Extracto
Se estudia el potencial paliativo de dimetylthiourea (DMTU), un OH
• Trapper radical y N-acetilcisteína (NAC), un precursor del glutatión /H
2O
2 carroñero contra nanopartículas de dióxido de titanio (TiO
2-NP) y de paredes múltiples nanotubos de carbono (MWCNTs) inducida cito-genotoxicidad en cultivos de células de cáncer de pulmón humano A549-. Cytogenotoxicity fue inducida por la exposición de las células a concentraciones seleccionadas (10 y 50 mg /ml) de cualquiera de TiO
2-NPs o MWCNTs para 24 h. Los efectos anti-cytogenotoxicity de DMTU y NAC fueron estudiados en dos grupos, es decir, el tratamiento de 30 minutos antes de la agresión tóxica (exposición a corto plazo), mientras que el otro grupo recibió tratamiento DMTU y NAC durante la exposición nanopartículas, es decir, 24 h (a largo plazo exposición). Las investigaciones se llevaron a cabo para la viabilidad celular, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), micronúcleos (MN), y la expresión de marcadores de estrés oxidativo (HSP27, CYP2E1), genotoxicidad (P
53) y CYP2E1 dependiente nitrosodimethylamine- n- desmetilasa (NDMA-d) la actividad. En general, se encontró que el tratamiento tanto de DMTU y NAC para ser eficaz de manera significativa contra TiO
2-NPs y MWCNTs cytogenotoxicity inducida en células A549. El tratamiento a largo plazo de DMTU y NAC durante insultos tóxicos ha mostrado una mejor prevención de pre-tratamiento a corto plazo. Aunque, las células respondieron de manera significativa a ambos DMTU y NAC, pero las respuestas fueron específicas química. En parte, TiO
2-NP respuestas tóxicas inducidas fueron mediadas a través OH
• generación de radicales y la reducción en el sistema de defensa antioxidante. Mientras que en el caso de MWCNTs, los efectos adversos se debieron principalmente a la alteración /obstaculización del sistema antioxidante enzimático. Los datos indican la aplicabilidad de las células del cáncer de pulmón humano A549-como herramienta de preselección que permita determinar el blanco concreto potencial profiláctico y terapéutico de las moléculas de los fármacos candidatos contra daños celulares inducidos por nanopartículas
Visto:. Srivastava RK, Rahman Q, Kashyap MP, Lohani M, Pantalón AB (2011) efectos de mejora de Dimetylthiourea y N-acetilcisteína en nanopartículas inducida cito-genotoxicidad en células del cáncer de pulmón humano A549-. PLoS ONE 6 (9): e25767. doi: 10.1371 /journal.pone.0025767
Editor: Neeraj Vij, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 10 de mayo de 2011; Aceptado: 12 de septiembre de 2011; Publicado: 29 Septiembre, 2011
Derechos de Autor © 2011 Srivastava, et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero fue recibido del Consejo de Investigación Científica & amp; Industrial Research, Nueva Delhi, (SIP-08). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
interacciones biológicas intracelulares de nanopartículas de óxido de metal y los nanotubos de carbono se han demostrado en la literatura y marcado alarmante para la seguridad [1], [2]. nanopartículas de dióxido de titanio (TiO
2) -NPs nanotubos de carbono de pared múltiple y (MWCNTs) son conocidos para inducir respuestas citotóxicas y genotóxicas, tanto en
in vitro
[3], [4], [5] y yo
n vivo
modelos [6], [7]. En general, la generación de ROS mediada estrés oxidativo y alteración de estado antioxidante se ha sugerido como causa principal de la citotoxicidad y genotoxicidad de nanopartículas [8], [9], [10]. Además, el número de factores incluyendo el tamaño de partícula, la composición química y las cargas superficiales etc. también han jugar un papel para determinar la extensión de las nanopartículas de la toxicidad [11], [12], [13], [14]. Las nanopartículas inducen la generación de ROS por la activación de las enzimas del citocromo P450 de la familia [15], [16] y /o mediante la interrupción de la función de la cadena de transporte de electrones mitocondrial [9]. La asociación de la generación de ROS con los niveles inducidos de la proteína de choque térmico 27 (HSP27), el citocromo P450 2E1 (CYP2E1) y P
53 se han establecido como marcadores de la química inducida por el estrés oxidativo, la apoptosis y la genotoxicidad [10], [17] , [18].
Una de las maneras eficaces para prevenir la lesión celular mediada por ROS es la dieta o los productos farmacéuticos de aumento de captadores de radicales libres. Por lo tanto, se han hecho intentos para prevenir /restablecer las nanopartículas inducen cytogenotoxicity utilizando captadores de radicales, tales como desferoxamina [8], los antioxidantes - resveratrol [19] y N-acetlylcysteine (NAC) [4], [20], [21], en una variedad de sistemas de células de origen humano y animal. Sin embargo, los cambios en los niveles de expresión (ARNm y proteínas) de los marcadores implicados en el estrés oxidativo y la genotoxicidad en células cultivadas expuestas a las nanopartículas no han sido estudiados hasta ahora. Por lo tanto, las actuales investigaciones se orientaron a estudiar los conocimientos mecánicos de TiO
2-NP y MWCNTs estrés oxidativo inducido y cito-genotoxicidad en células de cáncer de pulmón humano A549 y efecto de mejora del cazador de radicales libres y antioxidantes DMTU y NAC, respectivamente. DMTU, fue seleccionada en el estudio, ya que este compuesto que contiene thiogroup tiene gran reactividad hacia OH
• radicales debido a las características donantes de electrones extremadamente favorables del grupo sulfhidrilo; por lo tanto, conocido como potencial barredor de radicales hidroxilo [22]. El otro compuesto usado es decir, NAC es un precursor del glutatión (GSH), es un importante antioxidante celular y sabe que juega un papel clave en la protección de las células contra el estrés oxidativo mediante la inhibición de la formación de H
2O
2 en condiciones in vitro [23]. NAC es también conocido por mejorar el nivel de GSH celular por la dirección de cistina en la vía de síntesis de GSH, porque cistina es un precursor común tanto de NAC y GSH [24].
Resultados
Caracterización de nanopartículas
los diámetros hidrodinámico medio del TiO
2-NP y MWCNTs suspensión en medio completo fueron 417,7 nm y 401,3 nm, y la zeta (zeta) potenciales se calcula como (-) 7,83 mV y (-) 14.4 mV, respectivamente (Figura 1 a (I, II) & amp; b (I, II)). Los estudios TEM muestran el rango de tamaño de partícula 5-20 nm de diámetro y 300-2000 nm de longitud de MWCNTs (datos ya han sido publicados por nosotros) [15]. TiO
2-NP (anatasa) que se utiliza en el estudio fueron de 99,7% de pureza y el tamaño de partícula oscila entre 5 a 25 nm en los estudios TEM. Las partículas se adhieren en la superficie celular entre las microvellosidades y pseudopodes, cuando se incubaron durante 24 h, posteriormente interiorizado en pequeñas vacuolas en el citoplasma cortical (Figura 2 a & amp; b). No se observó ningún cambio significativo en la partícula hidrodinámica (TiO
2-NP y MWCNTs) tamaño en presencia de DMTU y NAC durante la medición DLS. Después de la esterilización, la endotoxina no se detectó en ambos las nanopartículas mediante la prueba de LAL. El límite de detección fue de 0,03 UE /ml
La distribución de tamaño y potencial zeta de TiO
2-NP (a, I & amp; II). Y MWCNTs (b, I & amp; II) se determinaron utilizando dinámico dispersión de la luz y la dispersión de la luz análisis de fase (PALS) en un Zetasizer Nano-ZS, Modelo ZEN3600.
microfotografías TEM que muestra la internalización de TiO
2-NP (a, b) en el cáncer de pulmón humano células A549. Las flechas indican las nanopartículas se adhieren en la superficie celular entre las microvellosidades y pseudopodes dentro de unos minutos de tiempo (a) y posteriormente interiorizado en pequeñas vacuolas en el citoplasma de profundidad, cuando se observa a las 24 h (b).
restablecimiento de la viabilidad celular
la tendencia para la restauración de la viabilidad celular fue similar para todos los tres ensayos utilizados en el estudio. Sin embargo, se encontró que el ensayo de MTT a ser más sensible en comparación con los otros ensayos viz., NRU y liberado LDH. Los resultados de la restauración inducida DMTU o NAC en el porcentaje de viabilidad de las células A549 expuestas a nanopartículas se resumen en la Figura 3 a & amp; segundo. El corto plazo de tratamiento previo (30 minutos) de DMTU muestra la protección significativa de la viabilidad de las células A-549 expuestas a TiO
2-PN (10, 50 g /ml), mientras que la respuesta de NAC tratamiento previo no fue significativa contra TiO
2-NP pérdida de la viabilidad celular inducida. Las células que reciben a largo plazo (24 h) la exposición de DMTU (10 mM) o NAC (2 mM), junto con TiO
2-PN (10, 50 mg /ml) la exposición han mostrado más o menos similar magnitud y tendencias como se observa en la exposición a corto plazo (Figura 3 a). Contemporánea a esto, se encontró exposición a corto plazo de la NAC es significativamente efectivo contra la exposición MWCNTs, mientras que, DMTU no fue efectivo. La exposición a largo plazo tanto de NAC y DMTU ha mostrado tendencia similar y eficacia contra la exposición MWCNTs, al igual que en el caso de la exposición a corto plazo (Figura 3b). En la exposición término general, a largo de DMTU y NAC se ha mostrado poco mejor restauración de la viabilidad celular a corto plazo.
(a) en el grupo a corto plazo, las células fueron tratadas previamente con cualquiera de DMTU o NAC durante 30 minutos seguido de exposición de TiO
2-NPs (10 & amp; 50 mg /ml) durante 24 h. En el grupo A largo plazo, las células estaban recibiendo un co-exposición (24 h) de DMTU /NAC y TiO
2-PN (10 & amp; 50 mg /ml). Las células fueron entonces analizadas para DMTU /NAC restauración mediada en la viabilidad celular reducida debido a TiO
exposición 2-NPs. Todos los valores son la media ± S.E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs TiO
2-exposición PN). ## P & lt; 0,01 (TiO la exposición
2-NP Vs tratamiento DMTU /NAC). (B) En el grupo a corto plazo, las células se pre-trataron con cualquiera de DMTU o NAC durante 30 minutos seguido por la exposición de MWCNTs (10 & amp; 50 mg /ml) durante 24 h. En el grupo A largo plazo, las células estaban recibiendo un co-exposición (24 h) de DMTU /NAC y MWCNTs (10 & amp; 50 mg /ml). Las células fueron entonces analizadas para DMTU /NAC restauración mediada en la viabilidad celular reducida debido a la exposición MWCNTs. Todos los valores son la media ± S. E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs exposición MWCNTs). ## P & lt;. (Exposición MWCNTs Vs tratamiento DMTU /NAC) 0.01
generación de ROS
El estadísticamente significativa (p & lt; 0,01) se observó la generación de ROS en las células A549 que reciben TiO
2-NP y MWCNTs (10 & amp; 50 mg /ml) durante 24 h. Tanto a corto plazo (30 min) ya largo plazo (24 h) tratamiento de DMTU y NAC se ha encontrado para ser eficaz de manera significativa (p & lt; 0,01) en la disminución de los niveles de ROS. Sin embargo, la magnitud de la reducción de los niveles de ROS fue mayor en el tratamiento a largo plazo. El tratamiento a largo plazo de la NAC fue más eficaz que DMTU (Figura 4 a & amp; b). No se observó ningún aumento en la intensidad de fluorescencia debido a las nanopartículas en suspensión en el medio de cultivo (sin células). Del mismo modo, no se observó ningún incremento de fluorescencia con DCFH-DA tinte solo en el medio de cultivo (sin células). Las observaciones indican que las alteraciones en la intensidad de fluorescencia fueron debido intracelular de ROS generado en las células A549 solamente.
Generación
ROS se detectó usando '2, diacetato de 7-dichlorofluorescin colorante (DCFH-DA). (A) En el grupo a corto plazo, las células fueron pre-tratadas con cualquiera de DMTU o NAC durante 30 minutos, seguido por la exposición de TiO
2-PN (10 & amp; 50 mg /ml) durante 24 h. En el grupo A largo plazo, las células estaban recibiendo un co-exposición (24 h) de DMTU /NAC y TiO
2-PN (10 & amp; 50 mg /ml). Las células fueron entonces analizadas para DMTU /NAC restauración mediada en los niveles de ROS intracelular, que fue inducida por la exposición de TiO
2-NPs. Todos los valores son la media ± S. E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs TiO
2-exposición PN). ## P & lt; 0,01 (TiO la exposición
2-NP Vs tratamiento DMTU /NAC). El grupo de control positivo consistía en células A549 tratadas previamente (1h) con 500 M de H
2O
2. (B) En el grupo a corto plazo, las células se pre-trataron con cualquiera de DMTU o NAC durante 30 minutos seguido por la exposición de MWCNTs (10 & amp; 50 mg /ml) durante 24 h. En el grupo A largo plazo, las células estaban recibiendo un co-exposición (24 h) de DMTU /NAC y MWCNTs (10 & amp; 50 mg /ml). Las células fueron entonces analizadas para DMTU /NAC restauración mediada en los niveles de ROS intracelular, que fue inducida por la exposición de MWCNTs. Todos los valores son la media ± S. E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs exposición MWCNTs). ## P & lt; 0,01 (MWCNTs exposición Vs tratamiento DMTU /NAC). El grupo de control positivo consistía en células A549 tratadas previamente (1h) con 500 M de H
2O
2.
Citocinesis bloqueado ensayo de micronúcleos (CBMN-ensayo)
resultados de la formación de MN en células A549 se muestran en la Figura 5 a & amp; segundo. La exposición de ambos TiO
2 y MWCNTs induce número significativo de MN en células A549 en 24 h de exposición. En caso de TiO
2-PN, la respuesta fue dependiente de la dosis, es decir (12,66 ± 0,66 & amp; 17,33 ± 0,33) a las 10 & amp; 50 mg /ml, respectivamente, mientras que la dosis más baja de MWCNTs (10 g /ml) inducida más MN (16,00 ± 0,57) que la dosis más alta (50 mg /ml), es decir (13,66 ± 0,33). Tanto DMTU y NAC se encontró que eran eficaces en la reducción MN significativamente (p & lt; 0,01). La respuesta de DMTU fue mayor en contra de TiO
2-NP que MWCNTs, mientras que, NAC ha demostrado mejores resultados contra MWCNTs. Aunque, el efecto de ambos DMTU y NAC fueron estadísticamente significativas (p & lt; 0,01), pero los valores fueron todavía mayor que las células de control no expuestas a través de las concentraciones de exposición (Figura 5 A & amp; B). La diferencia en la inducción de MN era insignificante entre scavenger tratada Vs grupos tratados no scavenger
(a) Las células fueron expuestas a TiO
2-NPs (10 & amp; 50 mg /ml). Con o sin DMTU (10 mM) y NAC (2 mM) durante 24 h. metanosulfonato de etilo (6 mM) se utilizó como control positivo. Cada punto de datos representa la media de tres diapositivas. Se han anotado un total de 1000 células bi-nucleado (BN) con citoplasma bien definido. conjuntos paralelos también se llevaron a cabo en condiciones idénticas mediante la exposición de las células solamente con cualquiera de DMTU o NAC. Este grupo se utilizó para comparar los datos entre scavenger tratada Vs células no tratadas con limpiador. Todos los valores son la media ± S. E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs TiO
2-exposición PN). ## P & lt; 0,01 (TiO la exposición
2-NP Vs tratamiento DMTU /NAC). (B) Las células se expusieron a MWCNTs (10 & Amp; 50 g /ml) con o sin DMTU (10 mM) y NAC (2 mM) durante 24 h. metanosulfonato de etilo (6 mM) se utilizó como control positivo. Cada punto de datos representa la media de tres diapositivas. Se han anotado un total de 1000 células bi-nucleado (BN) con citoplasma bien definido. conjuntos paralelos también se llevaron a cabo en condiciones idénticas mediante la exposición de las células solamente con cualquiera de DMTU o NAC. Este grupo se utilizó para comparar los datos entre scavenger tratada Vs células no tratadas con limpiador. Todos los valores son la media ± S. E. de 3 experimentos
** P & lt;. 0.01 (control no expuesto Vs exposición MWCNTs). ## P & lt;. (Exposición MWCNTs Vs tratamiento DMTU /NAC) 0.01
Análisis de transferencia Western
En general, la exposición de ambos (TiO
2-NP & amp; MWCNTs ) a 50 mg /ml inducir significativa hasta la regulación de proteínas marcadoras de genotoxicidad y de estrés oxidativo, es decir, P
53 (3,61 ± 0,40 & amp;. 3,24 ± 0,26 veces), CYP2E1 (2,62 ± 0,30 & amp; 2,02 ± 0,39 veces) , HSP27 (1,69 ± 0,47 & amp; 2,56 ± 0,34 veces), respectivamente. se encontraron niveles de expresión de P
proteína de 53 a reducirse significativamente (p & lt; 0,01) tras el tratamiento tanto de DMTU y NAC. Sin embargo, la respuesta fue más intensa en las células A549 que reciben la exposición de TiO
2-NP. En caso de CYP2E1, las células expuestas a MWCNTs muestran una mejor respuesta a la DMTU y NAC con efectos más intensos de la NAC. Contrariamente a esto, el efecto de DMTU no fue significativa en las células expuestas a TiO
2-NPs. Sin embargo, tanto DMTU y NAC no podían restaurar la expresión de la proteína HSP27 de manera significativa en las células expuestas a TiO
2-NP /MWCNTs (Figura 6 a & amp; b).
A (i) Evaluación de la alterado expresiones de las proteínas implicadas en la inducción de estrés oxidativo (HSP27 y CYP2E1) y genotoxicidad (P
53) en las células A549 expuestas a TiO
2-NPs (50 mg /ml) durante 24 h. GAPDH se utilizó como control interno para normalizar los datos. Lane (1) el control no expuesto (2) 50,0 mg /ml TiO
2-NP (3) 50,0 mg /ml TiO
2-NP + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml TiO
2-NP + NAC (2 mM). (II) Cuantificación relativa (cambio) de las proteínas implicadas en la inducción de estrés oxidativo (HSP27 y CYP2E1) y genotoxicidad (P
53) en las células A549 expuestos a TiO
2-NP durante 24 h. GAPDH se utilizó como control interno para normalizar los datos. La cuantificación se realiza en el sistema de documentación de gel (Alpha Innotech, EE.UU.) con la ayuda de software AlphaEase
TM FC StandAlone V.4.0. Todos los valores son la media ± S. E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs TiO
2-exposición PN). ## P & lt; 0,01 (TiO la exposición
2-NP Vs tratamiento DMTU /NAC). b (I) Evaluación de expresiones alteradas de las proteínas implicadas en la inducción de estrés oxidativo (HSP27 y CYP2E1) y genotoxicidad (P
53) en las células A549 expuestas a MWCNTs (50 mg /ml) durante 24 h. GAPDH se utilizó como control interno para normalizar los datos. Lane (1) de control no expuesta (2) 50,0 mg /ml MWCNTs (3) 50,0 mg /ml + MWCNTs DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml MWCNTs + NAC (2 mM). (III) Cuantificación relativa (cambio) de las proteínas implicadas en la inducción de estrés oxidativo (HSP27 y CYP2E1) y genotoxicidad (P
53) en células A549 expuestas a MWCNTs durante 24 h. GAPDH se utilizó como control interno para normalizar los datos. La cuantificación se realiza en el sistema de documentación de gel (Alpha Innotech, EE.UU.) con la ayuda de software AlphaEase
TM FC StandAlone V.4.0. Todos los valores son la media ± S. E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs exposición MWCNTs). ## P & lt; (exposición MWCNTs Vs tratamiento DMTU /NAC) 0.01
dependiente de la actividad de CYP2E1 n- nitrosodimetilamina-desmetilasa (NDMA-d)
Los datos de CYP2E1 dependiente de la actividad catalítica. se presentan en la Figura 7. La actividad catalítica muestra tendencias similares como se observa en el análisis de transferencia western para la expresión de proteínas para CYP2E1 en las células expuestas a TiO
2-NPs y MWCNTs (50 g /ml). Estos cambios fueron significativos (p & lt; 0,001) en comparación con el grupo control no expuesto, así como con las células tratadas con DMTU /NAC únicamente es decir, 7,54 + 0,86 y 10,96 + 1,20 nmol /mg de proteína, respectivamente. Sin embargo, tanto los carroñeros muestran la restauración significativa de la actividad enzimática en las células expuestas a TiO2-PN y MWCNTs, pero la magnitud o la eficacia fue mayor en el caso de tratamiento con NAC. El tratamiento de DMTU o NAC sola no mostró ningún efecto sobre la actividad enzimática en comparación con el grupo control no expuesto. El etanol (10 mM), un conocido inductor de CYP2E1 muestra altamente significativa (p & lt; 0,001). Aumentar la actividad NDMA-d (Figura 7)
Todos los valores son media ± S.E. de 3 experimentos.
** P & lt; 0,01 (control no expuesto Vs TiO
2 -NPs /exposición MWCNTs). ## P & lt; 0,01 (TiO
2-NP /MWCNTs exposición Vs tratamiento DMTU /NAC). La actividad específica se expresa en la proteína nmol HCHO /min /mg. Etanol (100 mM), asociado a la inducción de CYP2E1, se utilizó como control positivo.
Discusión
especies reactivas de oxígeno (ROS) el estrés oxidativo mediado ha sugerido uno entre la tecla eventos desencadenantes del nanopartículas inducida cito-genotoxicidad [25]. También se observó una producción de ROS dependiente de la dosis en las células A549 o bien expuestos a TiO
2-NP o MWCNTs a las 10 & amp; 50 mg /ml durante 24 h. El ROS más importante en la señalización redox se piensa que es H
2O
2 /OH
• radical. Por lo tanto, para confirmar la señalización ROS redox, las células se expusieron a H
2O
2 (500 mM) durante 1 h bajo condiciones idénticas, que se sirve como control positivo también. H
2O
2 indujo respuestas similares para la producción de ROS como en el caso de las nanopartículas, lo que sugiere la implicación de las vías de transducción de señales similares. La reducción de ROS con pre /co-tratamiento de DMTU y NAC en células A549, confirmar aún más la participación de ROS en el proceso de la toxicidad y está de acuerdo con estudios anteriores [4], [8]. NAC, un precursor de glutatión (GSH), es un importante antioxidante celular y juega un papel importante en la protección de las células contra el estrés oxidativo e inhibe la formación de H
2O
2
in vitro
[ ,,,0],23], [26]. NAC tratamiento hace que la mejora del nivel de GSH celular por la dirección de cistina en la vía de síntesis de GSH, porque cistina es un precursor común tanto de NAC y GSH [24]. Mientras que la gran reactividad de la molécula hacia DMTU OH
• se debe a las características donantes de electrones extremadamente favorables del grupo sulfhidrilo [22].
En el presente estudio, la citotoxicidad de TiO
2-NPs y MWCNTs se encontró que era la dosis y dependiente del tiempo. En caso de TiO
2-PN, el tratamiento con NAC DMTU y reduce el efecto citotóxico, lo que sugiere que tanto el OH
• radicales (ROS) de generación y la reducción en el sistema de defensa antioxidante son responsables de la disminución de la viabilidad. Mientras que en caso de MWCNTs la citotoxicidad se redujo significativamente por el tratamiento NAC. Es de destacar que DMTU, un eliminador de radicales hidroxilo más específica, no fue eficaz en la eliminación de los radicales hidroxilo en nuestras mediciones. Esto, simplifica MWCNTs que causa toxicidad mediante la alteración /hampaering el sistema antioxidante enzimático y no mediante la inducción directa OH
• radicales en las células A549. Los resultados sugieren que la fracción de ROS que se inhibe por NAC, pero no por DMTU, podría ser una especie diferente de radicales libres y también la diferencia de comportamiento de ambos (TiO
2 y MWCNTs) podría ser debido a su diferencia en la estructura de la superficie [27], la duración [28], y la presencia de catalizador de metal [29], etc. también hemos informado anteriormente de que MWCNTs reducen significativamente los niveles de glutatión en dosis y la forma dependiente del tiempo [15]. Se ha postulado que la pérdida de GSH puede comprometer las defensas antioxidantes celulares y conducir a la inducción de ROS [30].
Además, el tratamiento NAC proporcionado suficientemente fuerte sistema de defensa antioxidante, dando como resultado el aumento de la viabilidad celular de las células expuestas a TiO
2 y MWCNTs. el mismo tipo de efecto se observó con epiteliales de pulmón humano y epitelio de las vías respiratorias (HEp-2) línea celular, cuando se co-tratado con antioxidante NAC y Resverartrol contra nanopartículas de CuO y ZnO, respectivamente [19], [21].
Ambos tipos de nanopartículas (TiO
2 y MWCNTs) se sabe que inducen micronúcleos (MN) en forma dependiente de dosis, que se biomarcador bien definido para el ensayo de genotoxicidad [31]. Nuestros hallazgos de la inducción MN son bien consistentes con estudios anteriores utilizando nano-TiO
2 en las células linfoblastoides [32], y en las células epiteliales del pulmón de rata expuestos a MWCNTs [33]. El efecto protector de DMTU (10 mM) y NAC (2 mM) sobre la inducción de MN se puede observar claramente en las presentes investigaciones (Figura 5 A & amp; B). Nuestros estudios MN fortalecer aún más el papel del estrés oxidativo en la genotoxicidad inducida por TiO
2-NP y MWCNTs en las células A549. En las anteriores fibras crocidoloite investigación y el amianto crisotilo también se han reportado para inducir MN, que disminuyen significativamente después del tratamiento con NAL, una sal sintetizada de N-acetilcisteína (0,2 mM) y DMTU (20 mM) en las células mesoteliales humanos [34].
En la investigación actual, se realizó el análisis de transferencia de Western para evaluar la expresión alterada de las proteínas tales como HSP27 y CYP2E1, indicadores de estrés oxidativo, y P
53 como un biomarcador de la genotoxicidad. proteínas de choque térmico (HSPs) comprenden varias familias diferentes de proteínas que son inducidos en respuesta a la amplia variedad de insultos fisiológicos y ambientales. Una de estas proteínas es HSP27, que se induce altamente durante condiciones de estrés. HSP27 se sabe para interferir con componentes clave ROS inducidos de vía de señalización de apoptosis, y se correlaciona con aumento de la supervivencia en respuesta a estímulos citotóxicos [18]. Nuestro estudio revela que en 50 concentración mg /ml, tanto las nanopartículas (TiO
2-NP y MWCNTs) indujo la expresión significativa de HSP27, lo que sugiere que las células estaban bajo estrés. El tratamiento de DMTU y NAC no mostraron alteraciones significativas en las nanopartículas inducidas expresión de HSP27. Se indica que cualquiera de las células están aún en condiciones de estrés o DMTU y NAC reducen el estrés oxidativo por alguna otra ruta en nuestras condiciones experimentales. Otros experimentos con diferente gama de puntos de tiempo, las concentraciones de exposición, etc., se están llevando a cabo para explorar la importancia de los niveles elevados de HSP27 en presencia de DMTU y NAC en las células expuestas a estas nanopartículas
.
La regulación al alza en el expresión de la proteína de CYP2E1 se ha correlacionado con la formación inducida de ROS, la elevación de la peroxidación lipídica y el daño citotóxico en hepatotoxcity inducida por alcohol [35], [36]. Presentamos el TiO
2-NP y MWCNTs indujeron la inducción de la actividad catalítica específica CYP2E1 NDMA-D y realizar obras de reforma por dos scavenges-DMTU y NAC en el cáncer de pulmón de células A549-humano. Para el conocimiento, las nanopartículas inducidos expresiones de proteínas y la actividad de CYP2E1 y los niveles posteriores inducidos de ROS se presentan por primera vez en el cáncer de pulmón de células A549 humano. niveles inducidos de expresión de la proteína y la actividad de CYP2E1 NDMA-d en las investigaciones actuales también apoyan nuestra conclusión anterior en las mismas células que MWCNTs inducen la generación de ROS por la actividad oxidasa de función mixta en lugar de interrupción mitocondrial [15]. Después de la exposición de TiO
2-NPs y MWCNTs, se observaron expresión y actividad de CYP2E1 inducida, que puede ser correlacionada con la inducción de ROS y el estrés oxidativo. Como nuestros datos de generación de ROS medida por DCFH-DA son así que corrobora con la inducción de CYP2E1. El mismo tipo de correlación entre la producción y CYP2E1 ROS siguiente a la exposición de monocrotofos, un pesticida organofosfato, en células PC12 También se ha informado recientemente [37]. Nos dieron una reducción significativa de los niveles de estrés oxidativo inducido por MWCNTs y CYP2E1 (expresión y la actividad) en presencia de DMTU y NAC, lo que confirma el papel de CYP2E1 en MWCNTs inducidas respuestas tóxicas. Mientras que en el caso de TiO
2-NPs, solamente NAC se ha encontrado eficaz en la reducción de la expresión y actividad de CYP2E1. Indica que el TiO
2-NP ejerció el estrés oxidativo predominantemente por H
2O
2 de producción y no radicales OH. Como es conocido DMTU para captar el OH
• radicales formados por la conversión de O
2
- en la presencia de hierro por una reacción de Haber-Weiss modificado [38]. También se informó de efectos similares, en presencia de sulfuro de dialil-(otro grupo compuesto que contiene tiol) en etanol expresión de CYP2E1 mediada en las células hepáticas polarizadas WIF-B [39].
En la investigación actual, los niveles de la expresión de proteínas de P
53 estaban bien correlativa con los datos obtenidos para la inducción de micronúcleos (MN). P
53 es uno de los marcadores moleculares de activación importantes para evaluar la genotoxicidad en caso de estrés oxidativo inducida por daño en el DNA [10]. El daño celular por ROS está vinculada positivamente con P
53 de activación, y la expresión inducida de P
53 proteína se ha sugerido como una herramienta para detectar el estrés oxidativo inducido cito-genotoxicidad [10]. Por lo tanto, los niveles elevados de P
53 proteína es una indicación de TiO
2-NPs y MWCNTs estrés oxidativo inducido por la genotoxicidad mediada. El tratamiento de la NAC DMTU y se encontró que era significativamente eficaz para reducir los niveles elevados de p
53 proteínas en las células TiO
2 y MWCNTs expuesto. Este efecto puede ser correlacionado con la fuerte anti-oxidante y anti-ROS actividad de DMTU y NAC observado en las presentes investigaciones, así como en otros estudios [34]. En un hallazgo similar por Mroz et al. [40] También se ha demostrado que la NAC bloqueado partículas impulsado p-Ser15-p
53 respuesta en las células A549.
En conclusión, las investigaciones actuales revelan que TiO
2-NP (10, 50 g /ml) y MWCNTs (10, /ml exposición 50 g) durante 24 h induce los marcadores de estrés oxidativo y la cito-genotoxicidad en las células A549. TiO
2-NP respuestas tóxicas inducidas se mediada principalmente a través de H
2O
2 generación, y la reducción del sistema de defensa antioxidante. Mientras que, en caso de MWCNTs, los efectos adversos se debieron principalmente a la alteración /obstaculización del sistema antioxidante enzimático. DMTU y NAC se encontraron para ser eficaces de manera significativa en la reducción de los niveles de los marcadores de estrés oxidativo y de genotoxicidad estudiados excepto HSP27.
Materiales y Métodos
Todos los productos químicos y reactivos especificados se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Company Pvt. Ltd. St. Louis, MO, EE.UU., a menos que se indique lo contrario. Todos los productos químicos y los reactivos utilizados fueron de la mayor pureza disponible
Nanopartículas preparación
TiO
2-NP (d. & Lt; 25 nm, área de superficie específica de 200-220 m
2 /g, 99,7% base pura de metales traza, tetragonal en el sistema cristalográfico, de forma esférica) sin ningún recubrimiento se adquirieron de Sigma Aldrich, EE.UU., (Cat no. 637254), mientras que los MWCNTs utilizados en este estudio fueron generosamente Regalado por Dieter g . Weiss, profesor del Departamento de Ciencias Biológicas, Instituto de Biología celular y Tecnología Biosystems, Universidad de Rostock, Alemania. La esterilización de las nanopartículas se lleva a cabo por calentamiento a 120 ° C durante 2 h y después se suspendió en medio completo DMEM-F12. Las soluciones madre (1 mg /ml) de las nanopartículas se sometieron a ultrasonidos para asegurar la suspensión uniforme antes de ser diluida con medio de cultivo utilizado para la exposición de las células [15], [41]. Antes de usar en los experimentos, tanto las nanopartículas se analizaron para la presencia de endotoxina bacteriana mediante la prueba de Limulus lisado de amebocitos (LAL).
Caracterización de nanopartículas
microscopía electrónica de transmisión.
La caracterización ultraestructural incluyendo la textura, el tamaño y la internalización hecho por Ludwig Jonas, el profesor, en el Departamento de Patología, Centro de microscopía electrónica, Facultad de Medicina, Universidad de Rostock, Alemania. En resumen, TiO
2-NP y MWCNTs se suspendieron en agua destilada y se dejó caer sobre rejillas de cobre recubierto de carbono película para microscopía electrónica de transmisión. El diámetro de TiO
2-PN y la longitud /diámetro de MWCNTs se midieron utilizando TEM Libra 120 (Carl Zeiss Oberkochen, Alemania) equipado con el software de análisis morfométricos (punto OSIS Münster Alemania). conjuntos paralelos de las células fueron expuestas a TiO
2-NPs y MWCNTs durante 24 horas a 37 ° C, se fijaron en glutaraldehído (4% en PBS) y se procesa para estudiar la fagocitosis y pinocitosis mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las imágenes fueron tomadas con distintos aumentos por 2K cámara proscan utilizando el elemento de software (OSIS Münster, Alemania).
dispersión de luz dinámica.
La distribución de tamaño y potencial zeta de TiO
2-NP y MWCNTs, por sí solo, así como en la presencia de DMTU y NAC, se determinaron mediante dispersión de luz dinámica y dispersión de la luz análisis de fase (PALS) en un Zetasizer Nano-ZS, Modelo ZEN3600 equipado con 4.0mW, láser de 633 nm (instrumentos Malvern Ltd. , Reino Unido) como se describe anteriormente por nosotros [15]
cultivo de células
células de cáncer de pulmón humano -. A549 (ATCC No. CCL-185TM) utilizado en el estudio se adquirieron originalmente del Centro Nacional