Extracto
Los microARN (miRNA) desempeñan un papel fundamental en muchos procesos biológicos y se expresan de forma aberrante en los cánceres humanos. En particular la función de miRNAs ya sea como supresores de tumores u oncogenes y parecen tener importancia diagnóstica y pronóstica. Aunque numerosos miRNAs son dys-regulada en el cáncer colorrectal (CRC) sólo una pequeña fracción se ha caracterizado funcionalmente. El uso funcional de cribado de alto rendimiento y miARN perfiles de las muestras clínicas del presente estudio tiene como objetivo identificar miRNAs importante para el control del crecimiento y /o apoptosis celular en el CCR. El cribado funcional de alto rendimiento se llevó a cabo en seis líneas celulares de CRC transfectadas con una biblioteca de pre-MIR incluyendo 319 sintética humana pre-MIR. alteraciones fenotípicas fueron evaluados por inmunotinción de CPARP escindido (apoptosis) o MKI67 (proliferación). Además, TaqMan microARN humano matriz v2.0 Set se utilizó para el perfil de expresión de 667 miRNAs en 14 mucosa del colon normal y 46 pacientes en estadio II microsatélites estables CRC. Entre los miRNAs que inducen la detención del crecimiento y la apoptosis en las líneas celulares de CRC, y al mismo tiempo eran dis-regulados en las muestras clínicas, miR-375 fue seleccionado para su posterior análisis. Independiente
análisis in vitro
de líneas celulares de CRC transfectadas transitoria y estable confirmó que miR-375 reduce la viabilidad celular a través de la inducción de la muerte apoptótica. Se identificaron YAP1 como un objetivo de miR-375 directa en el CRC y el espectáculo que Infiernos y NOLC1 son blancos corriente abajo. Knock-down de YAP1 imitaba el fenotipo inducido por el miR-375 sobre-expresión que indica que el miR-375 muy probablemente ejerce su función pro-apoptótica a través YAP1 y sus propiedades anti-apoptóticos aguas abajo objetivos BIRC5 y Bcl2l1. Por último,
Análisis in vivo Red de xenoinjertos de tumores de ratón mostraron que el miR-375 expresión redujo significativamente el crecimiento del tumor. Llegamos a la conclusión de que el alto rendimiento de cribado de miRNAs identificados con éxito que inducen la apoptosis y /o inhiben la proliferación en células de CRC. Por último, la combinación de la proyección funcional con perfiles de muestras de tejido CRC hemos identificado miRNAs clínicamente relevantes y los genes miARN objetivos en el CCR
Visto:. Christensen LL, Holm A, J Rantala, Kallioniemi O, Rasmussen MH, Ostenfeld MS, et Alabama. (2014) El cribado funcional Identifica miRNAs que influyen en la proliferación y apoptosis en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (6): e96767. doi: 10.1371 /journal.pone.0096767
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 24 Julio, 2013; Aceptado: April 11, 2014; Publicado: Junio del 3, 2014
Derechos de Autor © 2014 Christensen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional danesa de Tecnología avanzada, la Fundación John y Birthe Meyer, el Consejo danés de Investigación Independiente (Ciencias médicas), el Consejo danés de Investigación estratégica, la Fundación Lundbeck y VII Programa Marco de la Unión Europea (SYSCOL SALUD-F5 -2010 hasta 258.236). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad maligna común y una causa principal de mortalidad por cáncer en todo el mundo. El riesgo de por vida es de aproximadamente 5% y el aumento de [1]. CRC es causada por la acumulación de numerosas alteraciones genéticas y epigenéticas. La inestabilidad cromosómica que conduce a cuentas alélica desequilibrio de 70-85% de los tumores mientras que 20-15% tienen defectos desajuste de reparación del ADN que conducen a la inestabilidad de microsatélites. Las alteraciones moleculares en CRC se han estudiado intensamente con el fin de descubrir marcadores de diagnóstico y pronóstico. Entre otros, el ARNm de perfiles de expresión ha sido ampliamente utilizado para identificar los genes expresados diferencialmente con implicaciones de pronóstico y diagnóstico. Sin embargo, en la actualidad ninguna de ellas se han traducido en la práctica clínica y, en consecuencia, todavía hay una necesidad de una caracterización molecular más y clasificación de CRC.
Los microARN (miRNA) comprenden una clase abundante de pequeña (19-24 nt), no codificante moléculas de ARN reguladoras [2]. Desempeñan un papel crítico en el control de la expresión génica a nivel post-transcripcional de unión complementaria de la hebra de miARN a la secuencia diana de ARNm, dando lugar a la degradación del ARNm, ya sea o inhibición de la traducción [3]. Más de 60% de todos los genes de codificación de proteínas contienen sitios de unión conserva miARN y por tanto son objetivos potenciales de miRNAs [4]. MiRNAs han demostrado estar involucrados en muchos procesos biológicos tales como la proliferación celular, la apoptosis, la diferenciación y la angiogénesis [5] - [7]. En la actualidad, miRNAs han demostrado que desempeñan papeles importantes en muchos tipos de cáncer (revisado por Garzón et al. [8]). El papel de miRNAs en el desarrollo de CRC ha sido intensamente estudiada. En 2006, Cummins y colaboradores publicaron el primer análisis detallado y sistemático de los genes miARN expresión en el CCR, mostrando arriba y abajo de la regulación de miRNAs específicos [9]. Desde entonces, varios estudios han confirmado la dis-regulación de miRNAs en el CCR [10] - [15]. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de la función de los miRNAs se limita a un número bastante reducido de miRNAs. cribado funcional ha sido utilizado para identificar miRNAs que están causalmente ligados a fenotipos específicos (revisado por Izumiya et al. [16]). En el CRC, el cribado funcional se ha utilizado en algunos casos para identificar miRNAs que afectan a la proliferación celular y la muerte [17], [18]. Sin embargo, el estudio realizado por Nakano et al. se llevó a cabo en una sola línea celular y sus hallazgos no se correlacionaron con la expresión de los miRNAs en muestras clínicas de CRC. Por último, el cribado funcional ha identificado miRNAs clínicamente relevantes en los tumores de células germinales testiculares y pancreáticas [19], [20].
El potencial diagnóstico y pronóstico reconocido de miRNAs y una necesidad de nuevos análisis funcionales sistemáticas de los miRNAs en la CRC nos animó a combinar funcional de cribado de alto rendimiento con la expresión de los genes miARN perfiles en muestras clínicas. La expresión ectópica de 319 miRNAs en 6 diferentes líneas celulares de CRC se combinó con miARN perfiles de expresión de 14 de la mucosa del colon normal y 46 tumores colorrectales. Estos análisis identificaron una serie de miRNAs que mostraron ser expresadas diferencialmente en el CCR y para tener un impacto en la proliferación y /o la apoptosis celular
in vitro
. Entre ellos se seleccionó el miR-375 para más
in vitro
y
in vivo
análisis, que confirmó que el miR-375 reduce el crecimiento del tumor a través de la inducción de la muerte apoptótica. Para identificar el potencial de miR-375 se dirige a la expresión de ARNm de miR-375 se correlacionó con todo el genoma perfiles de expresión de ARNm. El análisis de correlación de ambos
in vitro
sistemas de modelos y muestras de CRC clínicos revelaron que la expresión de la proteína asociada a 1 Sí (YAP1) se correlacionó negativamente con el miR-375. inmunoprecipitación ago2 indicó que YAP1 es un objetivo directo de miR-375 en el CCR. Otros estudios funcionales indicaron que el papel pro-apoptótica de miR-375 más probable es mediada por YAP1 y sus propiedades anti-apoptóticos aguas abajo objetivos BIRC5 y BCL2L. Por último, helicasa-linfoide específico (INFIERNOS) y nucleolar y el cuerpo en espiral de fósforo proteína 1 (NOLC1) fueron identificados como dianas aguas abajo de miR-375 potencialmente juegan un papel en la regulación del ciclo celular vías.
Materiales y métodos
Una descripción completa de los materiales y métodos se proporcionan en el material complementario (métodos S1).
Declaración de Ética
el uso de las muestras de tejidos humanos para fines de investigación fue aprobado por el Consejo de Investigación en el Instituto Walter y Eliza Salón de la Investigación médica HREC (cohorte 1 AUS; HREC No 12/19), el Comité de Ética de la Universidad de Pomerania (cohorte 1 POL; BN-001/174/05) , los comités centrales Dinamarca Región de Ética de la Investigación Biomédica (cohorte 1 DK; 1999/4678) y los Comités de la Región Sur de Dinamarca sobre Ética de la Investigación Biomédica (cohorte 2 NS; VF-20040047). Consentimiento informado, se da por todos los participantes. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el (número de expediente: 2013-15-2934-00861 /ACHOV) Experimentos con Animales danesa Inspección
Las muestras clínicas y líneas celulares
cohorte 1 consistió en un total de 46 fresco congelado estable de microsatélites (MSS), etapa primaria II (T2-4, N0, M0) CRC y 14 de la mucosa del colon normal. Una cohorte independiente que consta de 25 mucosa normal del colon y 63 MSS, la etapa I-IV primario (T2-4, N0-3, M0 /1) CRC (cohorte 2) se utilizó para la validación. Pacientes y características de la muestra se resumen en la Tabla 1. Las líneas celulares, condiciones de crecimiento y la autenticación línea celular se puede encontrar en el material complementario (Métodos S1).
Animales
BALB /cAnNTac ratones deficientes inmunes -nude (6-8 semanas, 20 a 22 g) fueron adquiridos de Taconic Europa (DK-4623 Ll. Skensved, Dinamarca). Antes de los experimentos, los ratones se les concedía un período de prácticas de al menos 14 días. Los ratones se mantuvieron en condiciones idénticas (es decir, temperatura constante ambiente (22 ° C) y un ciclo de luz natural del día /noche. Comida estándar de laboratorio y agua se proporcionaron ad libitum.
Mirna pantalla de la biblioteca funcional
La tecnología de microarrays punto de células se utiliza para generar pre-miARN microarrays de transfección de alta densidad como se ha descrito previamente con modificaciones menores [21]. en resumen, una biblioteca de la celebración de 319 humana sintética pre-miRNAs (Ambion pre-MIR v1.0) (Ambion , Austin, TX, EE.UU.) fue utilizado para la impresión de las matrices. Posteriormente, las células CRC (HCT116, LS174T TR4, DLD1 TR7, HT29, Caco2 y SW480) fueron sembradas en las matrices y reverso transfectadas durante 48 horas. para permitir microscópica detección de los efectos pre-miRNAs influir en la proliferación celular y /o apoptosis de las matrices se inmunotiñeron para Ki-67 (marcador de proliferación) y para poli polimerasa escinde ADP-ribosa (CPARP) (marcador de apoptosis). el ADN se tiñó usando 4 ', 6 diamidino -2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) o SYTO60 (Invitrogen). El análisis de microarrays se realizó con imágenes microscópicas de las matrices usando scanR imager alto contenido (Olympus) y el efecto de los genes miARN sobre-expresión en la proliferación y la apoptosis celular se consideró como se describe anteriormente [21]. En pocas palabras, después de la normalización una puntuación z (z = (χ-μ) /σ) se calculó para la puntuación de los valores actuales medidos. χ = valor de nivel de punto normalizada, μ = array global media y σ = desviación estándar (SD)
ARN y el aislamiento de los genes miARN
ARN total (& gt; 200 bases). Se aisló a partir de sedimentos celulares y muestra de tejido fresco congelado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN pequeños (& lt; 200 bases) se recuperaron de la fracción de flujo a través del uso del kit RNeasy Micro junto con las columnas RNeasy MinElute de spin (Qiagen) (descritos en el material complementario (Métodos S1)). muestras de tejido fueron aisladas directamente utilizando el RNeasy Micro Kit (Qiagen) los pequeños RNAs de la RNAlater conservan.
miARN perfiles en muestras clínicas
El perfil de expresión de los genes miARN se realizó utilizando el tallo bucle RT- v2.0 basada qPCR TaqMan microARN humano matriz de conjuntos según lo indicado por el fabricante (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) [22]. El algoritmo NormFinder se utilizó para identificar los genes de referencia adecuados [23].
miARN ARNm y RT-qPCR
Solo tubo TaqMan microARN o ensayos de ARNm (Applied Biosystems) se utilizaron para cuantificar miRNAs maduros individuales o ARNm (detalles en el material complementario (Métodos S1)). El Applied Biosystems TaqMan Ensayo de Identificación y el cebador utilizado para la detección del ARNm de referencia de genes ubiquitina C (UBC) se enumeran en la Tabla S1 S1 en el archivo.
MTT ensayo
Las células fueron sembradas en 96 Bueno, placas inversa transfectaron y se incubaron durante 72 horas con pre-MIR o siRNAs. La viabilidad celular /proliferación se midió usando 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) ensayo (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) (que se describe en el material complementario (Métodos S1)). Los Applied Biosystems pre-miR y
Silenciador
Seleccionar siRNA identificaciones y las secuencias de la YAP1 siRNAs de GenePharma (Shanghai, China) se enumeran en la Tabla S1 S2 en Archivo.
ensayo de LDH
las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se transfectaron inversa durante 48 ó 72 horas con pre-MIR o siRNAs (Tabla S1 S2 en archivo) (más detalles se encuentran en el material complementario (Métodos S1)). Posteriormente, se midió la muerte celular (LDH) utilizando el kit de detección de citotoxicidad
PLUS (LDH) (Roche Applied Science).
caspasa 3/7 ensayo de la actividad
La caspasa 3 /7 ensayo de actividad se utilizó para medir la muerte apoptótica y lleva a cabo principalmente como se describe anteriormente [24]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con Reverse-pre-miRs o siRNAs durante 48 horas (Tabla S2 en S1 File). La caspasa 3/7 inhibidor (Z-DEVD-FMK) (Biovision, San Francisco, CA, EE.UU.) se añadió 6 horas después de la transfección (concentración final 25 mM). Caspasa 3/7 actividad en lisados de células, medida por la liberación de AFC (excitación, 400 nm; emisión 489 nm) del sustrato Ac-DEVD-AFC (Biomol, Plymouth Meeting, PA, EE.UU.), se midió usando un lector de multiplaca ; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific).
Captura láser microdisección
Captura láser microdisección (LCM) se realizó en criosecciones de cáncer y normales emparejados biopsias de la mucosa del colon adyacentes (descrito en detalle en el suplementario materiales (Métodos S1)). Las células epiteliales fueron capturados en los casquillos individuales con la microdisección de instrumentos Veritas 704 (Applied Biosystems) mediante corte por láser ultravioleta de acuerdo con las instrucciones dadas por el fabricante.
Los MIR-375 niveles de metilación en líneas celulares de CRC y muestras clínicas
bisulfito de ADN modificado fue amplificada del genoma completo y se hibrida a Infinium HumanMethylation450 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) durante la noche como se describe por el fabricante. BeadChips fueron escaneados con un instrumento BeadXpress lector (iluminación) y los datos se analizaron usando el grano de metilación Estudio Módulo de software (iluminación). los niveles de metilación se proporcionan en valores beta, con un valor beta de 0 corresponde a no metilación, y 1 correspondiente a la plena metilación. Los identificadores de los sitios CpG en las proximidades de
MIR-375
fueron los siguientes CpG1; cg00215432, CPG2; cg00218620, CpG3; cg00705280, CpG4; cg02257674, CpG5; cg04348419, CpG6; cg06214770, CpG7; cg14358282, CpG8; cg21615583, CpG9; cg22306928, CpG10; cg01822124 y CpG11; cg26394220.
Chip análisis
El Chip análisis se llevó a cabo como se describe anteriormente [25]. Los cebadores utilizados para amplificar las regiones de ADN chip se enumeran en la Tabla S1 S1 en el archivo.
Identificación de potenciales miR-375 objetivos en base a perfiles de ARNm y
in silico
objetivo de predicción
el mRNA de perfiles de miR-375 células HCT116 transfectadas y las muestras clínicas se describen en el material complementario (Métodos S1). La ubicación y el número de miR-375 secuencias de semillas (es decir, complementario a la posición 2-8 de la miRNA) dentro de la secuencia de ARNm de longitud completa se mapearon utilizando datos de secuencia recuperados de TargetScan v5.2 y Ensembl 62 bases de datos [26], [27 ].
Ago2 inmunoprecipitación
células transfectadas
Scr y miR-375 (~3.5 × 10
6) se raspó de frascos de cultivo en hielo en tampón de lisis suave (Tris 20 mM pH 7,5 , NaCl 10 mM, 0,5% NP-40, EDTA 2 mM suplementado con inhibidor de RNasa RNaseOUT (Invitrogen) y completa de cóctel inhibidor de proteasa Mini (Roche)) y hypertonically lisadas mediante el aumento de la concentración de NaCl a 150 mM. Después de centrifugación a 4 ° C y 19.000 * g durante 10 minutos se recogió y se sometió a inmunoprecipitación (10% se utiliza para el control de entrada) por incubación con anticuerpo monoclonal Ago2 (11A9) (Sigma-Aldrich) -bound acoplado a la proteína-G el sobrenadante Dynabeads magnéticas (Life Technologies) (15 mg 11A9 por cada 25 ml de perlas) siguiendo las recomendaciones del fabricante. inmunoprecipitación Anti-FLAG se realizó en paralelo como control negativo (F1804 anticuerpo, Sigma). Las perlas se lavaron 5 veces en hielo frío tampón de lavado (50 mM TRIS pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,05% NP-40). El ARN total de entrada, complejos FLAG-IP-IP Ago2 y se purificó usando QIAZol (Qiagen).
software Ingenuity Pathway Analysis
Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood city, CA, EE.UU.) se utilizó para obtener una perspectiva de los cambios biológicos generales introducidas por la expresión ectópica de miR-375. ARNm de datos normalizados y filtradas se cargan en el IPA. Usando el ingenio Pathways Knowledge Base (IPKB) cada gen estaba ligado a funciones específicas, las vías y las enfermedades y un enriquecimiento de análisis se realizó examinando si los datos se enriquecen de genes asociados con una función particular. Se aplicó la prueba exacta de Fisher para evaluar la importancia de los enriquecimientos
La extracción de proteínas y Western Blot
La extracción de proteínas y Western Blot análisis se realizaron de acuerdo con los procedimientos estándar (detalles en el material complementario (Métodos S1) ).
Construcción de plásmidos para el reportero de luciferasa ensayo
fragmentos seleccionados de la 3'UTRs de INFIERNOS (NM_018063) y NOLC1 (NM_004741), que contiene supuestos sitios de unión de miR-375 se amplificó a partir de la normalidad ADN genómico humano y se clonó aguas abajo de la
Renilla
gen de la luciferasa en el vector siCHECK-2 (Promega, Fitchburg, WI, EE.UU.). construcciones seleccionadas fueron mutados en la región de unión putativo miARN utilizando QuickChange relámpago mutagénesis dirigida Kit (Agilent Technologies) de acuerdo con el protocolo proporcionado. Los detalles figuran en el material complementario (Métodos S1) y los cebadores utilizados para la mutagénesis dirigidas al sitio de clonación y se describen en la Tabla S1 S3 en Archivo.
reportero de luciferasa ensayo
Las células transfectadas HEK-293T se analizaron utilizando el Sistema Dual Glo ensayo de luciferasa (Promega) como se ha descrito anteriormente [28] (se describen los detalles en el material complementario (Métodos S1)). La luminiscencia se detectó con un lector de multiplaca; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). El
Renilla
La actividad de luciferasa se normalizó a la
Firefly
La actividad de luciferasa para cada transfectaron bien, para corregir las diferencias en la transfección y cosecha eficiencias.
Generación y caracterización de HCT116 estables inducible células con expresión de miR-375
la generación de células HCT116 estables con expresión inducible de miR-375 se describe en detalle en el material complementario (Métodos S1). Inicialmente,
MIR-375
se clonó en la región 3 'UTR del
turbo fluorescencia roja gen de la proteína gratis (tRFP) del vector pSBInducer10 (
MIR375
_pSBInducer10). El vector pSBInducer10 se construyó reemplazando elementos lentiviral vector de la pINDUCER [29] con sleepingbeauty repeticiones terminales invertidas. Estable células piscinas HCT116_miR-375 y HCT116_Scr se generaron como sigue. En primer lugar, 1,5 × 10
6 células HCT116 fueron transfectadas con pCMV-SB100XCO (vector con la transposasa) y, o bien
MIR375
_pSBInducer10 (HCT116_miR-375) o
Scr
_pSBInducer10 (HCT116_scr). Se añadió Cuarenta y ocho horas después de la transfección puromicina (concentración final 1 mg /ml) (Sigma) para seleccionar las células transfectadas de manera estable. La selección de puromicina se llevó a cabo durante 5 días. Posteriormente, las células fueron tratadas con 50 ug /ml de doxiciclina (dox) (Sigma) durante 48 horas conducen a la activación transcripcional del tRFP-
MIR375
cassette. El marcador de fluorescencia tRFP fue utilizado como un sustituto para ordenar a las poblaciones celulares que expresan el nivel más alto miR-375 después de la inducción de dox. Brevemente, las células con el nivel más alto tRFP (100-1000 veces por encima del nivel de fondo en las células no tratadas) (HCT116_miR-375H y HCT116_ScrH) se aislaron por células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando un FACSAriaIII 4-láser (BD Biosciences, San Jose, CA) y se utilizaron para todos los análisis posteriores. la expresión dependiente de Dox madura de miR-375 en las células HCT116_miR-375H se analizó mediante RT-qPCR como se ha descrito anteriormente. Las células HCT116_miR-375H se caracterizaron fenotípicamente mediante xCELLigence (Roche Applied Science), caspasa 3/7 ensayos y YAP1 Western Blot (detalles en Material complementario (Métodos S1)).
En vivo
el análisis del crecimiento tumoral
células
HCT116_miR-375H (3,5 × 10
6 células por inyección) se suspendieron en 200 l de PBS y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo de ratones anestesiados (n = 12). Los ratones se dividieron en dos grupos de 6 animales en cada grupo: A; miR-375 (+ DOX) y el Grupo B; control (- dox). Se midieron los tumores regularmente (longitud y anchura) por el mismo observador. Para inducir la expresión de miR-375, se añadió dox (Vibradox Sandoz) (0,2 mg /ml) al agua de bebida de los ratones en el grupo A, cuando los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 50 mm
3. Los ratones del grupo B se les dio agua potable ordinaria. El tratamiento dox se llevó a cabo durante 14 días. Cuatro ratones fueron sacados del estudio antes del tratamiento de dox (dos tenían muy tumores de crecimiento rápido y dos tenían tumores que dejó de crecer) es decir, n = 4 en el Grupo A y B. El volumen del tumor estimado (EV) se calculó como EV = longitud x (anchura)
2 × 1/2. EV se representó frente al número de días después del inicio del tratamiento DOX y el crecimiento de xenoinjertos se generaron curvas.
El análisis estadístico
La importancia de los cambios de expresión de los genes miARN se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney U en el Experimento Viewer (MeV) de software analizador de matriz multi [30]. La agrupación jerárquica de miRNAs expresados diferencialmente se realizó a través de Gene Cluster 3,0 [31]. Sólo se incluyeron miRNAs que se expresaron en más de 80% de las muestras. mapas de calor se han generado con Java TreeView [32]. de Student para datos independientes
t-test
se aplicó para comparar los cambios inducidos miARN con los controles respectivos en el ensayo MTT, LDH ensayo, ensayo de apoptosis, análisis de RT-qPCR y
in vivo
análisis de crecimiento tumoral en. Se utilizó la prueba t pareada de Student para el análisis RT-qPCR de muestras de tejido microdissected. Un
p-valor
& lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
La selección de alto rendimiento identifica una serie de miRNAs que induce la apoptosis y /o inhibe la proliferación celular en el CRC. líneas
Para identificar miRNAs con el impacto más consistente en el crecimiento y /o supervivencia de las células del cáncer de CRC se realizó un cribado de alto rendimiento en seis líneas celulares de CRC, utilizando una celebración de la biblioteca sintética 319 pre-miRNAs humanos. Se utilizaron los cambios pre-MIR inducidos en CPARP y Ki-67 para identificar miRNAs que inducen la apoptosis y /o inhibir la proliferación respectivamente. Las distribuciones de las puntuaciones z para cada pre-MIR se muestran en la Figura S1. Los productos de rango de puntuación z se utilizaron para identificar la consistencia de los efectos pre-miARN en todas las líneas celulares ensayadas CRC [33]. El producto ranking Top-40 pre-MIR se enumeran en la Tabla S2 S4 en Archivo (aumento CPARP) y la Tabla S5 en Archivo S2 (reduce Ki-67). Varios de los Top-40 clasificó miRNAs han sido previamente demostrado que afectan ya sea la apoptosis y /o la proliferación
in vitro gratis (un subconjunto de éstos se muestran en la Tabla S1 S6 en archivos).
miARN de perfiles de expresión de muestras clínicas
Para hacer frente a la
in vivo s
ignificance de los miRNAs identificados en el cribado funcional de alto rendimiento perfilamos la expresión de 667 miRNAs únicos en 14 mucosa del colon normal y tejido Las muestras procedentes de 46 en estadio II CRC muestras clínicas. En total, 53 miRNAs se expresan diferencialmente entre la mucosa normal y (p≤0.01 prueba de Mann-Whitney U y 1.5≤FC
(log2) ≤-1,5) CRC (Figura 1 y Tabla 2). Un subconjunto de 25 miRNAs mostró una mayor expresión en los tumores de CRC en relación con la mucosa normal, mientras que 28 miARN se redujeron reguladas en los tumores de CRC. Combinando los resultados de la elaboración de perfiles de miARN de muestras clínicas con los resultados de la selección funcional de alto rendimiento se identificaron 10 miRNAs que son expresados diferencialmente en muestras de CRC clínicos y al mismo tiempo inducida por los cambios fenotípicos en el cribado funcional (Top-40 clasificado) (Tabla 2 y la Tabla S6 en archivo S1). miRNAs Además, regulados por la disfunción ocho indujeron cambios fenotípicos en por lo menos una línea celular, pero no eran Top-40 clasificado (Tabla 2). Once de los miRNAs anteriores se ha reducido regulado y por lo tanto estos miRNAs son candidatos supresores de tumores. Por último, 20 de los miRNAs regulados por la disfunción no fueron incluidos en el pre-miARN biblioteca de Ambion y por lo tanto su capacidad de inducir cambios fenotípicos no pueden ser analizados en el presente estudio (Tabla 2). En conclusión, se identificaron 11 miRNAs que se redujeron reguladas en muestras de CRC y al mismo tiempo la proliferación inducida y /o inhiben la apoptosis en líneas celulares de CRC y por lo tanto estos miRNAs están potencialmente implicadas en la tumorigénesis colorrectal.
La agrupación jerárquica de miRNAs con una expresión diferente significativa entre los adenocarcinomas colorrectales normales y muestras de mucosa de colon (p≤0.01). Las filas representan miRNAs individuales y las columnas representan muestras de tejido individuales. La escala representa la intensidad de la expresión génica (escala de log2 que oscila entre -2,98 y 2,98) (los valores de p y FCs se encuentran en la Tabla 2). El miRNAs marcados con azul se encontraron para inhibir la proliferación y /o inducir la apoptosis en la pantalla de alto rendimiento (Top-40 clasificó miRNAs).
Validación de los fenotipos identificados en el alto pantalla de rendimiento
Para validar los fenotipos identificados, los miRNAs que se redujeron reguladas en muestras clínicas y Top-40 clasificados en la pantalla fenotipo (miR-150, miR-375, miR23b, miR-138, miR 139-5p y miR-9) fueron sometidos a análisis funcional detallado mediante HCT116, HT29, LS174T TR4, TR7 DLD1 y líneas celulares de cáncer de colon SW480. Recientemente hemos publicado un análisis funcional detallado de miR-139-5p y por lo tanto el miR-139-5p no se incluyó en estos análisis [25]. La expresión ectópica de miR-375, miR-9 y miR-138 redujo significativamente la viabilidad de más de una línea celular (reducción de MTT & gt; 20% y p = 0.05) (Figura 2A (HCT116) y la Figura S2), posible debido para una función general de anti-proliferativa o pro-apoptótica de estos miRNAs. miR-150 y miR-23b sólo redujeron la viabilidad de una línea celular (DLD1 TR7). Entre los miRNAs restantes, miR-375 fue identificado como un inductor de la apoptosis miRNAs en la pantalla de alto rendimiento. Para validar este hallazgo, se llevó a cabo la LDH y la caspasa 3/7 ensayos en líneas celulares transfectadas CRC. MiR-375 aumentó la caspasa 3/7 actividad y demostró aumento coincidente en la muerte celular (liberación de LDH) en tanto HCT116 y DLD1 TR7 (Figuras 2B y C, y la Figura S3). Por otra parte, la muerte apoptótica inducida por miR-375 podría ser inhibida con z-DEVD-fmk (caspasa inhibidor 3/7) (Figura 2D) que demuestra que la apoptosis inducida depende de la caspasa 3/7 actividad. En conclusión, el análisis de validación confirmó el papel antiproliferativo de miR-9 y miR-138, y la inducción de la apoptosis capacidad de miR-375 como se identifica en el análisis de alto rendimiento. El miRNAs anteriores han sido previamente demostrado ser dis-regulados en los cánceres humanos y para reducir la proliferación y /o inducir la apoptosis
in vitro gratis (Tabla S6 en Archivo S1). miR-375 y miR-138 no se han caracterizado funcionalmente en detalle en el CRC. Por último, el miR-375, miR-138 y miR-9 fueron seleccionados para su posterior análisis debido a su baja regulación en muestras clínicas y su capacidad para inducida por cambios fenotípicos
in vitro
.
( A) La viabilidad celular (ensayo MTT): Los datos se presentan como ± SD. de al menos 3 experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones biológica y normalizado a SCR. * Valor de p & lt; 0,05 y MTT reducción & gt; 20%. (B) la muerte celular (ensayo de liberación de LDH): La muerte celular se expresó como porcentaje de la LDH liberada de LDH celular total. Al menos dos experimentos independientes se realizaron y realizaron por triplicado. El resultado de uno experimentos representativos ± sd. se muestra. * Valor de p & lt; 0,05. (C) La inducción de la apoptosis (caspasa 3/7 actividad): la actividad de la caspasa 3/7 en el lisado de las células pre-miARN transfectadas se examinó mediante análisis fluorométrico cinética y expresa en relación con la actividad de la caspasa 3/7 en "Scr" transfectada Células. Los datos se presentan como ± SD. de al menos 2 experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones biológicos. * Valor de p & lt; 0,05. (D) La inhibición de miR-375 de la apoptosis inducida por la caspasa 3/7 inhibidor Z-DEVD-FMK. La actividad de la caspasa 3/7 se midió como se describe en (C). Se añadió Z-DEVD-fmk (DEVD) (25 mM) a las células seis horas después de la transfección. Las células no tratadas (NT), sólo se Lipofectamina (Lipo) y pre-miARN miR-Moléculas precursoras de control negativo#1 (SCR) se incluyeron como controles negativos en todos los ensayos. Los-miR-145 pre células transfectadas se incluyeron como un control positivo para la realización del ensayo MTT. (E) La baja regulación de miR-375 es un resultado de la reducción de expresión en las células epiteliales del tumor. La expresión de miR-375 en la captura por láser microdissected tejido de cáncer colorrectal. La expresión se analizó en las células epiteliales y estromales de adenocarcinomas colorrectales emparejados (n = 3) y adyacente normal (n = 3) biopsias mucosa del colon LCM utilizando RT-qPCR. Las columnas representan la media de expresión en tres muestras ± SD.
Detección de miR-375, miR-138 y miR-9 en láser microdissected tejido colorrectal
Para dilucidar el origen celular de miR-375, miR-138 y miR-9, que mide su expresión en láser capturado adenocarcinomas colorrectales microdisecado y la mucosa del colon normal adyacente (Figura 2E y figura S4). Estos análisis mostraron que en mucosa normal del colon miR-375 se expresó en un nivel superior en las células epiteliales que en las células del estroma (p = 0,02) (Figura 2E). Mientras que en el adenocarcinoma de miR-375 se expresó en niveles comparables en las células epiteliales y del estroma (p = 0,27). Además, miR-375 expresión en las células epiteliales normales fue significativamente mayor que la expresión en las células epiteliales de adenocarcinoma (p = 0,03). En general, estos resultados indican que la regulación a la baja de miR-375 en CRC es el resultado de una reducción en la expresión de miR-375 en las células epiteliales del tumor. miR-9 y miR-138 se expresan principalmente por las células del estroma, tanto de la mucosa del colon normal y adenocarcinomas (Figura S4). Estos resultados son consistentes con los perfiles de expresión previamente publicados miRNA de láser microdissected normales de la mucosa, adenomas y adenocarcinomas [34]. *
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