Extracto
Antecedentes
El
ARID1A
gen codifica adenina-timina (AT) ricos 1A dominio que contienen proteínas interactiva, que participa en la remodelación de la cromatina.
ARID1A
se ha mostrado para funcionar como un supresor de tumores en diversos tipos de cáncer. En el presente estudio, se investigó el valor de la expresión y el pronóstico de
ARID1A
en el cáncer gástrico primario. Mientras tanto, el papel biológico de
ARID1A
se investigó adicionalmente usando el modelo celular in vitro.
Metodología /Principales conclusiones
Para investigar el papel de
ARID1A
genes en la patogénesis del cáncer gástrico primario, PCR en tiempo real cuantitativa y Western Blot se utilizaron para examinar la
ARID1A
expresión en tejidos cancerosos y no cancerosos pareadas. Los resultados revelaron una disminución
ARID1A
ARNm (
P = 0,0029
) y proteínas (
P = 0,0015
) expresión en la mayoría de los tejidos portadores de tumores en comparación con el no tumoral adyacente emparejado tejidos, y en líneas celulares de cáncer gástrico. Para investigar más a fondo el papel clínico-patológicas y pronósticas de
ARID1A
expresión, se realizó un análisis inmunohistoquímico de los 224 bloques de tejido de cáncer gástrico incluidos en parafina. Los datos revelaron que la pérdida de
ARID1A
expresión se correlacionó significativamente con el estadio T (
P
= 0,001) y grado (
P
= 0,006). De acuerdo con estos resultados, se encontró que la pérdida de
ARID1A
expresión se correlacionó significativamente con una mala supervivencia en pacientes con cáncer gástrico (
P
= 0,003). Los análisis de regresión de Cox mostró que
ARID1A
expresión fue un predictor independiente de la supervivencia global (
P = 0,029
). Además, las funciones de
ARID1A
en la formación y la proliferación de colonias de líneas de células gástricas se analizaron mediante la transfección de las células con de longitud completa
ARID1A
vector de expresión o siRNA dirigidos
ARID1A
. La restauración de
ARID1A
expresión en células de cáncer gástrico, inhibió la proliferación celular y la formación de colonias. Silenciando
ARID1A
expresión en la línea celular epitelial gástrica mejora de forma significativa la tasa de crecimiento celular.
Conclusiones /Importancia
Nuestros datos sugieren que
ARID1A
pueden desempeñar un importante papel en el cáncer gástrico y puede servir como un valioso marcador pronóstico y objetivo potencial para la terapia génica en el tratamiento del cáncer gástrico
Visto:. Wang Dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen Sp, Chen Jg , et al. (2012) disminución de la expresión de la
ARID1A
gen se asocia a peor pronóstico en el cáncer gástrico primario. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10.1371 /journal.pone.0040364
Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur
Recibido: 19 Enero, 2012; Aceptado: 6 Junio 2012; Publicado: 13 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Dandan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30973398) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (925100890). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en todo el mundo y la segunda causa más común de muerte por cáncer cada año (el 10,4% de las muertes por cáncer) [1]. El tratamiento del cáncer gástrico incluye una combinación de cirugía, quimioterapia, o radioterapia. Sin embargo, casi el 60% de los pacientes afectados sucumben al cáncer gástrico, incluso después de una resección curativa sola o después de la terapia adyuvante [2]. Desde hace tiempo se sabe que los resultados de cáncer gástrico de una combinación de factores ambientales y la acumulación de alteraciones genéticas generalizadas y específicas. Muchas de las alteraciones genéticas o epigenéticas asociadas con el cáncer gástrico, incluyendo la pérdida de heterocigosidad, microsatélites y la inestabilidad cromosómica y la hipermetilación, se han comunicado [3]. La comprensión de estas alteraciones y los mecanismos moleculares implicados en la carcinogénesis gástrica será fundamental para la mejora del diagnóstico, la terapia y la predicción del pronóstico de esta enfermedad
.
El complejo remodelador de la cromatina SWI /SNF eucarióticamente conservada desempeña un papel esencial en una variedad de procesos celulares, incluyendo la diferenciación, la proliferación y la reparación del ADN [4]. La pérdida de subunidades SWI /SNF se ha informado en la mayoría de los tumores, y un gran número de observaciones experimentales sugieren que este complejo es crítica para la supresión de tumores [5]. Los complejos contienen siete o más subunidades no catalíticas que presumiblemente ayudan a modular la orientación y la actividad de la ATPasa [6]. Una subunidad de este complejo, hSNF5 /Ini1 /BAF47, ha sido identificado como un supresor de tumores [7], [8]. La otra subunidad no catalítica, p270 /ARID1A /BAF250a (adenina-timina rica en AT interactivo 1A dominio que contienen proteínas), se ha demostrado ser esencial para la detención del ciclo celular normal [9]. Desmontables de
ARID1A
en una línea celular de leucemia confiere resistencia a la apoptosis mediada por Fas [10]
.
Recientemente,
ARID1A
mutaciones y la pérdida de proteínas BAF250a se han encontrado para correlaciona fuertemente con el carcinoma ovárico de células claras y bajo grado carcinoma endometrioide uterina [11] - [13]. Estas observaciones indican que
ARID1A
es un gen supresor de tumores potencial candidato. Sin embargo, la importancia clínica de tal expresión diferencial y la función de la proteína ARID1A permanecen sin definir debido a la falta de estudios que utilizan muestras de tumores humanos frescos. En el presente estudio, hemos analizado la
ARID1A
nivel de expresión en el cáncer gástrico utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR, Western Blot e inmunohistoquímica. Mientras tanto, hemos identificado la relación entre el
ARID1A
expresión y características clinicopatológicas y evaluamos su valor pronóstico en la supervivencia después de la resección de los pacientes con cáncer gástrico. Además, se evaluó el papel funcional de los
ARID1A
en el proceso tumoral en el cáncer gástrico primario mediante el examen de la formación y la proliferación de colonias in vitro en líneas de células gástricas.
Resultados
ARID1A
Expresión de ARNm analizada por cuantitativa en tiempo real RT-PCR
El nivel de ARNm de
ARID1A
se determinó mediante ensayos de RT-PCR cuantitativa en tiempo real en 66 emparejados cancerosos y los emparejados tejidos adyacentes normales de la mucosa gástrica. El
ARID1A
nivel de expresión fue significativamente menor en 43 (65.15%) tejidos portadores de tumores en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes (
P = 0,0029
, Figura 1).
La expresión de mRNA relativa de
ARID1A
se redujo significativamente en los tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos adyacentes nontumorous emparejados (n = 66,
P = 0,0029
). Las líneas horizontales representan la media.
Proteína ARID1A Expresión analizada por Western Blot
Western Blot se realizó en 25 muestras de cáncer gástrico y la correspondiente tejidos de la mucosa gástrica no cancerosas adyacentes desde el 66 emparejado muestras. Los resultados mostraron una banda ARID1A en el tamaño esperado de 242 kDa y la cantidad de proteína presente ARID1A se midió adicionalmente por densitometría. En consonancia con el tiempo real de los resultados cuantitativos de la PCR, una disminución en la expresión ARID1A se observó en 13 (52%) de los tejidos tumorales en comparación con tejidos gástricos no tumorales adyacentes emparejados (
P
= 0,0015, Figura 2A y Figura 2B). Del mismo modo, la expresión de la proteína ARID1A se redujo notablemente en líneas celulares de cáncer gástrico, SGC7901, AGS, especialmente en MGC803, en comparación con la línea celular gástrica normal GES1 (Figura 2C).
(A) con respecto proteínas ARID1A niveles de expresión en tejidos de cáncer gástrico y los tejidos no cancerosos (ARID1A /GAPDH, n = 25,
P = 0,0015)
. Las líneas horizontales representan la media. (B) Representante resultado de la expresión de proteínas en ARID1A 4 emparejado (C, tejidos de cáncer gástrico; N, igualó la mucosa gástrica no canceroso) gástricos tumorales y los tejidos adyacentes nontumorous emparejados. (C) El nivel de proteína ARID1A se redujo notablemente en líneas celulares de cáncer gástrico, SGC7901, AGS, especialmente en MGC803, en comparación con la línea celular gástrica normal GES1.
Análisis inmunohistoquímico de la expresión en el tejido ARID1A cáncer gástrico las muestras y su relación con los parámetros clínico
inmunohistoquímica
Para investigar más a fondo el papel clínico-patológicos y pronóstico de la expresión ARID1A, se realizó un análisis de los 224 bloques de tejido de cáncer gástrico incluidos en parafina. En general, 115 de 224 (51,3%) casos mostraron expresión ARID1A negativa en los tejidos cancerosos (Figura 3B), mientras que 109 (48,7%) casos mostraron inmunotinción positiva (Figura 3C & amp; D). mucosa gástrica normal mostró el más fuerte ARID1A tinción positiva (Figura 3A). Las correlaciones entre la expresión de ARID1A y varios parámetros clinicopathological se enumeran en la Tabla 1. Los datos mostraron que la pérdida de expresión ARID1A se correlacionó significativamente con la profundidad de la infiltración de tumor (T etapa,
P
= 0,001) y tumor grado (
P
= 0,006), pero no con la edad, el sexo, el tamaño del tumor, metástasis a distancia (fase M), y el locus del tumor o metástasis a los ganglios linfáticos locales (estadio N).
( a) tinción ARID1A fuerte se observó en la mucosa gástrica no canceroso. (B) adenocarcinoma gástrico ARID1A-negativas, Grado 3. (C) tinción ARID1A débil en el adenocarcinoma gástrico, Grado 2. (D) tinción ARID1A fuerte en el adenocarcinoma gástrico, Grado 1.
expresión de los resultados clínicos y ARID1A
Las tasas de supervivencia global a los 5 años en pacientes con expresión ARID1A positivo y negativo fueron 68,8% y 52,2%, respectivamente. La supervivencia global de los pacientes con expresión ARID1A negativo fue significativamente peor que la de los pacientes ARID1A-positivo (
P = 0,003
, log-rank test, Figura 4). Los análisis de regresión de Cox univariante mostraron que la profundidad de la infiltración tumoral, metástasis a los ganglios linfáticos locales, metástasis a distancia, el tamaño del tumor y la expresión ARID1A se asociaron significativamente con la supervivencia global (Tabla 2). Por otra parte, un análisis de regresión de Cox confirmó la profundidad de la infiltración tumoral, metástasis a los ganglios linfáticos locales, metástasis a distancia y la expresión ARID1A como predictores independientes de la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico (Tabla 2).
La tasa de supervivencia de los pacientes en el grupo de ARID1A negativo fue significativamente menor que la de los pacientes en el grupo de ARID1A positivos (log-rank test,
P
= 0,003).
el papel de
ARID1A
en la proliferación celular y la formación de colonias en MGC803 y GES1 Líneas celulares
Para evaluar los efectos de
ARID1A
sobre la proliferación celular, la
ARID1A
vector de expresión y el vector de control se transfectaron células respectivamente en MGC803.
ARID1A
expresión en las células transfectadas fueron detectados por Western Blot (Figura 5A). El ensayo de crecimiento celular reveló que la tasa de crecimiento de las células en el
ARID1A
transfectadas células de cáncer gástrico fueron significativamente menores que las células de control transfectadas con el vector de cáncer gástrico (Figura 5C). Mientras tanto, la eficiencia de formación de colonias fue significativamente (
P
= 0,0379) inhibió en
ARID1A
transfectadas células de cáncer gástrico en comparación con células de control transfectadas con el vector de cáncer gástrico (Figura 5D). Para confirmar aún más la función de supresión de la proliferación de
ARID1A
, que silenció a los
ARID1A
expresión en la línea celular GES1 con siRNA. El
ARID1A
expresión en células transfectadas fueron detectados por Western Blot (Figura 5B). Se encontró que el silenciamiento de la expresión de
ARID1A Hoteles en GES1 proliferación celular mejorado significativamente en comparación con el tratamiento siRNA simulada (Figura 5E).
(A) Análisis Western Blot de restaurar
ARID1A
expresión en MGC803 células. (B) Análisis de transferencia de Western silenciada
ARID1A
expresión en células GES1. (C) Ensayo de proliferación celular que muestra el efecto supresor de la restauración de
ARID1A
expresión sobre la proliferación in vitro de la línea celular MGC803. (D)
ARID1A
inhibe la formación de colonias de células MGC803. Las imágenes se muestran a la izquierda ya la derecha, los análisis cuantitativos de los números de placa se muestran como media ± desviación estándar. (E) Ensayo de proliferación celular que muestra la tasa de proliferación significativamente mejorada de
células ARID1A
-silenced GES1 en comparación con las células siRNA tratamiento GES1 simuladas. *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el simulacro de control; **,
P
. & Lt; 0,01 en comparación con el simulacro de control de
Discusión
A pesar de los grandes avances en el diagnóstico y la terapia, el cáncer gástrico sigue siendo uno de los tumores más letales, con un pronóstico sombrío después de la gastrectomía radical [14], [15]. El resultado clínico de cáncer gástrico se determina por una serie de características del tumor, tales como el crecimiento locorregional tumor y la invasión, el grado de diferenciación, angiogénesis, metástasis a distancia y la progresión del ciclo celular, que son regulados por una variedad de genes relacionados, incluyendo oncogenes y supresores de tumor genes. Por lo tanto, la identificación de biomarcadores específicos de cáncer gástrico involucradas en estos procedimientos es muy importante para el diagnóstico, la terapia y la predicción del pronóstico en la clínica.
ARID1A
, un gen supresor de tumor recién identificado que codifica un miembro del complejo SWI /SNF, tiene una frecuencia de mutación de alta en el cáncer de vejiga, carcinoma endometrioide uterino, de ovario endometrioide y el carcinoma de células claras [11] - [13], [16], [17]. En carcinoma de células claras de ovario, se informa de que
ARID1A
mutación se asocia significativamente con ARID1A inmunoreactividad [18]. Recientemente, estudios de secuenciación del exoma reveló que
ARID1A
también es frecuentemente mutado en el cáncer gástrico [19], [23]. Sin embargo, hasta ahora la expresión, significación clínica y funciones biológicas de
ARID1A
en el cáncer gástrico no se han explorado. Por lo tanto, se evaluó la expresión de
ARID1A
en el cáncer gástrico mediante PCR en tiempo real, el Western Blot e inmunohistoquímica, además de su significado clínico-patológico y pronóstico en una muestra grande humano. Por otra parte, el uso en el modelo celular in vitro, también se investigó la función supresora de tumores de
ARID1A
en las células gástricas en detalle.
En el presente estudio, hemos demostrado que
ARID1A
se expresó en tanto menor nivel de ARNm y proteínas en los tejidos de cáncer gástrico que corresponde mucosa no canceroso. De acuerdo con estos hallazgos de biología molecular, inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-ARID1A mostró que
ARID1A
enmudeció por completo en 115 de 224 muestras de pacientes con cáncer gástrico, con expresión positiva en otros 109 pacientes. Nuestra observación está de acuerdo con una serie de estudios revelador que
ARID1A
expresión es frecuentemente perdido o reducido en un número de tejidos cancerosos y líneas celulares, como el cáncer de mama, el carcinoma endometrioide uterino, de células claras de ovario y carcinoma endometrioide [13,18,20, y 21].
Hasta la fecha, las causas de
ARID1A
silenciamiento no han sido completamente aclarada. Los estudios existentes se centran en las mutaciones en
ARID1A
, sobre todo en los cánceres ginecológicos. Se ha informado de que una mutación sin sentido o indel de
ARID1A
se correlacionó con la pérdida o reducción de la expresión de la proteína en el carcinoma endometrioide uterino, carcinoma endometrioide del ovario y carcinoma de células claras [11] - [13], [18]. En una investigación genómica integrada, Mamo
et al
. sólo se encuentra una mutación truncada de
ARID1A Hoteles en la línea celular de cáncer de mama T47D, sin ningún tipo de mutación en las muestras de cáncer de mama 11 que mostraron la pérdida de número de copias de ADN en el locus 1p36.11 adyacente a
ARID1A
[22]. Ocho de nueve muestras con la pérdida del número de copias de ADN en 1p36.11 también tienen una baja expresión de proteínas ARID1A, lo que sugiere una concordancia entre la pérdida del número de copias de ADN y
ARID1A
inactivación. En el estudio de la secuenciación del exoma por Wang
et al
., Se encontró un total de 46 mutaciones en 32 de 109 (29%) muestras de cáncer gástrico, con 39 (85%) mutaciones truncadas [19]. Veinticuatro (75%) de las 32 muestras de cáncer gástrico con
ARID1A
mutaciones muestran ya sea la pérdida de la expresión de la proteína o sustancialmente reducida en comparación con aquellos sin
ARID1A
mutación. Por el contrario, sólo hay 6 muestras de cáncer gástrico que muestran expresión de la proteína ausente o débil en ausencia de detectable
ARID1A
mutación, lo que sugiere que otros mecanismos pueden contribuir a
ARID1A
inactivación. Recientemente, otra investigación de la secuenciación del exoma por Zang
et al
. También mostró
ARID1A
mutaciones en el 8% de las muestras gástricas, de los cuales pérdida o reducción de la expresión de la proteína [23] 75%. Más interesante aún, ambos estudios demostraron mayor
ARID1A
alteraciones en las muestras de cáncer gástrico con la inestabilidad de microsatélites (MSI) que aquellos con la estabilidad de microsatélites (MSS). Por otra parte, el espectro de mutación de
ARID1A
es distinta entre los dos tipos genéticos de cáncer gástrico, con la mayoría de indeles en el tipo de MSI y más variaciones de un solo neucliotide en el tipo de MSS. MSI se define como indel mutaciones dentro de repeticiones de nucleótidos (conocido como regiones microsatélites) se debió a falta de coincidencia de ADN de genes de reparación de errores de replicación de inactivación inducida [24]. Propuesto como los sucesos iniciadores genómicos de cáncer gástrico, MSI a menudo conduce a la acumulación de las inestabilidades genéticas relacionadas con el cáncer adicionales, tales como pérdidas alélicas y mutaciones del marco de lectura en los genes implicados en la regulación de proliferación celular, la apoptosis y la reparación del ADN. Se ha informado de que MSI se produce en 25% a 50% de cáncer gástrico esporádica, definiendo una enfermedad de tipo genético único con diferentes características clinicopatológicas [24]. En el estudio de Wang
et al
., La tasa de mutación indel (78%) de
ARID1A
en el cáncer gástrico MSI es comparable a la de
Hoteles en TGFBR2 MSI de colon cáncer, un gen conductor bien establecida y funcionalmente validado inactivado por MSI [25]. Estos datos indican que la mutación de
ARID1A
junto con MSI puede jugar un papel importante en la carcinogénesis gástrica. Por lo tanto, la relación entre el
ARID1A
alteraciones y MSI estado en el cáncer gástrico, así como su significado clínico-patológica, necesita más investigación en la investigación futura.
En el estudio de Wang
et . al
, la expresión de
ARID1A
sólo se detectó en una muestra de tamaño pequeño (32 casos), y no había una exploración más profunda de su significado clínico [19]. Aquí, en una población con cáncer gástrico más grande (224 casos), se encontró que la pérdida de
ARID1A
expresión se correlacionó significativamente con un mayor etapa T del cáncer gástrico, lo que implica que la ausencia de
ARID1A
expresión puede promover el crecimiento del tumor y la invasión. Además, se detectó inmunorreactividad baja ARID1A mal diferenciados tejidos de cáncer gástrico que en los bien diferenciados, lo que sugiere que la disminución de
ARID1A
expresión podría desempeñar un papel en el tumor de-diferenciación. De acuerdo con nuestros resultados, otros investigadores también encontraron que la disminución de
ARID1A
expresión se asocia significativamente con un grado más alto de cáncer de mama [22], así como una etapa FIGO mayor en carcinoma de células claras de ovario [21]. ARID1A promueve la formación de BRG1 o BRM-contenido SWI /SNF remodelación de la cromatina complejos, que son esenciales para la detención del ciclo celular normal [9], [26].
Un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró una correlación significativa entre la pérdida de
ARID1A
expresión y peor evolución clínica de los pacientes con cáncer gástrico después de la operación radical. Los análisis de regresión de Cox cociente de riesgos instantáneos demostró además que el
ARID1A
nivel de expresión era un factor de riesgo independiente para la supervivencia, sugiriendo que podría servir como una valiosa biomarcador pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico después de la cirugía y un objetivo potencial para la terapia génica en el tratamiento del cáncer gástrico. En carcinoma de células claras de ovario, también se informó que los pacientes con positivo
ARID1A
expresión tuvieron una mayor supervivencia libre de progresión que aquellos con negativo
ARID1A
expresión [21]. Por otra parte, la pérdida de
ARID1A
expresión se correlaciona significativamente con la quimiorresistencia en el carcinoma de células claras de ovario, que también se asocia con un mal pronóstico del cáncer. Estos datos sugieren que
ARID1A
expresión y mutación examen podría ser útil para orientar la gestión clínica. Tomados en conjunto, nuestras observaciones de que la pérdida de
ARID1A
expresión en el cáncer gástrico se asocia con fenotipos más malignas y un peor pronóstico implican que puede desempeñar un papel supresor de tumor en la carcinogénesis gástrica.
investigarse más a fondo el papel funcional de
ARID1A Hoteles en líneas de células gástricas. La restauración de
ARID1A
expresión en células de cáncer gástrico, inhibió la proliferación celular y la formación de colonias. Silenciar la expresión de
ARID1A Hoteles en células epiteliales gástricas mejora de forma significativa la tasa de crecimiento de las células. Estos resultados indican que
ARID1A
pueden desempeñar una función de importación para inhibir el crecimiento de células tumorales. Recientemente, los ensayos funcionales de
ARID1A Hoteles en líneas celulares de cáncer gástrico por Zang
et al
. sugirió que
ARID1A
ejercen la actividad supresora de tumores [23]. Guan
et al
. demostró que la restauración de la expresión de tipo salvaje
ARID1A
es suficiente para suprimir la proliferación y tumorigenecity de xenoinjertos con líneas celulares de cáncer de ovario humanos albergar
ARID1A
mutaciones, mientras que la interferencia mediada-ARN
ARID1A
silenciamiento aumenta la proliferación celular y la tumorigenicidad en dos líneas no transformadas humanas epiteliales de ovario de células, IOSE-80PC y OSE4 [27]. Estos datos, junto con el nuestro, sugieren que la pérdida de
ARID1A
puede desempeñar un papel importante en el proceso de la carcinogénesis.
En conclusión, hemos demostrado la pérdida de
ARID1A
expresión en el cáncer gástrico y su correlación con un fenotipo más maligno y peor pronóstico en un gran número de muestras clínicas. Además, hemos demostrado que
ARID1A
puede inhibir el crecimiento de células tumorales y la formación de colonias in vitro. A lo mejor de nuestro conocimiento, los datos generados en este estudio representan el primer informe correlacionar la presencia de
ARID1A
con características clínico-patológicas y la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico. Tomados en conjunto con los resultados de Wang
et al. Opiniones y Zang
et al
. [19], [23], que confirmó además que
ARID1A
podría servir como un supresor tumoral candidato y biomarcador pronóstico en la carcinogénesis gástrica.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
la investigación fue aprobado por el Comité de Ética de Sun Yat-sen Centro de cáncer de la Universidad, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente involucrado en el estudio.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
las líneas celulares de cáncer gástrico, SGC7901, AGS, MGC803, y la línea celular epitelial mucosa gástrica GES1 se obtuvieron de la Comisión de Type Culture Collection de la Academia china de Ciencias (Shanghai, china). Las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 suministrado con suero bovino fetal inactivo por calor al 10% (FBS). Las células se incubaron a 37 ° C en una cámara humidificada que contiene 5% de CO
2.
muestra de tejido humano
s
Un total de 66 emparejado canceroso y tejidos de la mucosa gástrica emparejados adyacentes no cancerosos se recogieron de pacientes con cáncer gástrico sometidos a gastrectomía en Sun Yat-sen Centro de cáncer de la Universidad entre 2009 y 2011, y el diagnóstico se confirmó mediante examen patológico. El 25 emparejados cancerosos y tejidos correspondiente mucosa gástrica no cancerosas adyacentes utilizados para detectar la expresión de la proteína ARID1A en el Western Blot fueron seleccionados de las 66 muestras apareadas. Después de la resección quirúrgica, tejidos frescos se immerged inmediatamente en RNAlater (Ambion, Inc., EE.UU.) para evitar la degradación del ARN, se almacena a 4 ° C durante la noche para permitir la penetración profunda de RNAlater en el tejido y luego se congeló a -80 ° C hasta que el ARN y se llevó a cabo la extracción de proteínas. Otro de 224 muestras de carcinoma gástrico primarias incluidas en parafina que habían sido recogidos entre 2003 y 2005, se obtuvieron del Centro de Cáncer de la Universidad Sun Yat-sen. Ninguno de estos pacientes habían recibido radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Los datos de seguimiento de los pacientes con cáncer gástrico en este estudio están disponibles y completa. El seguimiento postoperatorio se produjo en nuestro departamento de atención ambulatoria e incluyó exámenes clínicos y de laboratorio cada 3 meses durante los 2 primeros años, cada 6 meses durante los treinta y los cincuenta años, anualmente durante 5 años más o hasta que la muerte del paciente, lo que ocurra primero. El tipo histológico y el estadio del cáncer gástrico se determinaron de acuerdo con los criterios de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud y el estadio TNM establecido por la Unión Internacional contra el Cáncer.
Extracción de ARN total y en tiempo real PCR cuantitativa
el ARN total fue extraído por medio de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración total de ARN se evaluó midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, EE.UU.). La transcripción inversa (RT) para sintetizar la primera hebra de ADNc se realizó con 2 g de ARN total tratado con M-MLV transcriptasa inversa (Promega, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. El ADNc resultante se sometió a PCR en tiempo real cuantitativa para la evaluación de los niveles de mRNA relativa de
ARID1A
y
GAPDH
(gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, como control interno) con el cebadores siguientes:
ARID1A
hacia adelante: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ', y a la inversa: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3';
GAPDH
hacia adelante: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 'y revertir: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. la amplificación de genes específicos se realizó utilizando un sistema en tiempo real PCR ABI 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU.) con un 15 l de mezcla de PCR que contiene 0,5 l de cDNA, 7,5 l de 2 x SYBR mezcla maestra Verde (Invitrogen, Carlsbad , California, EE.UU.), y 200 nM de los cebadores de oligonucleótidos apropiados. La mezcla se precalentó a 95 ° C (10 min) y después se amplificó a 95 ° C (30 segundos) y 60 ° C (1 min) durante 45 ciclos. La curva de resolución se midió a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 15 seg y 95 ° C durante 15 s. El valor Ct (ciclo umbral) de cada muestra se calcula a partir de los ciclos umbral con el software del instrumento (SDS 2.3), y la expresión relativa de
ARID1A
ARNm se normalizó a la
GAPDH
valor . Los datos fueron analizados utilizando el método comparativa ciclo umbral (2
-ΔCT).
Análisis de transferencia Western
Los homogeneizados muestras de cáncer gástrico, incluyendo tumor y los tejidos no tumorales, así como líneas celulares , se lisaron en tampón de lisis RIPA, y los lisados se recogieron por centrifugación (12.000 rpm) a 4 ° C durante 30 min. Aproximadamente 50 g muestras de proteína se separaron a continuación por electroforesis en un gel de sodio dodecil sulfato poliacrilamida 12% y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno. Después de bloquear los sitios de unión no específicos para 60 min con leche no grasa al 5%, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo monoclonal de ratón contra ARID1A (Abgent Anticuerpo primario Company, EE.UU., a una dilución 1:1000) . A continuación, las membranas se lavaron tres veces con TBST (solución salina tris-tamponada con Tween-20) durante 10 min y se sondaron con la peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-ratón de anticuerpo IgG de conejo conjugado (Inmunología consultores Laboratory, EE.UU., en un 1: dilución 2000) a 37 ° C durante 1 hora. Después de tres lavados, las membranas fueron desarrolladas por un sistema de quimioluminiscencia (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, Massachusetts, EE.UU.). La intensidad de la banda se midió mediante densitometría usando el software Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, EE.UU.). Los niveles de proteína se normalizaron a la de GAPDH detectado utilizando anticuerpo de ratón monoclonal anti-GAPDH humano (Shanghai Kangchen, China, a una dilución 1:10000).
Análisis Inmunohistoquímica
Las secciones de tejido fueron deparaffinized con dimetilbenceno y rehidratada a través de 100%, 95%, 90%, 80% y 70% de etanol. Después de tres lavados en PBS (solución salina tamponada con fosfato), los portaobjetos se hirvieron en tampón de recuperación de antígeno que contiene ácido 0,01 M citrato de sodio-clorhídrico (pH = 6,0) durante 15 min en un horno microondas. Después de enjuagar con PBS, las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo primario y los portaobjetos se enjuagaron en 3% de solución de peroxidasa de temple (Invitrogen) para bloquear la peroxidasa endógena. Las secciones fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal de ratón contra ARID1A (Abgent Anticuerpo primario Company, EE.UU., a una dilución 1:300) a 4 ° C durante la noche y después se incubaron con peroxidasa de rábano picante (HRP) (kit de detección EnvisionTM DAKO ChemMateTM) en la sala de temperatura durante 30 min. Después de lavar en PBS, la señal de visualización se desarrolló con una solución de 3, 3'-diaminobencidina (DAB), y todos los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina. Como controles negativos, las secciones adyacentes se procesaron como se describe anteriormente, excepto que se incubaron durante la noche a 4 ° C en solución de bloqueo sin el anticuerpo primario.
El ARID1A total de inmunotinción puntuación se calculó como la suma del porcentaje de positivamente células tumorales de colores y la intensidad de la tinción. Brevemente, el porcentaje de tinción positiva se puntuó como 0 (0-9%, negativo), 1 (10% -25%, esporádico), 2 (26% -50%, focal) o 3 (51% -100%, difusa), y la intensidad como 0 (sin tinción), 1 (tinción débil), 2 (tinción moderada) y 3 (tinción oscura). La puntuación total de la inmunotinción fue calculado con el valor de la puntuación de porcentaje de positividad × puntuación de intensidad de tinción, que varió de 0 a 9. El nivel de expresión de ARID1A se define de la siguiente manera: "-" (negativo, y marcó el 0), "+" (débilmente positiva, la puntuación de 1-3), "++" (positivo, la puntuación de 4-6), "+++" (fuertemente positiva, la puntuación de 7-9). Sobre la base de los niveles de expresión ARID1A, los pacientes con cáncer gástrico se dividieron en dos grupos:. Negativa del grupo de expresión ARID1A (ARID1A-) y el grupo expresión ARID1A positivo (ARID1A +, ARID1A ++ o ARID1A +++)
plásmido de expresión y transitorios transfecciones
Un plásmido de expresión eucariota pCMV6-entrada que contiene la longitud completa del ser humano
ARID1A
ADNc se obtuvo de la Compañía de Tecnología Asbio (Guangzhou, china). vector vacío se utilizó como control negativo. MGC803 células se cultivaron en placas de 6 pocillos hasta que alcanzaron 85 a 90% de confluencia, y luego se realizaron transfecciones transitorias usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la expresión de genes se examinó mediante análisis de transferencia Western. Y entonces, se realizaron la proliferación celular y la formación de colonias.
Los oligonucleótidos de ARN y transfecciones celulares
Para desmontables de
ARID1A
expresión, los siRNAs fueron sintetizados por GenePharma Company (Shanghai, China). Las secuencias de siRNA fueron los siguientes: siRNA-
ARID1A
, sentido: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 ', antisentido: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3'. El control negativo (NC), el sentido: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ', antisentido: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'. 400 pmol siRNA-
ARID1A
o NC se transfectaron en 2 × 10
5 GES1 células utilizando Lipofectamina RNAi MAX reactivo (Invitrogen, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.