Extracto
Antecedentes
El cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses. La terapia de privación de andrógenos es inicialmente eficaz en el tratamiento de CaP, pero CaP se repite a pesar de los niveles de castración de andrógenos circulantes. Continúa la expresión del receptor de andrógenos (AR) y sus ligandos se ha relacionado con el crecimiento de CaP castración recurrente.
Principal Encontrar
En este informe, la ARΔ142-337 dominante negativo dependiente de ligando (ARΔTR) se expresó en modelos celulares y tumorales CWR-R1-castración recurrente para dilucidar el papel de la señalización de AR. Expresión de ARΔTR disminuyó el crecimiento del tumor CWR-R1 en presencia y ausencia de testosterona exógena (T) y la mejora de la supervivencia en presencia de T. exógeno Hubo pruebas para la selección negativa de ARΔTR transgén en los ratones tratados con T. La espectrometría de masas reveló niveles de castración-recurrente CaP dihidrotestosterona (DHT) suficiente para activar AR y ARΔTR. En ausencia de testosterona exógena, las células CWR-R1-ARΔTR y control exhibieron perfiles alterados de andrógenos que implicaban a tope células epiteliales como una fuente de ligandos AR intratumoral.
Conclusión
El estudio proporciona
in vivo
evidencia de que se requiere la activación de la señalización de AR por ligandos AR intratumorales para el crecimiento de CaP castración recurrente y que las células epiteliales de CaP producir suficientes andrógenos activos para CaP recurrencia durante la terapia de privación de andrógenos. Orientación intracrina T y la síntesis de DHT debe proporcionar un mecanismo para inhibir la AR y el crecimiento de la tapa a la castración recurrente
Visto:. Tito MA, Zeithaml B, B Kantor, Li X, K Haack, Moore DT, et al. (2012) dominante negativo del receptor de andrógenos Inhibición de Crecimiento intracrina andrógeno-dependientes de la castración cáncer de próstata recurrente. PLoS ONE 7 (1): e30192. doi: 10.1371 /journal.pone.0030192
Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Septiembre, 2011; Aceptado: 15 de diciembre de 2011; Publicado: 17 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Tito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por PO1 CA77739-y 2RO1 DK058702-10 del Instituto Nacional del cáncer y el Instituto Nacional del cáncer del Centro del cáncer de apoyo Subvenciones CA016156 y CA034026 a Roswell Parque Instituto del cáncer y la Universidad de Carolina del Norte, respectivamente, de Salud Pública de Estados Unidos Subvenciones para Servicio HD16910 del Instituto Nacional de Salud infantil y Desarrollo humano, Institutos nacionales de Salud (NIH), y el Departamento de Defensa de próstata Programa de Investigación del cáncer W81XWH-10-1-0273. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer no cutáneo más común diagnosticado en los hombres estadounidenses. A pesar de la detección temprana y el tratamiento mejorado, más de 33.000 muertes se prevé que en el año 2011 [1]. Durante décadas, la terapia de privación de andrógenos ha sido el tratamiento preferido para CaP localmente avanzado o metastásico. La terapia de privación de andrógenos es eficaz al principio, pero las remisiones son temporales. CaP que se repite responde mal a la mayoría de los tratamientos y casi todos los hombres sucumben a la enfermedad. Una función molecular para el receptor de andrógenos (AR) en la transición a la castración CaP recurrente se apoya en la expresión continua de AR [2] - [4] y los genes regulados por andrógenos [5]
Muchos mecanismos. contribuir a la transactivación de AR a pesar de los niveles de castración de los andrógenos circulantes testiculares (revisado por Feldman [6]). Sin embargo, otros estudios, incluido el nuestro han demostrado que la castración CaP recurrente mantiene los niveles tisulares de dihidrotestosterona (DHT) suficiente para activar AR [4], [7] - [9]. testosterona tejido persistente (T) y DHT durante la terapia de privación de andrógenos pueden derivar de andrógenos adrenales, tales como la dehidroepiandrosterona (DHEA) y androstenediona [7], de androstanodiol través de la vía de puerta trasera de la síntesis de DHT [10], [11] y /o
de novo
la producción de colesterol [12]. En cáncer de próstata recurrente a la castración, AR induce la expresión dependiente de andrógenos del antígeno específico de la próstata y la proteasa transmembrana, serina 2-v-ets virus de la eritroblastosis E26 homólogo de oncogén, TMPRSS2:ERG [13]. Un informe reciente demostró que el 70% de los hombres con CaP castración recurrente respondió a acetato de abiraterona, un 17α-hidroxilasa /liasa (CYP17A1) inhibidor de la biosíntesis de andrógenos citocromo P450. La actividad antitumoral de acetato de abiraterona en estudios clínicos sugieren que la inhibición de citocromo P450 17α-hidroxilasa /liasa (CYP17A1) disminuye ligando activado por la señalización de AR en la castración recurrente CaP [14].
células CWR-R1 utilizadas en el presente estudio se derivan de la CWR22 xenoinjerto castración recurrente [15], expresar el mutante AR-H874Y [16] y proliferar en un entorno de andrógenos privado. AR se compone de un dominio NH
2-terminal de transactivación, un dominio de unión a ADN central y un dominio carboxilo-terminal de unión a ligando (LBD) [17]. AR es de longitud completa en células CWR-R1 derivados del xenoinjerto de cáncer de próstata humano CWR22, pero es susceptible a la degradación proteolítica durante la extracción a una importante forma kDa ~ 80 [18]. AR actividad transcripcional está mediado por la activación de funciones en el NH
2-terminal y LBD. Una propiedad única de AR es que T o DHT inducen un
2 y carboxilo-terminal (/C N) la interacción NH [19] mediada por el NH
2-terminal motivo FXXLF [20] que se vuelve lenta disociación ligando y la degradación del AR. Un papel del NH
2-terminal de dominio en la regulación de genes [21] - [24] También se ha informado de AR de señalización no genómica [25]
En el presente estudio, CWR-R1. las células fueron diseñados utilizando lentivirus para sobreexpresar la AR humana con una deleción de residuos de activación NH
2-terminales 142-337 que da como resultado un AR negativo dominante transcripcionalmente inactiva. El AR eliminación humano mutante ARΔ142-337 (ARΔTR) se une ligando con alta afinidad pero es transcripcionalmente inactiva en ausencia o presencia de andrógenos [26]. El mecanismo de la actividad negativa dominante es la heterodimerización con AR endógeno para evitar la transactivación de genes diana [27]. Los resultados sugieren que T intratumoral y la síntesis de DHT induce el crecimiento del tumor depende dominante negativo ARΔTR inhibición AR CWR-R1. El perfil de los tumores andrógeno CWR-R1-transducidas ΔTR en ausencia de T apoya la hipótesis de que las células epiteliales de CaP producen ligandos AR en un modelo murino con una baja de andrógenos suprarrenales indetectable.
Resultados
ARΔTR inhibe la transactivación de AR y la proliferación celular CWR-R1
el efecto de la síntesis de andrógenos intracrina y la inhibición del crecimiento ARΔTR CaP de AR y la castración-recurrente endógena se determinó en células CWR-R1 derivados de la PAC CWR22 humana castración recurrente xenotrasplante. células CWR-R1 transducidas con lentivirus que expresan ARΔTR o LacZ bajo el control del promotor CMV mostraron alta expresión (Fig. 1). La eficacia de la inhibición ARΔTR de la actividad transcripcional de AR se determinó usando MMTV-Luc se transfectaron en células CWR-R1 lentivirus transducidas en ausencia y presencia de 0,1 DHT nM porque el gen reportero de antígeno-luciferasa específico de la próstata está sólo débilmente activada por endógeno AR [10], [21], [28]. Adición de 0,1 células CWR-R1 transducidas con LacZ nM DHT aumento de la actividad de la luciferasa por 3 veces (Fig. 2). En las mismas condiciones, la actividad luciferasa en células transducidas CWR-R1-ARΔTR fue baja, con o sin 0,1 nM de DHT, una concentración de andrógenos que estimula al máximo los genes regulada por andrógenos en las células CWR-R1 [29]. Los resultados demuestran un efecto negativo dominante de ARΔTR en la transactivación AR endógeno de MMTV-luc en ausencia y en presencia de DHT.
análisis de transferencia de Western de CWR-R1 lisados de proteínas (20 mg) demostró que AR endógeno (M
r 110 kDa, carriles 1-2) se detecta tanto en ARΔTR y lacZ transduced células CWR-R1 utilizando anticuerpo policlonal de cabra AR. LacZ (M
r 60,5 kDa, carril 1) expresión sólo se observa en las células CWR-R1 transducidas con LacZ usando anticuerpo LacZ policlonal de conejo y de expresión ARΔTR (M
r 84 kDa, carril 2) se detecta usando cabra AR anticuerpo policlonal en las células CWR-R1-transduced ARΔTR. Endógeno β-actina se detectó usando anticuerpo monoclonal de ratón β-actina AC-15 (M
r 43 kDa, carriles 1 y 2) y sirvió como el control de carga tanto para ARΔTR y LacZ transducidas células CWR-R1.
células CWR-R1 se transfectaron transitoriamente con el reportero MMTV-luciferasa y se ensayaron para actividad de luciferasa en presencia y ausencia de DHT. En presencia de 0,1 nM de DHT, las células CWR-R1 que expresan el transgén LacZ demostraron un aumento en la actividad del indicador MMTV-luciferasa en comparación con las células control sin DHT. Expresión de ARΔTR reduce la actividad del indicador MMTV-luciferasa en ausencia o en presencia de 0,1 nM de DHT en comparación con células de control transducidas con LacZ. Las columnas representan la actividad de luciferasa media en unidades relativas de luz a partir de 3 experimentos independientes; bares ± desviación estándar.
La inhibición de la transactivación de AR endógeno mediante ARΔTR en ausencia de DHT añadido planteó la posibilidad de que los ligandos endógenos inducidos AR ARΔTR dimerización [30] y la heterodimerización entre ARΔTR y de larga duración endógena AR [31]. Liquid cromatografía tándem análisis de espectrometría de masas demostró 3,38 ± 0,26 fmol T /millón de células (n = 4) y 1,84 ± 0,16 fmol DHT /millón de células (n = 4) (Fig. 3). Desde la dimerización AR y la unión al ADN son dependiente de andrógenos [30], los resultados sugieren que la actividad inhibitoria ARΔTR puede servir como indicador sustituto de andrógenos activos intracelulares.
DHT se midió en las células CWR-R1 crecido sin suplementos de medios o exógena T utilizando cromatografía líquida espectrometría de masas. cromatograma Representante de DHT (panel de la izquierda, DHT pico a 7,26 min) usando 10 millones de células CWR-R1 (n = 4). La concentración media de DHT fue 1,84 ± 0,16 fmol /millón de células CWR-R1. Control de calibrador cromatograma de DHT normalizado en la que pico a 7,29 min (panel derecho).
El efecto de ARΔTR sobre la expresión génica Nkx3.1 dependiente de andrógenos [32] fue evaluado para caracterizar la actividad inhibidora de ARΔTR en la señalización AR. Además de DHT disminuye los niveles de proteína en las células Nkx3.1 CWR-R1-transducidas ARΔTR (Fig. 4), pero el aumento de la proteína en las células control Nkx3.1 CWR-R1 transducidas-LacZ. La adición de DHT aumento de la proliferación celular CWR-R1-LacZ, pero no hubo un aumento en la proliferación celular CWR-R1-transducidas ARΔTR. En ausencia de células CWR-R1 DHT, transducidas con ARΔTR tanto LacZ- y agregados expuestos proliferación mínima (Fig. 5).
El análisis por inmunotransferencia de CWR-R1 proteína lisados de células (20 mg) determina Nkx3.1 expresión de la proteína usando el anticuerpo policlonal de cabra en presencia o ausencia de 1,0 nM DHT. Nkx3.1 (
r 35,5 kDa M) de proteínas se aumentó en las células CWR-R1 transducidas con LacZ con adición de DHT (carriles 1 y 2). células CWR-R1 ARΔTR-transducidas mostraron una disminución de la expresión de proteínas Nkx3.1 en presencia de DHT (carriles 3 y 4). Endógeno β-actina (H
r 43 kDa) se utilizó como control de carga (carriles 1-4).
La proliferación celular se determinó a través de XTT
R ensayo y el seguimiento de la absorbancia a 490 /690 nm por triplicado desde el día 1 hasta el día 8 (media ± desviación estándar). Las células que expresan CWR-R1 ARΔTR (diamante negro y línea continua) o LacZ (cuadrado sólido y la línea gris) transgén en ausencia de 0,1 nM de DHT mostraron curvas de crecimiento similares (panel superior). el crecimiento celular CWR-R1 en presencia de 0,1 nM de DHT, ARΔTR transducidas-disminuyó en comparación con las células CWR-R1 de control transducidas-LacZ (panel inferior).
ARΔTR inhibe el crecimiento del tumor CWR-R1
LacZ o células transducidas con ARΔTR fueron inyectadas en ratones desnudos para generar tumores CWR-R1 para evaluar el impacto de ARΔTR sobre el crecimiento tumoral y la señalización AR endógeno. las tasas de crecimiento del tumor se alteraron por la expresión ARΔTR. Un análisis estadístico de modelado mezclado riguroso que considera las trayectorias de volumen del tumor individuo demostró diferencias significativas entre los 4 grupos (Fig. 6). La tasa de crecimiento de los controles LacZ difería con T exógeno (p = 0,04) (Fig. 6A y 6B), lo que indica se requieren diferentes controles para los grupos experimentales dos ARΔTR. ARΔTR redujo las tasas de crecimiento tumoral en comparación con los controles, un efecto que era similar sin (p = 0,01) o con exógenos T (p = 0,0004) (Fig. 6C y 6D). Los resultados fueron similares cuando el crecimiento del tumor se evaluó mediante dos parámetros adicionales. controles y LacZ LacZ + T diferían en pendiente (p = 0,01) y el tiempo de duplicación (p = 0,02), lo que confirma la necesidad de controles diferentes para cada grupo experimental ARΔTR. T suplementos para optimizar la función ARΔTR disminución del crecimiento tumoral en comparación con los controles de inclinación (p = 0,004) y el tiempo de duplicación (p = 0,0007). Sin suplementos T, pendiente el crecimiento del tumor (p = 0,07) y el tiempo de duplicación (p = 0,37) fueron similares. Inspección de las trayectorias individuales del tumor y los volúmenes tumorales reales sugirió que el efecto de ARΔTR era una combinación de reducción de la tasa de crecimiento y el retraso de la aparición del crecimiento del tumor, y que este efecto se produjo con más frecuencia cuando se proporciona T exógeno para mejorar el efecto de ARΔTR (Fig. 6E).
Los tumores se midieron usando calibradores digitales y los volúmenes calculados desde el día 14 al día 160 después de la inoculación de células CWR-R1. Los volúmenes tumorales, LacZ (A, n = 22), LacZ + T (B, n = 21), ARΔTR (C, n = 21) o + T ARΔTR (D, n = 21), se muestran a partir de día 21 cuando el crecimiento comenzó hasta el día 96 a partir del cual sólo el 1 ratón en cada grupo se mantuvo. modelado mixta análisis estadístico mostró una diferencia estadísticamente significativa entre los 4 grupos. transducidas-ARΔTR tasas de crecimiento del tumor CWR-R1 se redujeron en comparación con los controles LacZ en ausencia (p = 0.01, panel A vs. C) o presencia (p = 0,0004, grupo C frente a D) de T. (E) media prevista los volúmenes tumorales CWR-R1 (cm
3) se representaron frente al tiempo de la siega primer tumor para el + T LacZ (cuadrados), LacZ (rombos blancos), + T ARΔTR (círculos rellenos) y ARΔTR (círculos abiertos) grupos . ARΔTR que expresan CWR-R1 tumores (círculos) muestran una disminución de las tasas de crecimiento en comparación con las células control CWR-R1 transducidas-LacZ.
Cambios
ARΔTR inducidos en la tasa de crecimiento del tumor también afectaron el momento de la eutanasia determinado por el tamaño del tumor superior a 1,5 cm
3 (figura 7, la trama de Kaplan-Meier;. Tabla 1, el análisis de registros rango, p = 0,009). intervalos de 95% de confianza para el tiempo medio para la eutanasia en día y el rango para cada grupo fueron LacZ (71, 68-84 días), + T LacZ (63, 57-68 días), ARΔTR (75, 68-89 días) y T ARΔTR + (89, 68-105 días). ARΔTR aumentado el tiempo de acoger la eutanasia mediana por 36% en presencia de T exógeno, pero tuvo poco efecto sin exógeno T. mediana de tiempo hasta la eutanasia aumentado en un 5%, en ausencia de exógenos T, una diferencia que no fue estadísticamente significativa.
Día de la eutanasia se basó en 1,5 cm
3 el tamaño del tumor de los ratones en el + T LacZ (línea discontinua, n = 21), LacZ (línea punteada, n = 22), ARΔTR (línea continua, n = 21) o + T ARΔTR (línea punteada, n = 21) grupos. El tiempo medio de supervivencia difieren en los grupos que recibieron T exógena (línea discontinua vs línea discontinua, p = 0,008), pero no en los grupos sin T (línea continua vs Línea de puntos, p = 0,34).
la selección negativa de ARΔTR en tumores CWR-R1
el tiempo similar a la eutanasia basado en el tamaño del tumor entre los ratones CWR-R1-ARΔTR y LacZ en ausencia de andrógenos sugerido que las células ARΔTR de selección contra la expresión ARΔTR . Para probar esto, el número de copias del vector y de la proteína de expresión ARΔTR y LacZ se determinaron en los tumores CWR-R1. ARΔTR o LacZ número de copias del vector y la expresión de proteínas se determinó en células transducidas CWR-R1 antes de la inoculación y en el momento de la cosecha tumor. ARΔTR o LacZ número de copias de vector por célula medida en células transducidas-R1 CWR antes de la inoculación sobre la base de la amplificación por PCR del elemento regulador post-transcripcional virus de la hepatitis de la marmota era 5,46 y 4,53, respectivamente. tumores CWR-R1 media (± desviación estándar) el número de copias del vector por célula para ARΔTR y LacZ transducidas en el momento de la cosecha fue de 0,49 ± 0,58 para + T ARΔTR y 2,58 ± 1,68 para ARΔTR (p = 0,001), y 3.10 ± 1.77 para + T LacZ y 3,48 ± 1,45 para LacZ (p = 0,4) (Fig. 8).
número de copias del vector por célula se determinó usando PCR cuantitativa del elemento regulador post-transcripcional virus de la hepatitis de la marmota. La media del número de copias del vector por célula es de 0,49 ± 0,58 para T + ARΔTR, 2,58 ± 1,68 para ARΔTR, 3,10 ± 1,77 para LacZ + T y 3,48 ± 1,45 para los tumores LacZ. Se observó una disminución estadísticamente significativa en el número de copias del vector por célula de + T ARΔTR vs tumores ARΔTR (p = 0,001), pero no LacZ + T vs. LacZ (p = 0,4), los tumores.
Caracterizar aún más el efecto de ARΔTR en el número de copias del vector, las relaciones de número de copias de vector por célula en las células CWR-R1 se calcula en el momento de la cosecha del tumor y en el momento antes de la inoculación de células CWR-R1 para los tumores ARΔTR y LacZ en la presencia y ausencia de T. el análisis estadístico de la mediana del número de copias del vector por relaciones de células tumorales para ARΔTR y LacZ vectores que expresan mostró que la casete vector de expresión ARΔTR fue seleccionado contra (p = 0,006, Fig. 9A). Un resultado similar se obtuvo estadística en el número de copias del vector mediana por proporción de células tumorales para ARΔTR y LacZ que expresa vectores en presencia de T (p & lt; 0,0001, Figura 9B.). En general, las células CWR-R1 en la presencia o ausencia de T exógeno seleccionado contra el vector ARΔTR comparación con los controles de vector LacZ ARΔTR transducidas.
Las proporciones para ARΔTR (A) y LacZ, y (B) + ARΔTR T y T + LacZ se calcularon usando el número de copias del vector medido en el momento de la cosecha tumor frente al número de copias del vector medido antes de la inoculación. Individuo de número de copias del vector del tumor por la proporción de células de cada cohorte se representa mediante círculos abiertos. La relación del número de copias del vector mediana (círculo sólido) se determinó en ARΔTR (0,43), LacZ (0,64), + T ARΔTR (0,05), y + T LacZ (0,6) tumores. El transgén ARΔTR fue seleccionado contra en ausencia (p = 0,006) y la presencia (p & lt; 0,0001) de exógena T en comparación con los controles LacZ
El ARΔTR mediana alterado y LacZ número de copias de vector por célula tumoral. proporciones sugeridas disminución de la expresión de proteínas ARΔTR comparación con los controles LacZ. Cosechado tumores CWR-R1 con cantidades suficientes de tejido (79 tumores) para el análisis de AR endógeno y proteína expresada ARΔTR o LacZ se analizaron en inmunotransferencias. Expresión de la proteína AR y ARΔTR endógeno se demostró en pTK989-ARΔTR transduce células CWR-R1 antes de la inoculación subcutánea. ARΔTR-transduced tumores CWR-R1 en presencia de T (Fig. 10A), expresado AR endógeno en los 22 tumores + T CWR-R1-ARΔTR, aunque proteína AR fue de baja a indetectable en 3 muestras (muestras 21-23). Por el contrario, la proteína ARΔTR era insignificante o inexistente en todos los tumores CWR-R1-ARΔTR en presencia de suplementos T.
Western blot se realizó utilizando lisados de proteínas aisladas de tumores CWR-R1 recogidos en el momento del tumor cosecha. La expresión tumoral CWR-R1 del AR endógenos (H
r 110 kDa), y transducidas ARΔTR (ARΔ142-337, H
r 84 kDa) y se evaluaron LacZ (
r 60,5 kDa M) de proteínas. (A) inmunotransferencias de AR y ARΔTR en presencia de T (números tumorales 2-23) o (B) la ausencia de T (números tumorales 24-29, 31-35, 38, 39, 43 y 44). (C) inmunotransferencias de LacZ proteína (M
r 60,5 kDa) con T (números 47-68 tumorales) o sin T (números tumorales 69-91) y en los controles de vector vacío (números tumorales 92-95). LacZ se expresó en todos menos uno de 42 tumores CWR-R1. proteína LacZ expresado en pTK1027 transduce células CWR-R1 antes de la inoculación subcutánea en ratones se utilizó para el control. Se utilizaron células HEK-293T como controles negativos y el control de carga para inmunotransferencias lacZ se glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, H
r 36 kDa).
En ausencia de suplementos de T, proteína AR persistió en 10 de los 15 tumores CWR-R1-ARΔTR (números de tumores 28, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 39, 43 y 44), y AR endógeno no se detectó en 5 tumores que tampoco expresar ARΔTR (muestras 24-27 y 33) (Fig. 10B). CWR-R1-ARΔTR Tumores 32 y 35 sin el suplemento T expresado AR pero no ARΔTR. ARΔTR fue co-expresada en 8 tumores CWR-R1 (números de tumores 28, 29, 31, 34, 38, 39, 43 y 44).
Por el contrario, la proteína LacZ se expresa en todos los tumores con excepción del tumor 72 en ausencia y en presencia de T (Fig. 10C). tumores vacías control de vectores CWR-R1 con T (muestras 92 y 93) y sin T (muestras 94 y 95) y las células 293T no expresaban la proteína LacZ o ARΔTR. La expresión consistente de proteína LacZ correspondió con el número de copias del vector calculado en los tumores transducidos con LacZ.
Los resultados sugieren la selección negativa de ARΔTR no se limita a los tumores CWR-R1-ARΔTR propagadas en ratones con T. suplementario en ARΔTR tumores -transduced sin suplementario T, la selección ARΔTR fue menor, posiblemente debido a la baja T suero y /o la biosíntesis intracrina T alterado.
intracrina la síntesis de andrógenos activos en cáncer de próstata recurrente castración
La ausencia de CYP17A1 en las glándulas suprarrenales de ratón [33] proporciona un modelo para probar si la castración CaP recurrente produce andrógenos intracrina. Generación de los tumores CWR-R1-ARΔTR proporciona una oportunidad para investigar el efecto de AR de señalización en la biosíntesis de andrógenos intracrina activo. El crecimiento similar tumor CWR-R1-ARΔTR, tumor veces y pendientes con y sin T, y mediciones de DHT doble en células CWR-R1 sugirió que los tumores CWR-R1 producen andrógenos activos en ausencia de circulación de T.
Para identificar las posibles diferencias en los perfiles de andrógenos entre los tumores LacZ CWR-R1-ARΔTR y, T, DHT, androstenediona y androsterona se midieron mediante cromatografía líquida espectrometría de masas. los niveles tisulares de 0,32 nM DHT (p = 0,59) y 0,05 nM androsterona (p = 0,23) medidos en el momento de la cosecha tumor fueron similares en ARΔTR y los tumores transducidos con LacZ (Tabla 2) y suficiente para activar endógeno AR y ARΔTR (ver
in vitro
resultados; Fig. 2). Por otra parte, de 3,25 nM en T LacZ tumores fue similar a los niveles de testosterona de castración en cáncer de próstata recurrente [4], [9] que era suficiente para activar endógeno AR-H874Y [29]. Sin embargo, en los tumores CWR-R1-ARΔTR, los niveles de T fueron ~ 4 veces menos que los tumores LacZ, lo que sugiere alteración en la biosíntesis de T por el AR negativo dominante. La disminución de la biosíntesis de T en los tumores CWR-R1-transduced ARΔTR correlacionados con la acumulación de ~ 1 nM androstenediona, un precursor de andrógenos a T. En contraste, los tumores CWR-R1-lacZ contenían 1,05 nM androstendiona. tumores CWR-R1 cuantificación de los precursores de las 5a-insaturado reducida y andrógenos en ARΔTR y LacZ transducidas-sugirieron la biosíntesis de andrógenos intracrina contribuyó a AR dependiente de Cap Growth castración recurrente.
Discusión
los estudios en este informe se basan en la premisa de que una forma dominante negativa de AR con una deleción del NH
2-terminal de dominio de transactivación requiere andrógenos para la dimerización [30] y la inhibición de la actividad transcripcional de larga duración AR [27] . Hemos demostrado que la expresión estable de ARΔTR dominante negativa inhibe endógeno AR-H874Y actividad transcripcional y retrasa o retarda el crecimiento del tumor CWR-R1 en ausencia y presencia de T. suplementario actividad ARΔTR dominante negativo también fue indicado por la disminución de la proteína Nkx3.1 y la actividad de luciferasa en presencia de DHT.
los resultados del estudio han revelado dos importantes conclusiones adicionales. En primer lugar, no hubo esencialmente selección negativa 100% contra la forma dominante negativa de AR durante el crecimiento del tumor CWR-R1-castración recurrente en la presencia de T. suplementario Esto contrastaba casi 100% de retención del gen de control LacZ. Tanto ARΔTR dominante negativo y LacZ se integraron en el genoma utilizando la expresión lentivirus y la selección de células antes de la inoculación celular y el crecimiento tumoral. En segundo lugar, aproximadamente 50% exclusión de AR dominante negativo se produjo en los tumores CWR-R1-ARΔTR propagadas en ausencia de T. complementario Estos resultados, junto con las mediciones de espectrometría de masas de T y DHT en células CWR-R1 cultivadas, proporcionar pruebas para la síntesis de intracrina andrógenos de activos necesarios para la señalización AR en cáncer de próstata. pérdida selectiva de un AR negativo dominante demuestra la versatilidad genética de las células de CaP castración-recurrente para maximizar AR señalización.
intracrina la síntesis de andrógenos en cáncer de próstata recurrente castración
La inhibición de la actividad de la luciferasa en CWR- células R1 por ARΔTR negativo dominante en ausencia de exógenos T sugirieron la síntesis intracelular de T. Esto fue apoyado por mediciones de espectrometría de masas de T y DHT en células CWR-R1. Nuestros resultados están de acuerdo con las anteriores pruebas de que las células LNCaP andrógeno-hambre sintetizan andrógenos
14C-acetato de colesterol marcado con [34]. células de CaP alteran el metabolismo y el procesamiento para apoyar la biosíntesis de andrógenos [35] colesterol. biosíntesis intracrina de androstenediona, DHEA y T también se demostró en CWR-R1 y células PC-3, y implicada la actividad de CYP17A1 en células de CaP positivos y negativos AR [36]. En las muestras clínicas, colesterol y enzimas biosintéticas de andrógenos fueron hasta reguladas en cáncer de próstata castración recurrente [12], [37], [38].
En los tumores CWR-R1-lacZ, intratumoral niveles de T y DHT fueron suficientes para activar AR-H874Y y promover el crecimiento del tumor. los niveles de DHT en intratumorales ARΔTR y los tumores transducidos con LacZ fueron similares. Sin embargo, en los tumores de xenoinjertos CWR-R1-transducidas ARΔTR, los niveles de testosterona eran más bajos y los niveles de androstenediona fueron mayores que los tumores CWR-R1-LacZ. Los niveles más bajos T en el tumor CWR-R1-ARΔTR sugirieron que ARΔTR dominante negativo selecciona contra las células que expresan aldo-ceto reductasa 1C3, una enzima que reduce la androstenediona a T en CaP castración recurrente o aumentaron la oxidación de T a androstenediona por NAD
+ dependientes [39]. Disminución de la conversión de la androstenediona a T desplazaría el perfil ligando intracelular hacia la activación del mutante AR-H874Y de tipo salvaje AR LBD en ARΔTR. metabolismo intracrina de colesterol a los andrógenos activos podría explicar la sensibilidad inicial de CaP castración recurrente al tratamiento con acetato de abiraterona [14].
AR-H874Y endógena a las células CWR-R1 conserva una alta afinidad de unión a T y DHT similar a AR de tipo salvaje. Sin embargo, la mutación H874Y estabiliza la estructura del núcleo LBD de manera que T es tan eficaz como DHT en la promoción de la actividad transcripcional [29]. La estructura efectos de H874Y estabilización son suficientes para superar los efectos perjudiciales de la pérdida de función de las mutaciones que causan la insensibilidad a los andrógenos [40]. La potencia equivalente de T y DHT con AR-H874Y sugiere que la síntesis de T intracrina promovería el crecimiento del tumor CWR-R1 transducidas-LacZ. la conversión intracelular de androstenediona a T podría tener un efecto sustancial sobre la transcripción AR-H874Y en relación con AR de tipo salvaje [29]. El aumento de expresión de p160 coactivadores de receptores de esteroides en el casquillo de la castración recurrente [41], [42] contribuyó a la hipersensibilización.
tumores CWR-R1 proporciones T:DHT en LacZ- y ARΔTR transducidas fueron similares a los de castración recurrente PAC [4], [9], [43]. Estudios anteriores utilizando especímenes clínicos demostraron disminuyeron 5α-reductasa-2 isoenzima ARNm [44] y de la proteína [45] expresión en CaP castración recurrente que era debido en parte a la pérdida de factor de células del estroma secretada señalización [44], [46]. tumores CWR-R1 también pueden haber disminuido la actividad 5α-reductasa-2. Los niveles de DHT similares en tumores LacZ y ARΔTR indican que la biosíntesis de DHT depende de androstenediona en lugar de T, desde la androstenediona es un mejor sustrato para la 5α-reductasa-1 a T [47]. El cambio hacia la conversión de androstenediona a androstanodiona [45] por la 5α-reductasa-1 y un metabolismo adicional a DHT por la membrana NADPH con destino depende 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa-15 [48] puede explicar por qué los hombres con CaP castración recurrente y niveles de androstenediona en la situación basal sobrevivieron más tiempo cuando son tratados con ketoconazol [49]. los niveles de DHT siguen siendo similares a pesar de que las relaciones de T:androstenedione en tumores LacZ y ARΔTR fueron invertidas. Los niveles bajos y similares DHT (~ 10
-11) medida en LacZ y ARΔTR-transducidas tumores CWR-R1 puede ser la concentración intratumoral óptima para la proliferación CWR-R1 celular [42] y AR-H874Y ADN coordinado de licencia de replicación [ ,,,0],50].
la selección negativa para mejorar la actividad de AR
el crecimiento efectos inhibitorios de ARΔTR se complican por el hecho de que el transgén ARΔTR fue seleccionado negativamente en contra durante el crecimiento del tumor CWR-R1 de manera más eficiente en el presencia de T. Expresión suplementario del transgén ARΔTR se perdió en todos los 22 + T ARΔTR tumores en el momento de la cosecha, mientras que el transgén ARΔTR se mantuvo en ~ 50% de los tumores en ausencia de suplementos de T. el volumen medio del tumor era más grande que los tumores + T ARΔTR, que pueden estar asociados con un cambio parcial de T a la biosíntesis de androstenediona por estos tumores. Aunque el momento de la selección negativa contra el transgén ARΔTR no fue probado rigurosamente, los estudios preliminares sugieren pérdida del transgén se produjo aproximadamente 10 días después de la inoculación de células tumorales en el día 23.
La selección negativa del transgén ARΔTR fue apoyada por el disminución del número de copias del genoma del vector en tanto ARΔTR y tumores CWR-R1 transducidas con LacZ en ausencia o presencia de T. Pérdida exógena de la expresión del transgen se ha demostrado que se producen de 10 a 15 días después de lentiviral transduced células de carcinoma embrionario [51]. El retraso en el crecimiento tumoral + T ARΔTR apoyada contra la selección del transgén después de 10 días en el modelo CWR-R1. Se podría argumentar que la pérdida del transgén fue resultado de vector de escape de variegación y /o eventos de extinción. Por otra parte, el gen aleatoria o deleción cromosómica y transgén silenciamiento [51] no fueron apoyadas, ya que no había retención casi completa del transgén LacZ de control en los tumores CWR-R1.
Estudios recientes han demostrado que CWR -r1 células, así como los xenoinjertos CWR22 CaP parentales, contienen retrovirus de replicación competentes idénticas a la de la leucemia murina xenotropic virus relacionado (XMRV) que se encuentra en las células de CaP humanos [52], [53]. XMRV evolucionó por recombinación entre dos retrovirus endógenos en ratones desnudos que lleva los xenoinjertos CWR22 [52], [53].