Extracto
microARN-30c (miR-30c) se ha notificado a ser un supresor tumoral en el cáncer de endometrio (CE). Demostramos que el miR-30c es el regulado en el tejido CE y es altamente expresado en los receptores de estrógenos (ER) células negativos al HEC-1-B. MIR-30c inhibe directamente la MTA-1 de expresión y funciona como un supresor de tumores a través de la vía de señalización de miR-30c-MTA-1. Por otra parte, el miR-30c se reduce a E
2 de tratamiento tanto en células de Ishikawa y ER-negativo HEC-1-B ER-positivo. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que el miR-30c es un importante miARN desregulado en la CE y podrían servir como un biomarcador potencial y nueva diana terapéutica para la CE
Visto:. Kong X, Xu X, Y Yan, Guo F , Li J, Hu Y, et al. (2014) el estrógeno regula el tumor supresor de los genes miARN-30c y su gen diana, MTA-1, en el cáncer endometrial. PLoS ONE 9 (3): e90810. doi: 10.1371 /journal.pone.0090810
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Agosto, 2013; Aceptado: February 4, 2014; Publicado: 3 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Kong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por seis Proyecto Cumbre Talento de la oficina de la provincia de Jiangsu de Personal (SW-021). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio (CE) es el tumor maligno más frecuente del tracto genital de la mujer en todo el mundo. El cáncer de endometrio comprende dos subtipos patogénicos diferentes. Los tumores de tipo I son los cánceres de bajo grado relacionados con el estrógeno endometrioide (CEE) que por lo general se desarrollan a partir hiperplasias endometriales complejos y atípicos en mujeres peri-menopáusicas. Por el contrario, los tumores de tipo II son cánceres no endometrioid agresivos (NEEC) que no están relacionados con la estimulación de estrógenos y que se desarrollan a partir del endometrio atrófico de las mujeres de edad avanzada. Las diferencias entre los dos subtipos de la CE conducen a diferentes tratamiento y el pronóstico [1].
La importancia de microRNAs (miRNAs), un tipo de ARN no codificante, se ha demostrado en el cáncer. Los genes que codifican mamíferos miRNAs se transcriben inicialmente como miRNAs primaria (pri-miRNAs), que son procesadas por los complejos enzimáticos Drosha y Dicer para convertirse en los precursores miRNAs (pre-miRNAs) y madura miRNAs [2]. Los miRNAs maduros son aproximadamente de 22 nucleótidos de longitud, las moléculas de ARN de cadena simple que regulan la expresión de sus genes diana por complementación imprecisa a las regiones 3 'no traducidas (UTRs), 5'-UTRs, e incluso secuencias de codificación de los ARNm para reprimir traducción en los animales [2] - [5]. El estrógeno (E
2) y el receptor de estrógeno (ER) han demostrado que modulan miRNAs como miR-125a [6] y miR-429 [7] en el útero de ratón, los genes miARN-20a y miARN-21 en normal del endometrio células epiteliales glandulares [8], let-7 familia, miR-27a, miR320 y miR-424 [9] en las células de la CE, el miR-104 [10], el miR-7 [11], el miR-21 [12], MIR -30C y miR-103 [13] en células de cáncer de mama, el miR-135b en las células de colon [14] y miR-203 en las células del músculo liso vascular [15]. Tomados en conjunto, estos resultados indican que E
2 y el juego ER papeles importantes en la regulación de los genes miARN.
Recientemente, la desregulación de miR-30c se ha informado no sólo para ser relevantes para la tumorigénesis y la progresión de muchos cánceres, tales como CE [16], [17], cáncer de ovario [18], [19], cáncer de mama [20] - [23], cáncer de pulmón [24], de células claras renal carcinoma de células [25], cáncer gástrico [26], cáncer de vejiga [27] y neuroblastoma [28], sino también para presentar un potencial implicaciones de diagnóstico y pronóstico, así como a representan un potencial objetivo terapéutico de la quimio y radioterapias para el cáncer [18], [29], [ ,,,0],30]. Actualmente, la metástasis asociada gen-1 (MTA-1) [17], KRAS [20], DLL4 [31], TWF1, vimentina [21], BCL9 [19], REDD1 [32], PAI-1 [33] y CTGF [34] han sido identificados como objetivos de miR-30c, y SERPINE1 [28], NYH11, GPRASP2 DDR2 [16], PPARGC1B, Makorin-3, UBAC1, PTPDC1 [22] snail1 [35], p53 [36] son objetivos potenciales que quedan por ser validado. Debido a que el miR-30c exhibe una disminución relativa en la expresión de endometrio normal a la hiperplasia atípica con el cáncer, y porque el papel de miR-30c en la CE sigue siendo desconocida, se llevó a cabo una investigación sobre el papel de miR-30c en la CE. Nuestros estudios previos han encontrado que los objetivos de miR-30c MTA-1, que está altamente expresado en CE [37] y funciona como supresor de tumores en líneas celulares de la CE [17]. Sin embargo, las funciones precisas de miR-30c y el MTA-1 en la CE no están claros. Por lo tanto, se realizó este estudio ampliado.
En este estudio, se evaluó la expresión de miR-30c en los tejidos de la CE y diferentes líneas celulares de la CE, investigarse más a fondo la relación entre el miR-30c y el MTA-1, validó el función supresora de tumores de miR-30c y exploró la regulación de miR-30c en las líneas celulares de la CE. Por lo tanto, hemos tratado de determinar la función de supresión tumoral de miR-30c, que definiría su valor potencial como una nueva diana terapéutica para el tratamiento de la CE.
Materiales y Métodos
Pacientes y tejidos muestras
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Nanjing Drum Tower hospital afiliado a la Universidad de Nanjing. Los sujetos del estudio fueron reclutados de los pacientes en el Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital de Nanjing Torre del Tambor, Escuela de Medicina de la Universidad de Nanjing en Nanjing, China. consentimiento informado por escrito se recibió de todos los participantes involucrados en el estudio. Todas las muestras se recogieron con el consentimiento informado de los pacientes y confirmado por el examen patológico. Todos los pacientes sufrían de tipo I CE y ninguno de ellos recibieron tratamiento preoperatorio, como la radioterapia o la quimioterapia. 21 muestras de tejido tumoral de la CE primarios se obtuvieron de los pacientes de la CE, y 14 muestras de tejidos endometriales normales se obtuvieron de las mujeres que se sometieron a histerectomías (laparoscópica o abdominal) para el tratamiento de otras enfermedades tales como mioma uterino o prolapso.
las líneas y los tratamientos con células CE
células
humano CE Ishikawa fueron amablemente proporcionados por el profesor LHWei (Pekín hospital Popular de la Universidad, china), y HEC-1-B se adquirieron de la Colección de la célula de Shanghai (Shanghai, china). Las células de Ishikawa se cultivaron en Dulbecco modificado de Eagle Medium (DMEM, Gibco, EE.UU.), y las células HEC-1-B se cultivaron en 5A medio de McCoy (Gibco, EE.UU.), ambos de los cuales fueron suplementados con suero bovino fetal 10% ( FBS, Gibco). Las células se mantuvieron en un CO 5%
2 atmósfera humidificada a 37 ° C. Para determinar la regulación de E
2, las células fueron tratadas con 17β-estradiol (E
2, 10
-8 M y 10
-10 M, Sigma, EE.UU.) durante 6, 12, 24 y 48 h en placas de 6 pocillos. Ishikawa y HEC-1-B células fueron co-tratados con el antagonista de ER fulvestrant (ICI 182780, 10
-8 M, Sigma, EE.UU.) y 10
-8 M o 10
-10 ME
2 durante 24 y 48 h, respectivamente.
transfección celular
Los imitadores (miR10000244) e inhibidor (miR20000244) de miR-30c, pequeños ARN de interferencia del MTA-1 (Si- sus respectivos oligonucleótidos scramble MTA-1, si-h-MTA1_001) y, imita-sc (miR01101), inhibidor-sc (miR02101), Sir-sc (siN05815122147), se han diseñado y sintetizado por Guangzhou RiboBio (Guangzhou, china). Todos los oligonucleótidos se transfectaron en las células utilizando Lipofectamine
TM 2000 (Invitrogen, EE.UU.) en medio Opti-MEM libre de antibióticos (Invitrogen, EE.UU.) según el protocolo del fabricante a una concentración final de 50 nM. Para las cotransfecciones, se usó 25 nM de cada oligonucleótido. El ARN total y las proteínas se extrajeron a las 48 h después de la transfección para su posterior análisis. -células no transfectadas Ishikawa en medio de cultivo también estaban preparados para servir como controles simulados.
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR)
El ARN total de los tejidos y las células se extrajo usando reactivo TRIzol (Invitrogen, EE.UU.). El RT imprimación tallo-bucle de miR-30c, cebadores de miR-30c, U6 y el MTA-1 para QRT-PCR se describe en nuestro estudio anterior [17]. La GAPDH, pri-miR-30c, y pre-miR-30c se diseñaron los cebadores de la siguiente manera: cebador directo GAPDH: TGAACGGGAAGCTCACTGG, cebador inverso GAPDH: TCCACCACCCTGTTGCTGTA; pri-miR-30c cebador directo: GCCCAAGTGGTTCTGTGTTT, cebador directo pre-miR-30c: ACCATGCTGTAGTGTGTGTAAACA, y el cebador inverso pri-miR-30c /pre-miR-30c: TCCATGGCAGAAGGAGTAAA. cDNA fue sintetizado a partir de ARN total por transcripción inversa utilizando el kit de reactivos PrimeScript ™ RT (Takara, Dalian, China). A continuación, QRT-PCR se realizó usando el kit SYBR ™ PrimeScript RT-PCR (Takara, Dalian, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles relativos de expresión de miR-30c y el MTA-1 se determinaron utilizando el método de análisis
-ΔΔCt 2; los niveles de GAPDH y U6 se utilizaron como controles internos para el MTA-1 y miR-30c, pri-miR-30c, pre-miR-30c.
se cosecharon
Western Blot
Las células y lisaron en radioinmunoprecipitación de ensayo (RIPA) de tampón de lisis (Sigma, EE.UU.) que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Las concentraciones de proteína de los lisados celulares totales se midieron usando el kit de ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, EE.UU.). Una cantidad igual (50 mg) de cada lisado celular se resolvieron mediante electroforesis en 10% de SDS-poliacrilamida geles (SDS-PAGE) y se transfirieron a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA), que fueron bloqueadas en TBST con 10% no grasa, leche en polvo. Las membranas se sondaron con un anticuerpo primario contra MTA-1 (1:500, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y un anticuerpo secundario peroxidasa de rábano (HRP) conjugado (1:5000, Bioworld Technology, EE.UU.). Las proteínas de interés se detectaron entonces usando un aumento de quimioluminiscencia (ECL) sistema de detección de transferencia (Millipore, Billerica, MA). GAPDH se utilizó como control de carga. La intensidad relativa de las bandas de destino se analizó usando Quantity One.
proliferación de las células de ensayo
La proliferación celular se analizó utilizando un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 10
3 células /pocillo) directamente o a 24 h después de la transfección y se incubaron durante 24, 48, 72 y 96 h, respectivamente. Después de la incubación con 25 l de MTT (5 mg /ml, Sigma, EE.UU.) a 37 ° C durante 4 h, se eliminaron los sobrenadantes, y 150 l de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma, EE.UU.) se añadió a cada pocillo. El valor de la absorbancia (DO) de cada pocillo se midió a 490 nm. Para cada condición experimental, se utilizaron 6 pocillos, y el experimento se realizó por triplicado.
migración celular y la invasión de ensayo
migración celular se midió usando un ensayo de cicatrización de heridas. Las células transfectadas fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta confluencia. Las heridas se hicieron usando una punta de pipeta de p10, y las células se lavaron con PBS para eliminar los desechos y células desprendidas. Después las células se incubaron en medio libre de suero durante otro 24 o 48 h. Se observaron los huecos individuales y se fotografiaron usando un microscopio invertido a los 0, 24 y 48 h en la misma posición de la herida.
ensayos de la invasión de células se realizaron en 24 pocillos, cámaras de invasión recubiertos con Matrigel. A las 48 h post-transfección, 2 × 10
se añadieron 4 células en 0,2 ml de suero libre de DMEM a las cámaras superiores (8-m, Millipore), que se recubrieron con 30 matrigel l (BD Bioscience, San Jose , CA), y 0,6 ml de 10% de FBS-DMEM se añadió como el quimioatrayente a la cámara inferior. Las células se incubaron a 37 ° C durante 24 h, después de lo cual, las células no invasoras se eliminaron con hisopos de algodón. Las células invasoras se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Las células se contaron en 5 campos de alta potencia al azar a 200 × magnificación por pocillo. El experimento se realizó por triplicado.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, EE.UU.). Los valores se presentan como las medias ± SD. Se utilizó la prueba t de Student para comparar los valores de las muestras de ensayo y de control. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se examinaron para la significación estadística mediante ANOVA de una vía. El nivel de significación estadística fue designado como P. & Lt; 0,05
Resultados
Tarjetas telefónicas
Se ha reportado la expresión de miR-30c y el MTA-1 en muestras de la CE y líneas celulares de miR-30c para exhibir relativamente disminución de la expresión de endometrio normal a hiperplasia atípica para el cáncer [16] y para funcionar como un supresor de tumor en líneas celulares de la CE [17]. Sin embargo, otros estudios han demostrado que el miR-30c juega un papel en la CE. Por lo tanto, lo primero que investigó la expresión relativa de miR-30c entre las muestras de tejido en este estudio. Nuestros análisis de QRT-PCR mostró que el miR-30c se redujo significativamente en las muestras de la CE (Fig. 1A), lo que sugiere que el miR-30c juega un papel en la incidencia de la CE.
(A). MiR-30c se redujo en 21 muestras de la CE en comparación con 14 NE muestras, como se indica por el análisis de QRT-PCR. Cada muestra se evaluó por triplicado. (SEGUNDO). MiR-30c fue altamente expresado en células de HEC-1-B en comparación con las células de Ishikawa, como se indica por el análisis de QRT-PCR. (C) y (D). La expresión de MTA-1 se redujo en las células HEC-1-B en comparación con las células de Ishikawa en el los niveles de proteína (D) mRNA (C) y. Cada barra representa los valores medios ± SD de tres experimentos independientes. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
Seguidamente, evaluó la expresión de miR-30c en diferentes líneas celulares. células ER-positivos Ishikawa y células HEC-1-B ER-negativos representan modelos de tipo I y tipo II CE, respectivamente. Nuestro análisis de QRT-PCR reveló que miR-30c es altamente expresado en células de HEC-1-B en comparación con las células de Ishikawa, por 1,79 veces (Fig 1B.), Lo que sugiere que la expresión de miR-30c se correlaciona con ER o E
2. A continuación, se evaluaron los niveles de MTA-1 de expresión en diferentes líneas celulares y encontramos que es altamente expresado en células de Ishikawa, tanto en los niveles de proteína (Figura 1C y 1D) y ARNm. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican una correlación negativa entre el miR-30c y el MTA-1, coherente con nuestra anterior conclusión de que el miR-30c se dirige MTA-1.
Variación de la expresión de miR-30c modula la expresión de su objetivo gen, MTA-1, en células EC
previamente demostrado que los objetivos de miR-30c MTA-1 transcripciones de mRNA en el Ishikawa y líneas de células HEC-1-B usando un ensayo indicador de luciferasa. Para dilucidar a fondo la relación entre el miR-30c y el MTA-1, se utilizó el miR-30C-imita y miR-30c-inhibidor para restaurar y para reducir la expresión de miR-30c, respectivamente. Además, se utilizó Sir-MTA-1 para derribar MTA-1 en células de Ishikawa.
La expresión de miR-30c en las células Ishikawa fue hasta reguladas por 23,14 veces y las reguladas por 0.043 veces por transfección con miR-30C-imita y miR-30c-inhibidor, respectivamente (figura 2A). Tras la suficiente eficiencia de la transfección, se encontró que la MTA-1 de expresión se redujo significativamente cuando se restauró el miR-30c y que la reducción de miR-30c hasta regulados por el MTA-1 de expresión (Figura 2B).
(A) . La eficiencia de la transfección de células de Ishikawa se evaluó mediante qRT-PCR a las 48 h después de la transfección de miR-30C-imita y miR-30c-inhibidor, que se muestran como factores de cambio en relación con sus controles revueltos. (SEGUNDO). MTA-1 expresión de la proteína se determinó mediante análisis de transferencia Western a las 48 h después de la transfección con miR-30C-imita, miR-30c-inhibidor y sus controles revueltos. (DO). La co-transfección con un inhibidor de miR-30c, MTA-SIR-1, se efectuó y sus controles revueltos, y el MTA-1 expresión de la proteína se determinó mediante análisis de transferencia Western. (D y E). SiR-MTA-1 reduce MTA-1 expresión en los niveles de proteína (E) mRNA (D) y a las 48 h después de la transfección. (F). QRT-PCR análisis muestra un aumento en la expresión de miR-30c después se inhibió MTA-1 de expresión. Cada barra representa los valores medios ± SD de tres experimentos independientes. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
En los experimentos de cotransfección, se encontró que los inhibidores de miR-30c y Sir-MTA-1 desempeñaron de manera antagónica en la regulación del MTA-1 (Fig 2C). Junto con la observación de que SIR-MTA-1 suppresseed la expresión de MTA-1 tanto en el ARNm y los niveles de proteína (Fig 2D y 2E), creemos que miR-30c de hecho regulados negativamente MTA-1. Curiosamente, la represión de la MTA-1 de expresión por Sir-MTA-1 dio como resultado un aumento de la expresión de miR-30c (Figura 2 F).
En conjunto, se confirmó que el miR-30c reprimida directamente MTA-1 expresión y que una retroalimentación de bucle está presente entre ellos. Aunque se necesitan más estudios para explorar el mecanismo específico que subyace en su regulación por retroalimentación de bucle, estos resultados apoyan la noción de que el miR-30c podría funcionar mediante la inhibición de la MTA-1 en la CE.
miR-30c regula la proliferación celular, la migración y la invasión de la CE
a medida que nuestro estudio previo ha demostrado, la expresión ectópica de miR-30c puede inhibir la proliferación de células CE, la migración y la invasión [17]. Aquí, hemos proporcionado evidencia adicional para confirmar estos efectos en las células de Ishikawa. La expresión ectópica de miR-30c inhibe la proliferación celular en un ensayo de MTT. La viabilidad de transfectada fue reprimida (Fig 3A) y la proliferación celular relativa se redujo a 72 y 96 h después de la transfección (Fig 3B). En cuanto a la migración y la invasión, hemos realizado una cicatrización de heridas y un ensayo transwell. La transfección de miR-30C-imita disminuyó migración y la invasión en comparación con el imita-sc, como se muestra en la figura 3C y 3D. Por otro lado, las capacidades de la proliferación celular, la migración y la invasión se mejoraron siguiente las células se transfectaron con miR-30c-inhibidor (Fig 3A -3D).
(A). Un ensayo MTT muestra que imita el miR-30c suprimen la viabilidad celular (superior), mientras inhibidor de miR-30c promovió la viabilidad celular (inferior). (SEGUNDO). MIR-30c-imita reduce la proliferación celular relativa (superior), mientras que el miR-30c-inhibidor aumenta la proliferación celular relativa (inferior), respectivamente, a las 72 y 96 h después de la transfección. (DO). fotografías representativas del ensayo de cicatrización de heridas que muestran la capacidad migratoria de las células transfectadas a las 0, 24 y 48 h después de la herida. (RE). fotografías representativas de la invasión de células en un ensayo transwell. El número medio de células se contó a partir de 5 campos microscópicos aleatorias (x 200). Los valores mostrados son los valores medios ± desviación estándar de la invasión de células relativo. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
Por lo tanto, la variable expresión de miR-30c provocó diferentes efectos sobre las características malignas de las células de Ishikawa. Creemos que el miR-30c actúa como un supresor de tumores al influir en la proliferación, la migración y la invasión de las células de la CE.
Funciones de miR-30c como un supresor de tumores a través de la miR-30c-MTA-1 vía de señalización
Hemos determinado anteriormente que los objetivos de miR-30c MTA-1, que se sobreexpresa en la CE [37] y que actúa como un oncogen en muchos tumores humanos [38], [39]. Sin embargo, la función de MTA-1 en la CE se mantuvo sin definir. Por lo tanto, se investigó si las funciones de miR-30c a través de la vía de señalización de miR-30c-MTA-1. La represión de la MTA-1 por Sir-MTA-1 inhibe la proliferación de células de Ishikawa, como se indica por los resultados de MTT (Fig 4A). Por otra parte, la pérdida de MTA-1 también reduce la migración celular y la invasión, como se indica por nuestra cicatrización de heridas y los resultados del ensayo Transwell (Fig 4B y 4C). Estos resultados revelaron que la MTA-1 juega un papel pro-carcinogénico en las células de la CE mediante la regulación de la proliferación, la migración y la invasión de las células de Ishikawa. Debido a que el miR-30c puede reprimir directamente la expresión del MTA-1, y porque MTA-1 es un oncogén, en CE, creemos que las funciones de miR-30c como un supresor tumoral por la orientación MTA-1.
(A ). Un ensayo MTT muestra la viabilidad celular (izquierda) y la proliferación celular relativa (derecha) fueron reprimidos por la transfección de Sir-MTA-1 a las 72 y 96 h. (SEGUNDO). fotografías representativas del ensayo de cicatrización de heridas muestran la capacidad migratoria de las células transfectadas a las 0, 24 y 48 h después de la herida. (DO). fotografías representativas de la invasión de células en un ensayo transwell. El número medio de células se contó a partir de 5 campos microscópicos aleatorias (x 200). Los valores mostrados son los valores medios ± desviación estándar de la invasión de células relativo. (D) y (E). La co-transfección de miR-30c-inhibidor y Sir-MTA-1; cotransfección de miR-30c-inhibidor y SIR-sc sirvió como control. (RE). En comparación con la transfección de control, la viabilidad celular (superior) y la proliferación celular relativa (inferior) fue suprimida en 96 h. (MI). fotografías representativas de la invasión de células en un ensayo transwell. El número medio de células se contó a partir de 5 campos microscópicos aleatorias (x 200). Los valores mostrados son los valores medios ± desviación estándar de la invasión de células relativo. Las diferencias de la proliferación celular relativa entre los grupos apareció a las 96 h después de la transfección. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
Para extender nuestro estudio, cotransfected miR-30c-inhibidor y Sir-MTA-1 en células de Ishikawa y se encontró que la reducción de la MTA -1 atenuada proliferación celular y la invasión mediado por miR-30c-inhibidor en comparación con el grupo control transfectadas (Fig 4D y 4E). Nuestros resultados sugieren que la función de miR-30c depende de MTA-1 y se validan la existencia de MIR-30c-MTA-1 vía de señalización.
El estrógeno regula a la baja la expresión de miR-30c en las células de la CE
Después de haber demostrado la capacidad supresora de tumores de miR-30c, el próximo investigó la regulación de miR-30c. La diferencia en la expresión de miR-30c entre las células Ishikawa ER-positivos y negativos ER-células HEC-1-B sugiere que E
2 y ER podría jugar un papel importante en la regulación de miR-30c. Por lo tanto, se investigó si los cambios de expresión de miR-30c en E
2 tratamiento.
En comparación con el control en blanco, la expresión de miR-30c fue marcadamente reducido regulado de una manera tiempo y dependiente de la dosis a los 6, 12, 24 y 48 h sobre 10
-8 M y 10
-10 ME tratamiento
2 de Ishikawa células ER-positivo (figura 5A). Las alteraciones en la expresión de miR-30c inducidos por E
2 de tratamiento fueron en parte revertido por el tratamiento concomitante con ICI182780 en las células de Ishikawa (figura 5B). Además de la E
2 represión inducida por el tratamiento de miR-30c, pri-miR-30c y pre-miR-30c también fueron regulados hacia abajo (figura 5C), lo que sugiere que E
2-ER puede inhibir la transcripción de miR-30c en las células de Ishikawa.
(a). MIR-30c se redujo tras el tratamiento con 10
-8 M y 10
-10 M E
2 a los 6, 12, 24 y 48 h después del tratamiento mediante análisis de QRT-PCR en las células de Ishikawa. El tratamiento con 10
-8 M E
2 ejerce una inhibición más significativa, excepto a las 48 h. (SEGUNDO). 10
-8 M ICI182780 revirtió parcialmente la reducción de los niveles de miR-30c inducida por el tratamiento con 10
-8 M y 10
-10 M E
2 a las 24 h después de co-tratamiento en las células de Ishikawa. (DO). los niveles de pre-miR-30c se redujeron en E
2 de tratamiento tanto en las células HEC-1-B (superior) y de Ishikawa. niveles 30c-pri-miR se redujeron en E
2 en el tratamiento de Ishikawa, pero no en las células HEC-1-B (inferior). (RE). los niveles de miR-30c se redujeron a 10
-8 M y 10
-10 ME
2 de tratamiento a los 6, 12, 24 y 48 h después del tratamiento mediante análisis de QRT-PCR en las células HEC-1-B . El efecto de las dos concentraciones difería a las 12 h después del tratamiento. (MI). 10
-8 M ICI182780 no reducción de los niveles de miR-30c inducida por el tratamiento con 10
-8 M y 10
-10 ME
2 a las 48 h después del tratamiento concomitante en HEC-1 reversa -B células. (F). El tratamiento con 10
-8 ME
2 hasta reguladas expresión de ARNm de MTA-1 tanto en las células de Ishikawa y células HEC-1 a las 24 y 48 h, respectivamente, un efecto que fue revertido por el cotratamiento con 10
-8 ICI182780 M en las células de Ishikawa (superior), pero no las células HEC-1-B ((inferior) (* P & lt;. 0,05, ** P & lt;. 0,01) guía empresas
sin embargo , encontramos que E
2 también redujo los niveles de expresión de miR-30c en las células HEC-1-B ER-negativo (figura 5D). era esperable que la inhibición de la expresión de miR-30c por E
tratamiento 2 fue no bloqueado por ICI182780 en células de HEC-1-B (Fig 5E). a diferencia de las células de Ishikawa, E
2 sólo redujo la expresión de pre-miR-30c pero no pri-miR-30c en las células HEC-1-B (figura 5C), lo que sugiere que E
2 debería inhibir la maduración de miR-30c de manera ER-independiente.
Además, E
2 hasta reguladas expresión de la MTA-1 mRNA tanto en células HEC-1-B Ishikawa y, un efecto que fue revertido por ICI182780 en las células Ishikawa sólo a la concentración y el tiempo seleccionado (Fig 5F). Esto podría atribuirse a cualquiera de la reducción de miR-30c inducida por el tratamiento con E
2 u otro como de la vía de señalización aún no identificado.
En conjunto, nuestros resultados indican que E
2 representa una factor regulador de la expresión de miR-30c, que funciona en ambos modos ER-dependiente y ER-independientes. Sin embargo, el mecanismo molecular subyacente exacto por el que E
2 regula la expresión de miR-30c requiere estudios más detallados.
Discusión
La desregulación de miRNAs en el cáncer puede promover la angiogénesis, el crecimiento ventaja, la invasión de tejidos y la metástasis. Sin embargo, nuestra comprensión de la expresión aberrante y posibles funciones de miRNAs en el cáncer sigue siendo limitada. MIR-30c, un miembro de la familia de miR-30, se ha demostrado que las reguladas en la CE en los análisis de microarrays [16] y en el cáncer de mama [23] en comparación con los tejidos normales, pero hasta reguladas en el cáncer de ovario en comparación con benigna o tumores borderline de ovario [18] y en el mesotelioma células [29]. MiR-30c también puede servir como un biomarcador potencial debido a su desregulación en diferentes subtipos y etapas malignas de tumores incluyendo cáncer de mama [21], cáncer de ovario [18] y el mesotelioma [28], [29]. Por otra parte, el aumento de la expresión de miR-30c se correlaciona con un pronóstico favorable y la eficacia clínica de la terapia con tamoxifeno en el cáncer de mama [22], así como una mayor supervivencia libre de progresión en el carcinoma renal de células claras [25], pero una peor supervivencia en el mesotelioma maligno [29] y resistencia a la quimioterapia en el cáncer de pulmón [24]. En particular, en lo que respecta a la función de miR-30c en la resistencia quimioterapéutico en el cáncer de ovario, Eitan et al. y Sorrentino et al. hipótesis contrastantes han hecho [40], [41]. Los resultados controvertidos en relación con el miR-30c confirman su papel importante en la génesis tumoral y la progresión, independientemente de su naturaleza exacta carcinogénico o tumor supresor.
En este estudio, se investigó el papel de miR-30c en la CE. Encontramos que el miR-30c se había reducido regulado en muestras de la CE en comparación con las muestras normales, como se indica por QRT-PCR análisis, en consonancia con el anterior análisis de microarrays por Boren et al [16]. Por desgracia, no teníamos suficientes casos para valorar la desregulación de la expresión de miR-30c entre los diferentes subtipos y características clínico-patológicas. Nuestros estudios futuros tendrán como objetivo para dilucidar esta cuestión. Sin embargo, se encontró que la expresión de miR-30c fue mayor en una línea de células ER-negativo, lo que implica que el miR-30c podría correlacionar con E
2 y ER, así como con los subtipos específicos de la CE.
para extender nuestro estudio anterior, hemos examinado a fondo la relación entre el miR-30c y el MTA-1. Previamente, se realizó un ensayo indicador de luciferasa que demostró la 3'-UTR de MTA-1 blanco de miR-30c. Por otra parte, hemos demostrado que la expresión excesiva de miR-30c disminuyó MTA-1 de expresión en el mRNA y los niveles de proteína en las células HEC-1-B [17] Ishikawa y. En este sentido, no sólo restauró sino que también redujo la expresión de miR-30c y se evaluaron los cambios resultantes en la MTA-1. Utilizamos las células de Ishikawa sólo en este estudio debido a que el miR-30c funcionaba igual en las dos líneas de células en nuestro estudio anterior. Los resultados de este estudio son consistentes con los de nuestro estudio anterior, y también encontraron que Sir-MTA-1 y el inhibidor de miR-30c trabajaron de una manera antagónica. Como se verificó la represión directa del MTA-1 por Sir-MTA-1, hemos sido capaces de deducir una relación funcional entre el miR-30c y el MTA-1. Sorprendentemente, también identificó un bucle de retroalimentación en el que la represión de la MTA-1 aumentó los niveles de miR-30c, un efecto de retroalimentación que también ocurrió con el miR-145 y su gen diana, Oct4 [42]. MIR-30c se había informado anteriormente a desempeñar un papel en la supresión de la proliferación celular tumoral, metástasis y la resistencia a los medicamentos por la orientación BCL9 [19], TWF1, vimentina [21] y KRAS [20]. En este estudio, hemos confirmado que el miR-30c-MTA-1 vía de señalización representa un mecanismo funcional por el cual el miR-30c suprime la CE. Sin embargo, miRs por lo general trabajan en la regulación de múltiples objetivos y no podía decir que no hay otra vía de señalización de trabajo por el miR-30c en la CE.
En la actualidad, la regulación de miRNAs es un tema que ha cosechado el aumento atención. Onconasa [43], ácido lisofosfatídico (LPA) [19], y el EGF y receptores MET [24] se ha informado de modular la expresión de miR-30c. Teniendo en cuenta la expresión diferencial de miR-30c entre las líneas celulares de la CE ER-positivos y negativos ER-utilizadas en nuestro estudio y la relación entre la CE y E
2, elegimos para examinar E
2 como regulador candidato la expresión de miR-30c.
En la CE, el miR-206 [44] y la familia let-7 de miRNAs [9] se correlacionan con e
2 y ER, ya sea por la orientación ER o por estar sujeta a la modulación por E
2. La modulación de miRNAs por E
2-ER se ha demostrado definitivamente [45]. Yamagata et al [6] indicó que ER, no ERβ, que inhibe la maduración de miRNAs mediante la prevención de la pri-miARN-a-pre-miARN conversión. Esta interacción se produce a un nivel postranscripcional a través de su asociación con Drosha y p68 /p72, que puede ser activado por E
2. Sin embargo, incluso en ausencia de E
2, una asociación física entre ER y Drosha se sigue produciendo, posiblemente teniendo en cuenta la supresión de miR-30c en las células de Ishikawa en comparación con las células HEC-1-B que hemos observado en este estudiar. Otro estudio reciente sugiere que ER suprimió la expresión de miR-140 en el nivel transcripcional mediante la unión a un elemento promotor específico (-79 /-50) de miR-140 [10]. A excepción de ER, ERβ [14] y Dicer [13] También se informó a ser relevante en términos de E
2 en la regulación de miRNAs. Sin embargo, todos estos resultados se derivaron de células MCF-7 de mama. Por lo tanto, sugerimos que se quieren más estudios sobre el mecanismo en las células de la CE.
Nuestro estudio demostró que E
2 regulada negativamente miR-30c y indujo su gen diana, MTA-1, en las células de la CE, un regulador efecto que también fue exhibida por miR-140 y su gen diana, SOX2, en células de cáncer de mama [10]. La inducción de la MTA-1 por E
2 en las células de la CE podría atribuirse a una disminución en el miR-30c o para la estimulación directa por E
2, los cuales requieren más estudios.
por el contrario, un estudio ha demostrado que el miR-30c está regulado por E
2 en ER-positivo de cáncer de mama MCF-7cells [13], lo que demuestra los diferentes mecanismos moduladores por la que E
2 regula el miR-30c en diferentes células cancerosas.