 semanas. Los ratones se pesaron y de formación de imágenes de tumores basado luciferasa se realizó semanalmente. Los ratones fueron sacrificados 24 horas después de la última inyección y tumores primarios extirpados, se pesaron y se congelaron rápidamente para los estudios moleculares o presentado para la histopatología y una necropsia completa realizada en ratones. No se observó significativamente disminución del peso corporal (Fig. 6A). Un ratón en el grupo de tratamiento celastrol mostró inflamación peritoneal pero no se observaron efectos tóxicos significativos en el pulmón, el riñón, el hígado, el bazo y el corazón. Hemos observado que algunos tumores comenzaron contracción después de 2 semanas de tratamiento celastrol y para el final de los experimentos de cuatro ratones mostraron luminiscencia menor que 1 × 10
5. La actividad de luciferasa antes de la eutanasia se muestra en la Fig. 6A. Había una marcada inhibición del crecimiento del tumor en el grupo tratado celastrol y al final de la luminiscencia tumor tratamiento se redujo ~ 70% (p = 0,048, prueba t) en comparación con el grupo control. Hemos sido capaces de recolectar 5 tumores del grupo tratado celastrol y 7 tumores del grupo de control. peso final del tumor en el grupo de tratamiento se redujo a sólo el ~ 10% de la del grupo no tratado (P = 0,0034, prueba t). Por lo tanto 0,5 mg /kg de tratamiento celastrol puede inhibir significativamente el crecimiento del tumor VCAP
in vivo
.

(A) ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con células que expresan VCAP luciferasa. Después de una semana los ratones fueron tratados con 0,5 mg /kg celastrol o vehículo solamente. se muestra el flujo de luciferasa de los tumores antes de la eutanasia y pesos de los tumores y el cuerpo en la terminación del tratamiento. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado y el grupo control. (B) Inhibición de la AR, ERG y P536 por Western blot cuantitativo normalizado a ß-actina. Se muestra representativa de Western blot de extractos tumorales VCAP con anticuerpos contra la AR, ERG o P536. En cada uno de western blot, carriles 1-4 son los tumores de control y los carriles 5-8 son celastrol tumores tratados. β-actina es un control de carga. (C) Un microarray tisular (TMA) se preparó para el análisis IHC para estos tumores ratones recogidos. Se muestran las muestras representativas. Las imágenes de los dos paneles de la izquierda son para un tumor de ratón de control y las imágenes de la derecha dos paneles son de un tumor ratón tratado celastrol. H & amp; E, AR, ERG y tinción P536 se muestran tanto con una ampliación de 40 × 100 × y. Disminuyeron drásticamente AR, ERG y de expresión P536 causada por el tratamiento celastrol se ven.

Análisis de los tumores recogidos de ratones tratados o no tratados con celastrol se realizó utilizando Ki67 IHC seguida por análisis de imagen cuantitativo y no mostró diferencias significativas . TUNEL tinción mostró que había más células apoptóticas encontradas en los tumores tratados celastrol comparación con los tumores no tratados. La diferencia fue significativa (P & lt; 0,05, t-test). Así, la disminución del crecimiento del tumor se puede atribuir al aumento de la muerte celular, que es coherente con los informes anteriores [22], [36]. También se realizó anti-CD31 IHC para evaluar la densidad de microvasos como un marcador de la angiogénesis. Se observó ninguna diferencia significativa entre los tumores tratados y no tratados.

Hemos demostrado
in vitro Windows que puede apuntar celastrol AR, ERG y P536. Por lo tanto, hemos tratado de determinar si se vieron afectados estos mismos objetivos
in vivo
. Debido a la masa del tumor muy pequeño recogido en el grupo tratado celastrol (el peso medio de estos tumores eran 5 0,0345 g), que sólo se podía tener 4 muestras de tumor para el análisis occidental. Por lo tanto, elegimos al azar 4 tumores del grupo de control para comparar la expresión a nivel de proteínas. Como se muestra en la Figura 6B, disminuyó significativamente AR, ERG y de expresión P536 se observaron en el grupo tratado celastrol en comparación con el grupo control (P & lt; 0.05, t-test). También se observó una ligera reducción de la expresión de Hsp90 en los tumores tratados, pero la diferencia no fue significativa (datos no mostrados, p = 0,1, t-test). Además, se encontró que celastrol no tiene ningún efecto sobre la expresión de Akt total. Debido a la masa tumoral muy limitado, no fuimos capaces de obtener AR3 y expresión de fosfo-AKT en estas muestras tumorales.

En general, los datos indican celastrol puede inhibir significativamente el crecimiento celular VCAP
in vivo
por la orientación de la señal AR-ERG-NF-kB y sugiere celastrol puede tener un potencial terapéutico para la fusión de T /e realización CaP.

la discusión se ha hecho

avances significativos en los últimos años con respecto a la subclasificación de CaP en base a las alteraciones genéticas en las células tumorales, incluyendo reordenamientos cromosómicos que implican ETS de factores de transcripción de la familia o la sobreexpresión de SPINK1, un gen que codifica un inhibidor de serina proteasa secretada. Es alentador que Ateeq et al. proporcionado pruebas que apoyan una justificación para la orientación del SPINK1 en SPINK1
+ /ETS
- PCAS y demostró que el tratamiento combinado de anticuerpo monoclonal dirigido tanto receptor del factor de SPINK1 y de crecimiento epidérmico puede causar una reducción más significativa en la formación de tumores que cualquiera de los anticuerpos monoclonales solos , que proporciona una fuerte evidencia de la terapia dirigida para el SPINK1
+ /ETS
- PCA [37]. El impacto de este hallazgo está limitada por el hallazgo de que SPINK1 sólo se expresa en un pequeño porcentaje de PCAS (~ 10%) y no se ve en ETS-factor de expresar CaP. La mayoría de las ETS PCAS-positivo llevar fusiones /E T que están presentes en más de la mitad de los PCA. Por lo tanto hay una necesidad urgente de descubrir nuevas opciones de tratamiento para este importante subgrupo de los PCA. Hemos demostrado anteriormente que la orientación transcripciones de fusión T /E utilizando shRNA puede disminuir significativamente el crecimiento del tumor
in vivo
[6], pero no lo eliminan por completo. También hemos demostrado que la señalización de NF-kB, a través de la fosforilación de NF-kB Ser536 p65 es muy activa en éstos la fusión T /E expresando células de CaP (& gt; 90% del total de casos analizados) y la ausencia de P536 se asocia con una disminución de bioquímica recurrencia [7]. Dados los efectos pleiotrópicos de NF-kappa B en la progresión del tumor, estos resultados sugieren que la señalización de NF-kB, en particular la fosforilación de p65 Ser536, juega un papel crítico en la tumorigénesis en PCAS teniendo fusiones T /E. Por lo tanto, la hipótesis de que una de dos pasos estrategia de terapia personalizada de focalización tanto T fusión /E y la señalización de NF-kappa B, que es similar al enfoque de SPINK1
+ /ETS
- PCAS como se ha discutido anteriormente [38] , puede ser un enfoque viable para este subgrupo de CaP que lleva /E de la fusión T.

En este estudio, mostramos que celastrol, un conocido inhibidor de NF-kB, puede ser un excelente fármaco candidato para el tratamiento T /E
+ /P536
+ CaP. Celastrol puede modular múltiples vías de señalización implicadas en el cáncer y por lo tanto puede inhibir significativamente el crecimiento de células de cáncer [16], [17]. dianas moleculares múltiples de celastrol se han identificado incluyendo AKT, Hsp90 y otros [16], [18], [22], [25], [26], [27], [39]. Se demuestra en primer lugar que celastrol es un inhibidor potente tanto P536
in vitro
y
in vivo
. Muy baja concentración de tratamiento celastrol 0,05 M durante 2 h disminuyó significativamente la expresión de P536 en las células VCAP. Del mismo modo, el tratamiento de 0,5 mg /kg celastrol 4 veces /semana, la dosis más baja jamás reportado en la literatura, puede disminuir significativamente los niveles de P536 en xenoinjertos de tumores VCAP. La fosforilación de p65 se ha demostrado por muchos grupos para mejorar la actividad de p65 transcripcional (ver comentarios [40] y [41]), pero el papel exacto de P536 en células de CaP especialmente en las células /E de fusión que expresan T es desconocida y los genes regulados específicamente por P536 nunca han sido exploradas en el CaP. Nuestros datos muestran que la expresión de CCL2, un objetivo bien conocido de p65 NF-kappa B y un potente regulador para la migración celular PCa y la proliferación [31], [32], [33], se puede inhibir de manera espectacular por celastrol tanto en ARNm y

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