Extracto
15-desoxi-delta-12,14-prostaglandina -J
2 (15d-PGJ
2), un metabolito araquidónico y un agonista de PPAR naturales, se sabe que inducen apoptosis en células tumorales. En este estudio, se investigó nuevos potenciales terapéuticos de 15d-PGJ
2 mediante la determinación de sus efectos contra el cáncer de tipo salvaje y las células de carcinoma de ovario resistente a la doxorrubicina. A pesar de la alta expresión de los genes de resistencia inductor como MDR1, Bcl2 y Bcl-XL, 15d-PGJ
2 induce fuertemente la apoptosis en células de doxorrubicina-resistente (AD A2780 /) similar a la de tipo salvaje (A2780). Este se encontró que estaba relacionada con las vías de la caspasa-3/7 y NF-kB, pero no a su actividad agonista PPAR. 15d-PGJ
2 también fue capaz de reducir la resistencia a la doxorubicina de las células A2780 /AD a bajas dosis como se confirma por la inhibición de la expresión del gen de MDR1 (p-glicoproteína) y SIRT1 (un gen de senescencia de drogas). También se investigó los efectos de 15d-PGJ
2 sobre la migración celular y la transformación usando un ensayo de cicatrización de heridas y análisis morfológicos, respectivamente. Se encontró que 15d-PGJ
2 migración inhibida más probable debido a la inhibición de NF-kappa B y la transformación inducida de las células A2780 /AD de forma redonda en células epiteliales alargadas debido a la inhibición HDAC1. El uso de un 15d-PGJ
2 analógico, nos pareció que el mecanismo de acción de estas nuevas actividades de 15d-PGJ
2 en la SIRT1 y expresiones de genes HDAC1 y actividades enzimáticas. En conclusión, el presente estudio demuestra que 15d-PGJ
2 tiene un alto potencial terapéutico para matar las células tumorales resistentes a los medicamentos y, los efectos inhibitorios de reciente descripción de este producto de la ciclooxigenasa en SIRT1 y HDAC proporcionarán nuevas oportunidades para el cáncer la terapéutica
Visto:. de Jong e, P Winkel, Poelstra K, J Prakash (2011) Anticancer Efectos de la prostaglandina-15d-J
2 en los de tipo salvaje y las células del cáncer de ovario doxorrubicina-resistentes: Novel acciones sobre la SIRT1 y HDAC. PLoS ONE 6 (9): e25192. doi: 10.1371 /journal.pone.0025192
Editor: Olivier Gires, Universidad Ludwig-Maximilians, Alemania |
Recibido: Abril 26, 2011; Aceptado: 29 Agosto 2011; Publicado: 21 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 de Jong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el proyecto de la Unión Europea del Programa de Acción innovadora Groningen, Países Bajos, y con una donación de la Fundación Vici técnico holandés (STW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las prostaglandinas (PGs) son una familia de metabolitos endógenos biológicamente activos de ácido araquidónico. Controlan una gran variedad de funciones fisiológicas tales como la regulación del tono del músculo liso, la inflamación, el crecimiento celular y la diferenciación [1]. 15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2 (15d-PGJ
2) es un derivado de la deshidratación de PGD
2, que también se conoce como un agonista natural del receptor nuclear peroxisoma receptor gamma activado por el proliferador (PPAR?). 15d-PGJ
2 ha sido reportado para mostrar varias actividades farmacológicas (actividades anti-inflamatorias, anti-fibróticos y apoptosis) o bien a través de vías de PPAR-dependientes o vías de PPAR-independientes, tales como el factor nuclear kappa B (NF-kB) - , Keap-Nrf2-, STAT1, y las vías dependientes de p53 [2], [3]. En nuestro estudio reciente, hemos demostrado que 15d-PGJ
2 fue capaz de inhibir la progresión del tumor significativamente
in vivo Hoteles en ratones portadores de tumores. se encontró que su efectividad para ser controlado por su fuerte pero reversible de albúmina de suero de unión y por la penetración subsiguiente de la albúmina en los tumores, que era dependiente de la vasculatura del tumor [4]. También otros grupos han informado de la actividad anti-tumor de 15d-PGJ
2 in vivo en diferentes modelos tumorales [5], [6]. Estos resultados sugieren que un uso potencial de 15d-PGJ
2 con fines terapéuticos como un agente anticancerígeno se puede prever.
Hemos demostrado que 15d-PGJ
2 induce la apoptosis en células de cáncer a través de diferentes PPAR-independiente NF-kappa B y las vías de caspasa dependiente de [4], como se muestra también en otros estudios [7], [8]. Conocer la implicación de ruta de NF-kB en la regulación de la resistencia a múltiples fármacos (MDR1) y los genes anti-apoptóticos (Bcl-2 y Bcl-XL) [9], que ahora propone investigar si 15d-PGJ
2 es capaz de inducir apoptosis en células de cáncer de doxorrubicina resistente en comparación con la de tipo salvaje. Además, examinó si los efectos inducidos por 15d-PGJ
2 fueron mediadas a través de las vías de PPAR-dependiente y /o NF-KB-dependiente. Chu y colaboradores han demostrado que la Información Tipo silencioso Regulador 1 (SIRT1), una clase III de la histona deacetilasa (HDAC), se sobreexpresa en diversos tumores quimiorresistentes de pacientes de cáncer y la inhibición de la expresión del gen SIRT1 conduce a la disminución en la expresión de MDR1 y aumento de la sensibilidad de drogas [10]. Por lo tanto, se comparó la expresión de SIRT1 en células de cáncer de ovario resistente de tipo salvaje humana y la doxorrubicina y examinaron los efectos de 15d-PGJ
2 en esta expresión de genes SIRT1. Durante estos experimentos, hemos observado que 15d-PGJ
células transformadas resistentes a la doxorrubicina a partir de células de forma redonda con un tipo alargado 2-tratada. Además, investigó este cambio fenotípico y encontramos que 15d-PGJ
2 inducida por estos efectos mediante la inhibición de las enzimas HDAC de clase I. Muchas de las actividades farmacológicas de 15d-PGJ
2, por ejemplo, inhibición de PPAR, NF-kB, p53 y las vías de NRF-keap son inducidos al hacer un complejo estable con cisteína libre en estas proteínas a través de su uno de los átomos de carbono electrófilos [11]. Con el fin de determinar si los efectos inhibitorios de 15d-PGJ
2 en la SIRT1 y HDAC también estaban relacionados con el último mecanismo, hemos realizado varios
in vitro
experimentos usando un análogo de 15d-PGJ
2 . Nuestros resultados muestran muchas nuevas actividades de este metabolito del ácido araquidónico endógeno en las células cancerosas e iluminan el mecanismo de acción de este producto de la ciclooxigenasa.
Métodos
experimentos celulares
Salvaje de tipo (A2780) y doxorrubicina resistentes (A2780 /AD) líneas de células de carcinoma de ovario humano se obtuvieron de la Universidad del Centro Médico Groningen, Países Bajos. A2780 y A2780 /AD líneas celulares (doxorrubicina resistentes) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, BioWhittaker, Verviers, Bélgica) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y antibióticos (penicilina, 50 unidades /ml más estreptomicina, 50 ng /ml) a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2. células A2780 /AD se cultivaron en presencia de doxorrubicina (2 M). Dos semanas antes de los experimentos se mantuvo un matraz separado de las células de doxorrubicina resistentes sin doxorrubicina. Estas células se usaron para experimentos adicionales para evitar la influencia de la doxorrubicina en nuestros experimentos. Desde 15d-PGJ
2 in vitro pierde su actividad en presencia de FCS, todos los experimentos se llevaron a cabo en un medio libre de FCS.
estudios de viabilidad celular.
Las células fueron sembradas en el placa de 96 pocillos como 1 × 10
4 células /pocillo en 200 l de medio con 10% de FCS. Después de 48 h, las células se lavaron con medio libre de suero y después se incubaron con diferentes concentraciones de 15d-PGJ
2 en medio libre de suero durante 48 h. En caso de tratamiento con el antagonista irreversible PPAR GW9662 (2-cloro-5-nitrobenzanilida, Sigma), las células se pre-incubaron con GW9662 (10 mM) durante 3 h y después se incubaron con una mezcla de 15d-PGJ
2 (productos químicos Cayman, Ann Arbor, MI) y GW9662 durante 48 h. La viabilidad de las células se determinó utilizando colorante azul de Alamar (Serotec, Oxford, Reino Unido), que mide el número de células sobre la base de la actividad mitocondrial. Después de 48 h de la incubación, se añadió medio que contiene el colorante azul Alamar (diluido 1:10) a las células y se incubaron durante otras 4 h. A partir de entonces se detectó el colorante metabolizado (fluorescente) con un fluorímetro a una excitación de 560 nm y de emisión 590 nm.
Caspasa 3/7 ensayos enzimáticos.
caspasa-3 y -7 enzimas se determinó la actividad usando caspasa 3/7 kit de ensayo Glo (Promega, Medison, WI). 1 × 10
4 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos en 200 l de medio de cultivo. Después de 48 h, las células se lavaron con medio libre de suero y se incubaron con diferentes concentraciones de 15d-PGJ
2 en 100 l de medio de 5,5 h. Posteriormente, se añadieron 100 l de reactivo reconstituido-7 caspasa 3 /a las células y se incubaron durante 30 min en la incubadora. La luminiscencia se determinó mediante un luminómetro (Lumicount, Packard, Meriden, CT).
tinción con anexina V.
Anexina V tinción se realizó en las células para determinar la inducción de apoptosis después del tratamiento con 15d-PGJ2. 1 × 10
4 células fueron sembradas en una placa de 8 pocillos (Lab-tek, Nunc, Roskilde, Dinamarca) en 400 l de medio de cultivo. Después de 72 h, las células se lavaron con medio libre de suero y se incubaron con diferentes concentraciones de 15d-PGJ
2 en 200 l de medio de 6 h. Posteriormente, las células se incubaron con 100 l de la anexina V-FITC (Roche, Mannheim, Alemania) durante 15 min a temperatura ambiente, se lavaron y se fijaron con 4% de paraformaldehído. Luego, las células fueron montadas con solución de montaje y tinción DAPI contienen se examinó bajo un microscopio de fluorescencia.
Estudio de la expresión génica.
1 × 10
5 células por pocillo fueron sembradas en 12 placa -bien y se cultivaron durante 48 h y después se incubaron con diferentes compuestos para 48 h. Las células se lisaron usando un tampón de lisis y el ARN se aisló utilizando el kit de Microprep Absolutamente ARN (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de ARN se cuantificaron mediante un espectrofotómetro UV (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). A continuación, se sintetizó ADNc a partir de cantidades iguales de RNA utilizando superíndices III primera hebra de síntesis kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los cebadores para la especie humana se obtuvieron de Sigma-Genosys (Haverhill, UK). Las secuencias de los cebadores se dan de alta en la Tabla 1. niveles de expresión génica para diferentes genes se midieron por cuantitativa en tiempo real RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando SYBR Green como una sonda fluorescente (Applied Biosystems). Por último, se utilizaron los números de ciclo umbral (Ct) para calcular la expresión génica para cada objetivo mediante la normalización de la casa de mantenimiento de GAPDH gen.
Transfección y ensayo de luciferasa para la actividad de NF-kB.
actividad de NF-kappa B se determinó utilizando un ensayo basado reportero de luciferasa como se describió anteriormente [4]. En resumen, PNF-kappa B-Luc (Clontech, Mountain View, CA) que contiene una secuencia de unión específica para NF-kB y un plásmido de luciferasa vacío, PTAL-Luc (control) fueron utilizados para estudios de transfección. 1 x 104 células por pocillo fueron sembradas en placas de 96 pocillos en blanco y la transfección de los plásmidos se llevó a cabo utilizando Fugene 6 reactivo de transfección (Roche) después de 24 h. Las células fueron tratadas con un complejo de 0,17 g de ADN /0,5 l FuGENE 6 en 100 l medios de comunicación normal con 10% de FCS durante 24 h. Posteriormente, las células se lavaron con medio libre de suero y se incubaron con 15d-PGJ
2, BAY 11-7082 (Sigma), ciglitazona con o sin TNF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante 4 h. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se lisaron con tampón de lisis celular 20 l, y se suplementó con 100 l sustrato de luciferasa (Promega). La actividad de luciferasa se midió con un luminómetro (Lumicount, Packard). Los valores unitarios de luminiscencia de PNF-kappa B-Luc se neutralizaron restando los valores PTAL-Luc.
Herida ensayo de curación.
1 × 10
5 células por pocillo fueron sembradas en 12 -bien placa y se cultivaron durante 48 h en medio de cultivo. A partir de entonces, se introdujo un rasguño (herida) en la capa de células confluentes con una punta amarilla colocada en un andamio, permitiendo la estandarización del cero. Las células se lavaron tres veces con medio para eliminar células separadas. Las células fueron incubadas con diferentes compuestos durante 48 h y fotos de un lugar de la herida se define fueron realizadas con microscopio de contraste de fase asistido por ordenador (Olympus) a t = 0, 24 y 48 h. El área de la herida en las fotografías microscópicas se midió utilizando software Image J (Institutos Nacionales de Salud, MD) a diferentes puntos de tiempo. El porcentaje de curación de la herida después de 24 h o 48 h se calculó en relación a la superficie total de la herida en t = 0 h del mismo lugar de la herida.
SIRT1 y enzimas HDAC1 ensayos de actividad.
SIRT1 y se realizaron ensayos de inhibición de la enzima HDAC1 para determinar el efecto de 15d-PGJ2 en sus actividades utilizando los kits comerciales de los productos químicos Caimán (Ann Arbor, MI). Los ensayos de la enzima SIRT1 y HDAC1 se realizaron en microplacas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En primer lugar, el tampón de ensayo, la enzima SIRT1 o HDAC1 y disolvente (DMF) o diferentes concentraciones de tratamientos (15d-PGJ2 o CAY-10410 disueltos en DMF) se mezclaron. CAY-10410 (9,10-dihidro-15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2), un análogo de 15d-PGJ
2, se adquirió de productos químicos Caimán. A continuación, se añadió el sustrato compuesto de la secuencia de p53 Arg-His-Lys-Lys (e-acetil) péptido -AMC y co-sustrato NAD + para la actividad de SIRT1 a la mezcla de enzima y se incubó a temperatura ambiente durante 45 min. Para medir la actividad de HDAC1, se añadió un sustrato de lisina acetilado a la mezcla de enzima y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. A partir de entonces, la parada /solución de revelado, que contiene una mezcla de un desarrollador y nicotinamida (inhibidor de SIRT1) o tricostatina A (inhibidor de HDAC1) se añadieron a la microplaca y se incubaron durante 30 min y 15 min, respectivamente a temperatura ambiente. péptido desacetilada reacciona con el desarrollador y libera un fluoróforo. Los fluoróforos para ambos ensayos se analizaron utilizando una longitud de onda de excitación de 350 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. 100% de actividad de la enzima se calculó mediante la incubación con DMF solo y el porcentaje de inhibición de la actividad de SIRT1 o HDAC1 se calculó en relación con las concentraciones de disolventes correspondientes.
Análisis estadísticos
Los datos se presentan como media media ± error estándar (SEM) a menos que se indique lo contrario. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t no pareada de Student de dos colas con
p Hotel & lt; 0,05 como el nivel mínimo de significación. datos de la viabilidad celular se ajustaron de acuerdo con la curva dosis-respuesta sigmoidal para calcular IC
50 usando el software GraphPad Prism 4 (La Jolla, CA).
Resultados
15d-PGJ
2 induce la apoptosis tanto en las células A2780 y A2780 /AD PPAR-independientemente
se confirmó que las células /AD A2780 son altamente resistentes a la doxorrubicina en comparación con células A2780 de tipo salvaje como el IC
50 de la doxorrubicina en A2780 y A2780 /AD fueron de 1,3 y 120 mM, respectivamente (fig. 1A). Sin embargo, el tratamiento con 15d-PGJ
2 causó la muerte celular en las células A2780 (IC
50 = 4,3 M) y células A2780 /AD (IC
50 = 2,6 mM) después de 48 h de incubación. 15d-PGJ
2 es un conocido agonista PPAR, pero nos pareció que la inducción de muerte celular en ambos tipos de células fue PPAR-independiente como pretratamiento con lo irreversible antagonista PPAR GW9662 no revertir los efectos de 15d-PGJ
2 ni de tipo salvaje (Fig. 1B), ni en líneas de células resistentes (Fig. 1C). Por otra parte, se encontró que 15d-PGJ
2 apoptosis inducida en células de tipo salvaje y doxorrubicina resistentes a través de la activación de la caspasa como la caspasa-3/7 actividades enzimáticas fueron significativamente inducida por 15d-PGJ
2 en estas células después de 5,5 h de incubación (Fig. 1D). Aunque A2780 /AD (células resistentes) fueron ligeramente más sensibles a 15d-PGJ
2 en el ensayo de viabilidad celular, no fue ligeramente menor inducción de la actividad caspasa en estas células en comparación con las células A2780, lo que indica la participación de los ensayos de caspasa-independiente. La inducción de apoptosis en estas células también se confirmó con tinción de anexina V, un marcador de apoptosis temprana. Se encontró que ambos tipos de células se volvieron positivos para la tinción de anexina V (color verde) después del tratamiento con 15d-PGJ
2 y se aumentó el número de células positivas a concentraciones más elevadas en ambas líneas celulares (Fig. 1E).
(a) La doxorrubicina mató células A2780 completamente a 5 micras mientras que las células /AD A2780 fueron altamente resistentes a la doxorrubicina. Por el contrario, 15d-PGJ muerte celular inducida
2 tanto en A2780 de tipo salvaje (B) y las líneas celulares resistentes a la doxorrubicina A2780 /AD (C) dependiente de la dosis después de 48 h. Estos efectos no fueron dependientes de PPAR como pre-incubación con un antagonista de PPAR irreversible GW9662 (10 M) no bloquear estos efectos. Los datos se presentan como% del control que se calculó asumiendo las células sin tratar 100% viables como se determina con el ensayo de azul alamar. (D) 15d-PGJ
2 mejorada caspasa actividad de las enzimas 3/7 (en t = 5,5 h) en ambos tipos de células de una manera dependiente de la concentración. Los datos representan la media ± SEM de la media de al menos 3 experimentos separados. Las diferencias frente a los controles se muestran como *
p
& lt; 0,05, **
p
& lt; 0,01. (E) fotomicrografías representativo que muestra la tinción de anexina V (color verde), un indicador de la inducción de apoptosis, en las líneas de células A2780 y A2780 /AD después del tratamiento con 15d-PGJ
2 dependiente de la concentración. Tinción con DAPI (color azul) indica el número total de células. Magnificación, 200 ×. Las cajas muestran las imágenes a mayor aumento de 480 ×.
15d-PGJ
2 induce la apoptosis mediante la inhibición de NF-kB
Dado que la apoptosis inducida por 15d-PGJ
2 fue PPAR-independiente, se determinó la participación de la vía NF-kB, un importante regulador de la supervivencia y la proliferación celular, en células A2780 y A2780 /AD usando el ensayo indicador de luciferasa de NF-kB. Se indujo la actividad de NF-kB en estas células con TNF-α recombinante humana que es un activador directo de la ruta de NF-kB. Se encontró que el tratamiento con TNF-α (100 ng /ml) aumentó significativamente la actividad de NF-kappa B en ambos tipos de células pero más pronunciadamente en A2780 (13 veces) en comparación con A2780 /AD (6,0 veces) (Fig. 2A) . El tratamiento con 15d-PGJ
2 redujo significativamente la basal y la actividad NF-B inducida por TNF-α en ambos tipos de células de una manera dependiente de la concentración (Figura 2B y 2C). Sin embargo, los efectos inhibidores fueron más fuertes en A2780 /A2780 EA que como se puede notar en 2.5 y 5.0 M concentraciones. Estos datos indican que los efectos inductores de la apoptosis de 15d-PGJ
2 fueron mediadas a través de la vía NF-kB. Además, la ciglitazona agonista PPAR no inhibió la actividad basal de NF-kappa B en la concentración de 10 mM, pero sólo a concentraciones más altas. En experimentos adicionales con ciglitazona, por tanto, hemos utilizado las concentraciones que inducen sólo efectos PPAR-específicas (CE
50 = 3,0 M) [12] y los efectos no mediada por NF-kB. Un inhibidor de NF-kappa B-específico conocido, es decir, BAY-11 a 7082 inhibió la actividad de NF-kappa B en ambos tipos de células de manera similar y se utilizó este inhibidor en otros experimentos para determinar el efecto de la inhibición de NF-kappa B en estas células.
para medir la actividad de NF-kappa B, tanto en las células A2780 y A2780 /AD fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido que contiene el promotor de NF-B con un elemento indicador de luciferasa (pNF-kB-Luc) durante 24 h. Después de 24 h, 15d-PGJ
2, ciglitazona o BAY-11-7082 se incubaron con y sin TNF-α por 4 h y luego se midió la actividad luciferasa utilizando un ensayo de luminiscencia para determinar la actividad de NF-kB. (A) El NF-kB vía activador, TNF-α (100 ng /ml), inducida por la actividad de NF-kappa B en ambos tipos de células aunque el aumento fue mayor en las células A2780. El tratamiento con 15d-PGJ la actividad de NF-kB, inhibió
2 en tanto A2780 (B) y células A2780 /AD (C) que era más pronunciado en las células activadas por TNF-α. La ciglitazona inhibe NF-kappa B sólo a concentraciones más altas o en las células A2780 /AD TNF-a-activado. BAY-11-7082 inhibió la actividad de NF-kappa B en ambos tipos de células con una eficacia similar. Los datos representan la media de al menos 3 experimentos separados. Las diferencias estadísticas en comparación con los respectivos controles se muestran como *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & lt; 0,01
15d-PGJ
2 reduce la expresión del ARNm de Bcl-2, Bcl-XL, MDR1 y SIRT1
Después de los análisis de la expresión génica, hemos encontrado que las células /AD A2780 tenían inducción sustancial de los genes anti-apoptóticos tales como Bcl-2 (120- veces) y Bcl-XL (2 veces) en comparación con células A2780 no resistentes (Fig. 3A). El tratamiento con bajas concentraciones de 15d-PGJ2 (1,0 y 2,5 M) durante 48 h reduce los Bcl-2 y Bcl-XL niveles de expresión en A2780 /AD más fuertemente que en las células A2780 (Fig. 3A), que también podría explicar la mayor muerte celular potencia en las células A2780 /AD. Estos efectos no se debieron a la actividad agonista PPAR o NF-kB efectos inhibitorios de 15d-PGJ
2 como el conocido ciglitazona agonista PPAR y selectiva de NF-kB inhibidor sólo tenía efecto menor en comparación con 15d-PGJ
2 (Fig. 3A).
(a) las células A2780 /AD tenían una mayor expresión del gen de Bcl-2 y Bcl-XL en comparación con células A2780. Efectos de 15d-PGJ
2, ciglitazona y BAY-11-7082 en la expresión de genes se determinaron después de 48 h de incubación en ambos tipos de células. células /AD A2780 también tenían una mayor expresión de MDR1 (B) y SIRT1 (C) en comparación con células A2780. la expresión del gen MDR1 no era detectable (ND) en células A2780. Efectos de 15d-PGJ
2, ciglitazona y BAY-11-7082 sobre la expresión de MDR1 se determinaron sólo en las células A2780 (B) mientras que los efectos sobre la expresión de SIRT1 se midieron en ambos tipos de células (C). Los datos representan la media ± SEM de al menos 3 experimentos. Las diferencias estadísticas en comparación con los respectivos controles se muestran como *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & lt; 0,01
Además, observamos que tampoco era una sobre regulación de la resistencia a múltiples fármacos (MDR1) y la clase de HDAC-III-2 sirtuinas homólogo de la expresión del ARNm (SIRT1) en las células A2780 /AD doxorrubicina resistentes en comparación con las células A2780 de tipo salvaje (Fig. 3B y 3C). Los niveles de MDR1 en las células A2780 estaban por debajo de los niveles de detección. Curiosamente, el tratamiento con 15d-PGJ
2 inhibió significativamente la expresión del MDR1 en las células resistentes y estos efectos fueron más probable es atribuido a sus efectos inhibidores de NF-kB como BAY-11-7082 también inhibió la expresión, mientras que ciglitazona no tuvo ningún efecto (Fig. 3B). 15d-PGJ
2 también inhibe la expresión de SIRT1 en ambos tipos de células, pero estos efectos inhibitorios no se observaron con BAY-11-7082 (Fig. 3C). Por otro lado, ciglitazona redujo la expresión de SIRT1 sólo en A2780 /AD, donde se elevan los niveles de SIRT1.
15d-PGJ
2 inhibe proceso de cicatrización
Dado que las células resistentes a la quimioterapia puede tienen diferente comportamiento de migración que su versión de tipo salvaje, se examinaron, además, el efecto de la resistencia inducida en estos parámetros utilizando
in vitro
herida de ensayo de curación. El ensayo típicamente mide la migración de las células midiendo el cierre de un rasguño estándar en el tiempo. Hemos encontrado que las células A2780 /AD tenían significativamente más lenta que la migración de las células A2780 (Fig. 4A y 4B). 15d-PGJ
2 reduce la migración de ambos tipos de células de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4C). Aunque 15d-PGJ
2 redujo la viabilidad celular en las células /AD A2780 a 2,5 M de concentración (Fig. 1C), no vimos la muerte celular en estos experimentos que podrían ser debido a la capa de células confluentes utilizada en estos experimentos. Hemos encontrado anteriormente que en la capa de células confluentes 15d-PGJ
2 no tuvo efecto sobre la viabilidad celular de A2780 /AD (datos no mostrados). La ausencia de muerte celular en estos experimentos es también evidente en las imágenes representadas (Fig. 4A). Los efectos inhibidores sobre la cicatrización de heridas También se observaron con BAY-11 a 7.082, pero no con ciglitazona que indica los efectos de 15d-PGJ2 podría ser debido a sus efectos inhibidores de NF-KB.
Para determinar los efectos de 15d- PGJ
2 sobre la migración celular, un ensayo de cicatrización de la herida se realizó en A2780 y A2780 células /AD como se describe en materiales y métodos. (A) imágenes representativo que muestra el cero (herida) en t = 0 h y t = 48 h con /sin diferentes tratamientos. Una marca (visualizada en estos cuadros de la parte superior o inferior) se colocó para localizar la misma área en el cero, se hicieron fotografías utilizando un microscopio invertido y el área abierta se calcula a los puntos de tiempo indicados. Magnificación, 40 ×. (B) El gráfico muestra el% de curación de las heridas en las células A2780 y A2780 /AD y sin tratamientos. A2780 células tenían una mayor tasa de migración en comparación con las células /AD A2780. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos diferentes. **
p Hotel & lt; 0,01 frente A2780 /AD. (C) El tratamiento con 15d-PGJ
2 y BAY-11-7082 inhibieron la respuesta después de 48 h de incubaciones de curación, mientras que ciglitazona no mostró efectos inhibitorios de la herida. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos diferentes. *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & Lt; 0,01 frente a los valores en t = 0 h
Efecto de 15d-PGJ
2 en la morfología celular
Durante las incubaciones con 15d-PGJ
2, nos dimos cuenta de que las células se transformaron en células agrandadas y alargadas. Este cambio fenotípico era lo más prominente visible en las células A2780 /AD dox-resistente. Estas células fueron detenidos inicialmente y encogidos, pero después de la transformación que alcanzaron más citoplasma con los límites celulares distintas y muestran una apariencia de tipo epitelial estructura (Fig. 5A). El tratamiento con ciglitazona o BAY-11-7082 indujo ningún cambio en la morfología celular indica que no hay papel de PPAR y NF-kappa B vías. Desde que se informó en la literatura que la tricostatina inhibidor de HDAC A podría transformar las células de carcinoma de ovario [13], las células tratadas con tricostatina A y encontramos que las células consiguieron transforman de una manera similar como con 15dPGJ
2 (Fig. 5A ). Aunque las células A2780 también parecía más estirados con 15d-PGJ
2 y tricostatina A, las diferencias frente a las células de control no eran grandes (Fig. 5B).
(A) Representante imágenes que muestran el cambio en la morfología de las células de A2780 /AD después de la incubación con 15d-PGJ
2 (2,5 M) y tricostatina A (70 nM). Por el contrario, otros tratamientos como la ciglitazona y BAY-11-7082 no afectaron a la morfología. Las flechas señalan las células transformadas que tenían más citoplasma y células epiteliales estructura. Magnificación, 200 × (B) Representante imágenes de células A2780 después de la incubación con diferentes tratamientos. El tratamiento con 15d-PGJ
2 (2,5 mM) y tricostatina A (70 nM) condujo a un claro aumento en el citoplasma. Magnificación, 200 × (C) Relación de caracol a la E-cadherina expresión génica en células A2780 y A2780 /AD. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos.
Desde la transformación de células podría estar relacionado con epitelio-mesenquimal proceso de transición (EMT), se analizó la expresión de Snail y e-cadherina y encontramos que las transcripciones la relación de caracol para la e-cadherina se aumentó en ambos tipos de células después de la exposición de 2,5 M 15d-PGJ
2, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Estos datos indican que el cambio en la morfología celular inducida por 15d-PGJ
2 podría ser debido a la inducción del proceso de EMT.
15d-PGJ inhibe la expresión de HDAC 1, 2 y 3 del ARNm
2
Dado que los efectos de transformación de células de 15d-PGJ
2 también fueron inducidos por el inhibidor de HDAC, se analizó el efecto de 15d-PGJ
2 en la HDAC en ambos tipos de células. En primer lugar, se compararon los niveles de mRNA de HDAC1, 2 y 3 en las células A2780 y A2780 /AD y encontramos que HDAC2 se downregulated significativamente en las células resistentes en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. 6A). El tratamiento con 15d-PGJ
2 inhibió la HDAC1, 2 y 3 expresiones de ARNm en ambos tipos de células dependiente de la dosis (Fig. 6B y 6C). Los efectos fueron más pronunciados en las células resistentes. Estas inhibiciones no fueron encontrados con ciglitazona y BAY-11-7082, sin embargo, se produjo un aumento en la expresión de HDAC1 después de la inhibición de NF-kB con BAY-117082
.
(A) en tiempo real qPCR datos muestran las diferencias entre los niveles basales de expresión de genes de HDAC 1, 2 y 3 en las células A2780 y A2780 /AD. **
p Hotel & lt; 0,05 frente a las células A2780. Efecto de diferentes tratamientos sobre los genes de HDAC se determinaron en A2780 (B) y las células A2780 /AD (C) después de 48 h de incubación. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. Las diferencias estadísticas en comparación con los respectivos controles se muestran como *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & lt; 0,01
15d-PGJ
2 inhibe las actividades de las enzimas HDAC SIRT1 y debido a sus átomos de carbono electrófilos
Como hemos constatado que 15d-PGJ
2 podría inhibir la expresión del gen de la SIRT1 y otros HDAC, nos preguntamos si 15d-PGJ
2 fue capaz de inhibir estas actividades enzimáticas directamente. Se utilizó un sustrato basado en la secuencia de p53 (-His-Lys-Lys Arg (e-acetil) -AMC) de ensayo para determinar la actividad de SIRT1 y para HDAC1 se utilizó un ensayo basado en sustrato de lisina acetilada. Con el fin de encontrar si el átomo de carbono electrófilo C9 es responsable de la actividad, se incluyeron la 15d-PGJ
2 analógica CAY-10410 que carece de la electrofilia en C9 (Fig. 7A). Se encontró que 15d-PGJ
2 inhibió la actividad de SIRT1 dependiente de la dosis con un máximo de 71% de inhibición, mientras que CAY-10410 sólo se mostró sólo una inhibición moderada de 23%, mientras que ciglitazona mostró ninguna inhibición en absoluto (Fig. 7B). En el ensayo enzimático HDAC1, 15d-PGJ
2 condujo a una inhibición del 40%, pero CAY-10410 y ciglitazona no mostró ninguna inhibición (Fig. 7C).
(A) Las estructuras químicas de 15d-PGJ
2 (15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2) y su análogo CAY-10410 (9,10-dihidro-15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2). El asterisco indica los átomos de carbono electrófilos que podrían estar implicados en la reacción de adición de Michael. El panel (A) y (B) muestran los efectos dependientes de la concentración de 15d-PGJ
2, CAY-10410 y ciglitazona sobre la actividad deacetilasa de SIRT1 y HDAC1, respectivamente, utilizando
in vitro
ensayos enzimáticos en.
#P & lt; 0,01 frente ciglitazona,
† p & lt; 0,05 y
†† p & lt; 0,01 frente CAY-10410. (D) Efecto de CAY-10410 sobre la viabilidad celular de las células A2780 y A2780 /AD según se mide con un ensayo de azul de alamar. (E) El tratamiento con CAY-10410 (2,5 M) no indujo la transformación de las células después de 48 h de incubación. Magnificación, 200 ×.
Además, examinó si los efectos de 15d-PGJ
2 fueron expuestas debido al átomo electrofílico C9, se probaron los efectos de CAY-10410, carente electrophilicity en C9 átomo de carbono, en la viabilidad celular y la transformación. Se encontró que CAY-10410 no hizo ninguna de inducir a la muerte celular o la transformación de las células (Fig. 7D y 7E).
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado los efectos de 15d -PGJ
2, un producto de la actividad de la ciclooxigenasa y como un agonista PPAR endógena, en apoptosis, resistencia a los medicamentos, la migración celular y la transformación de las células cancerosas. Hemos examinado sus efectos sobre el tipo silvestre, así como células de cáncer de ovario resistente a la doxorrubicina.