Extracto
Antecedentes
Se ha considerado que los métodos de detección de células tumorales circulantes (CTC) en base a epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) subestiman el número de CTC y pueden perder una subpoblación metastásico con propiedades de células madre del cáncer (CSC). Por lo tanto, se investigó EpCAM positivos y negativos al CTC en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) pacientes en diferentes etapas, evaluaron el valor clínico de estos CTC y exploraron su capacidad en el siguiente modelo CSC.
Métodos
CTC se enriquecieron por el agotamiento de leucocitos con bi-anticuerpos usando una técnica de separación con perlas magnéticas y, a continuación identifican por la expresión de EpCAM y citoqueratina 7 y 8 usando multi-parámetro citometría de flujo. Se determinó la distribución de CTC clasificadas por la expresión de EpCAM en 46 pacientes con CPNM en estadios I a IV, evaluó el valor diagnóstico de estos CTC mediante la monitorización longitudinal en 4 pacientes índice durante la terapia adyuvante y caracteriza la troncalidad de estos CTC por la expresión de CXCR4 y CD133 en 10 pacientes.
resultados
EpCAM-negativo (E-) CTC se detectaron a ser significativamente mayor que (e +) CTC EpCAM positivos en estadio IV (
p
= 0,003). Los pacientes con el porcentaje de E-CTC más del 95% (
r Hotel & gt; 95%) se detectó que aumentarse significativamente de 13,3% en estadio I-II de 61,1% en estadio IV (
p = 0,006
). El análisis de Kaplan-Meier indicó que los pacientes con
r Hotel & gt; 95% tenían significativamente más corto tiempo de supervivencia que aquellos con
r
≤ 0,95 (
p = 0,041
). el seguimiento longitudinal de los CTC indicó que los pacientes con un alto porcentaje de E-CTC en la sangre no eran sensibles a la quimioterapia o la terapia dirigida. Además de la caracterización de los CTC reveló que una subpoblación de tallo como de los CTC CXCR4 + CD133 + se detectaron a ser significativamente más frecuente en E-CTC que la de E + CTC (
p
= 0,005).
Conclusiones
el enriquecimiento de CTC por el agotamiento de leucocitos con bi-anticuerpos es un método valioso para estimar el número de CTC, que puede aplicarse potencialmente en la predicción del pronóstico, seguimiento del efecto terapéutico de pacientes con NSCLC y analizar más a fondo la biología de las CTC
Visto:. Yin J, Wang Y, Yin H, W Chen, Jin G, Ma H, et al. (2015) células tumorales circulantes enriquecidos por el agotamiento de leucocitos con Bi-anticuerpos en células no pequeñas de cáncer de pulmón: posible aplicación clínica. PLoS ONE 10 (8): e0137076. doi: 10.1371 /journal.pone.0137076
Editor: Huei-Wen Chen, Instituto de Toxicología, TAIWAN
Recibido: 24 Enero, 2015; Aceptado: August 12, 2015; Publicado: 28 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Yin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo es apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Jiangsu (BK20141435); La introducción de la Fundación Talento (2011RC11); La ciencia médica y la Fundación de Desarrollo de Tecnología, Departamento de Salud de Nanjing (YKK13088); La clave del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81230067); Programa Nacional de Investigación Clave Beca Básica (2013CB911400)
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
pulmón es la causa principal de cáncer. -relacionado la muerte [1], y aproximadamente el 85% de los casos de cáncer de pulmón son el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Aunque el tratamiento sistemático se ha mejorado, la tasa de supervivencia global a los 5 años es sólo del 10-20% [2]. La razón principal de la baja tasa de supervivencia es de metástasis a distancia de las células tumorales. En la cascada metastásica, se han considerado las células tumorales circulantes (CTC) a ser participantes clave en la formación de metástasis distantes [3]. Un estudio previo mostró que los CTC que expresan la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) son detectables en los pacientes con CPCNP en estadio IV y son un factor pronóstico novedoso para esta enfermedad [4]. Sin embargo, se ha sugerido que los métodos basados en la expresión de EpCAM subestiman el número de CTC y pueden perder una subpoblación metastásico de CTC con células madre de cáncer de propiedades (CSC) [5, 6]. Un estudio reciente informó que las CTC se detectan 2 veces más eficazmente por ISET (aislamiento por el tamaño de las células tumorales epiteliales) que las de CellSearch, y que una subpoblación de CTC, que no expresan EpCAM (es decir, E-CTC), puede ser detectado en la sangre de pacientes de NSCLC [7]. Otro estudio también ha demostrado que la enumeración de estas células es mucho más alta que la de las CTC capturado por CellSearch [8]. Hasta ahora, el valor clínico y la biología de estos e-CTC ha sido poco clara, y una publicación reciente ha indicado que los estudios futuros deben incluir la detección de E-CTC [9].
CTC en proceso de transición epitelio-mesenquimal (EMT) han sido considerados para jugar un papel importante en la formación de neoplasias [5]. EMT puede generar células con propiedades de células madre [10]. Durante la EMT, será el regulado la expresión de EpCAM en células tumorales. Un estudio anterior informó de que el eje SDF-1 /CXCR4 juega un papel importante en la mediación de la migración celular y la supervivencia después de un EMT inducida por TGF-β [11]. Sin embargo, no queda claro si estos (o ninguna) CTC con EpCAM las reguladas tienen un mayor potencial metastásico siembra resistencia o mayor a la terapia sistémica, y, como se indicó recientemente, un mayor valor pronóstico [12]. Nuestro estudio anterior reveló que se detectaron CTC CXCR4 expresan en la sangre de pacientes con tumores sólidos [13]. Un estudio reciente informó que la sobre regulación de CXCR4 es funcionalmente crucial para el mantenimiento de la stemness en células de NSCLC resistentes a fármacos [14]. Por lo tanto, es necesario caracterizar la troncalidad de E-CTC.
CTC son raros en la sangre de pacientes con tumor, y los estudios sobre la biología de las CTC se ven limitados por la baja concentración y el rendimiento de los CTC [9] . Aunque estudios previos han mostrado que la técnica ISET es más eficaz en la captura de E-CTC en NSCLC [7, 8], un estudio reciente informó que de pulmón los tumores crecen más rápido y arrojan un número significativo de células metastásicas letales en los tamaños pequeños [15]. Por lo tanto, un método de aislamiento "imparcial" de los CTC es deseable. Hemos establecido previamente un enriquecimiento negativo de CTC [16], que se basa en el agotamiento de leucocitos utilizando una técnica de separación con perlas magnéticas y posterior detección de múltiples parámetros de citometría de flujo. En el presente estudio, hemos mejorado esta técnica por el agotamiento de leucocitos con bi-anticuerpos para mejorar la pureza de los CTC para su caracterización y aplicación futura en el análisis molecular. Mediante este método, se determinó la distribución de CTC clasificadas por la expresión de EpCAM en 46 pacientes con CPNM etapas del I al IV, investigó su valor diagnóstico en terapia sistemática mediante la monitorización longitudinal de estos CTC en 4 pacientes índice, evaluó el valor pronóstico de estos CTC y caracterizan la troncalidad de estos CTC mediante la medición de la expresión de CXCR4 y CD133.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y voluntarios sanos antes de participar en el estudio. recogida y análisis muestra de sangre fueron aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad de Medicina de Nanjing. El diseño y la realización de este estudio en seres humanos fueron descritos claramente en un protocolo de investigación.
Población de estudio y preparación de las muestras de sangre
muestras de sangre periférica de 46 pacientes con CPNM fueron recogidos de enero a de noviembre en 2013 en el hospital de Nanjing en el pecho y cáncer de Jiangsu hospital. características de los pacientes se enumeran en la Tabla 1. Se extrajo sangre después de descartar la primera 2 ml para evitar la contaminación potencial de la célula de la piel de la punción venosa, y luego se procesa dentro de las 4 horas después de la recogida. Las muestras de sangre de pacientes índice 4, también se recogieron al final de cada período de la quimioterapia o la terapia dirigida de inmediato, y se evaluaron los efectos terapéuticos de los pacientes de acuerdo con los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos.
CTC enriquecimiento
Las soluciones de células de las muestras de sangre se prepararon como se describe anteriormente [16]. CTC se enriquecen entonces por el agotamiento de leucocitos con bi-anticuerpos de acuerdo con los siguientes pasos: primero, basado en el antígeno leucocitario común CD45, CD45 Kit completo con sangre humana agotamiento (EasySep, las células madre Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canadá) se usó como el primer paso para el agotamiento de leucocitos; segundo, basado en el antígeno de superficie de leucocitos CD53, las células se tiñeron por ratón PE anticuerpo CD53 anti-humano (BD Bioscience, EE.UU.), se lavaron con PBS y después se agotan más con el Kit de PE selección positiva (EasySep, las células madre Technologies, Inc., Vancouver , BC, Canadá) como el segundo paso para los leucocitos. El procedimiento se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante con modificaciones menores.
La citometría de flujo
Después del enriquecimiento, CTC fueron divididos en 2 tubos y se tiñeron con anticuerpos anti-EpCAM, anti-CK7 /8 , anti-CD45 (BD Bioscience, EE.UU.) en el primer tubo y los correspondientes anticuerpos de control de isotipo en el segundo tubo. Para explorar la biología de las CTC en stemness, las células enriquecidas fueron juntos tiñeron con anticuerpo anti-CXCR4 (BD Bioscience, EE.UU.) y anti-CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) (en el primer tubo) y los anticuerpos de control correspondiente isotipo ( en el segundo tubo) en 10 muestras. La concentración final de cada anticuerpo fue 10μg /mL. Se realizó un sistema de FACS AriaIII (BD Biosciences) para determinar la expresión de todos los marcadores, y los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo 7.2.5 (Árbol Star, Ashland, Oregón, EE.UU.). Las células con la expresión de los marcadores anteriores fueron cerrada por el control de isotipo correspondiente basada en la división clara entre ellos. CTC se definieron como células citoqueratina + CD45-CD53-.
El clavar experimento
La línea celular de cáncer de pulmón humano PC9 (alta expresión de EpCAM y citoqueratina) fue aportado por el Centro de Cáncer de Medicina de Nanjing Universidad y se cultivan en glucosa alta medio DMEM que contiene 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, penicilina 100 U /ml y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. células PC9 se recogieron de acuerdo con el mismo procedimiento como se describe anteriormente [16]. Cero, 10, 50, 100 y 500 células PC9 se enriquecieron en 2 ml de sangre de voluntarios sanos. células PC9 fueron entonces enriquecidos de acuerdo con el método descrito anteriormente. Después del enriquecimiento, CTC fueron divididos en 2 tubos y se tiñeron con anticuerpos anti-EpCAM, anti-CK7 /8, anti-CD45 y los anticuerpos de control de isotipo correspondientes. En el análisis de citometría de flujo, el porcentaje de CTC en todo permaneció células (incluyendo leucocitos y CTC) después del enriquecimiento se define como la pureza de los CTC. La recuperación y la pureza se calcularon para evaluar el rendimiento del método, que se determinaron como sigue: Recuperación = n
1 /n
2 × 100%, pureza = n
1 /(n
1 + n
3) × 100% (n
1 fue el número de células PC9 encontrados después de su enriquecimiento; n
2 fue el número de células PC9 añadidos en 2 ml de sangre; n
3 fue el número de leucocitos encontrado después de enriquecimiento). El experimento un rápido aumento en cada condición se repitió tres veces