Extracto
Antecedentes
La identificación de nuevos marcadores de pronóstico para el cáncer de próstata es muy justificado, ya es difícil identificar a los pacientes que requieren un tratamiento curativo. Los datos de ambos modelos experimentales y muestras clínicas han identificado las funciones importantes de PDGFRß en pericitos y fibroblastos en el estroma tumoral.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio la importancia pronóstica de PDGFRß en el cáncer de próstata estroma, y en el tejido no maligno emparejado, se evaluó con inmunohistoquímica. expresión PDGFRß se analizó en estroma normal y tumor de más de 300 pacientes con cáncer de próstata. La expresión de alto PDGFRß en el estroma tumoral se asoció con el tamaño tumoral, estadio avanzado, la puntuación de Gleason alta y alta densidad de los vasos. tinción perivascular PDGFRß en los tumores también se correlaciona con la puntuación de Gleason alta. También se observaron correlaciones entre el estado PDGFRß en el estroma del tumor y el estroma no maligno. Del mismo modo, la expresión de alto PDGFRß en el estroma de tejido no maligno adyacente correlacionado con el tamaño tumoral, estadio avanzado, alta puntuación de Gleason y la proliferación en el epitelio no maligno. Curiosamente, los altos niveles de PDGFRß en el estroma de tejido tumoral y no malignas se asociaron con la supervivencia específica del cáncer más corto en pacientes con cáncer de próstata.
Conclusiones /Importancia
El estudio reveló una serie de novela asociaciones entre la expresión del estroma PDGFRß en los tumores de próstata y varias características clínicas importantes, incluyendo la supervivencia
Visto:. Hägglöf C, Hammarsten P, Josefsson a, Stattin P, Paulsson J, Bergh a, et al. (2010) del estroma PDGFRß expresión en tumores de próstata y el tejido de la próstata no maligno de la próstata predice la supervivencia del cáncer. PLoS ONE 5 (5): e10747. doi: 10.1371 /journal.pone.0010747
Editor: Por Westermark, Universidad de Uppsala, Suecia |
Recibido: March 3, 2010; Aceptado: 30 de abril de 2010; Publicado: 20 de mayo de 2010
Derechos de Autor © 2010 Hägglöf et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por subvenciones sin restricciones de una subvención a la red Linna STARGET del Consejo y subvenciones de la Sociedad de cáncer de Suecia y Konung Gustaf Vs Jubileumsfond de Investigación sueco. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
comportamiento del tumor es, en general, en gran medida gobernada por las características del estroma tumoral. En el caso de cáncer de próstata Esto está bien ilustrado por una serie de estudios recientes que han identificado características del estroma y marcadores con significado pronóstico y la respuesta-predicativa.
tumores con la alteración más pronunciada en la morfología de estroma, que se caracteriza por una pérdida importante de células del músculo liso y el aumento de fibroblastos, miofibroblastos, y fibras de colágeno (reactivo de grado estroma 3), tiene un mal resultado en comparación con aquellos con un estroma morfológicamente más similar a la que en el tejido normal de la próstata, es decir, los grados de estroma reactivos 1 y 2 [1]. Estudios recientes también han demostrado que los cánceres de próstata se caracterizan por la pérdida de los receptores de andrógenos (AR) en el [2] estroma. Una baja frecuencia de AR del estroma se acopló a un aumento de la puntuación de Gleason, la metástasis, la mala respuesta a la terapia de castración y un resultado desfavorable. Además, las características del estroma, tales como la angiogénesis, la acumulación de macrófagos, linfocitos y mastocitos, así como cambios en la matriz extracelular se han relacionado con las variaciones en el comportamiento del tumor de próstata [3], [4], [5], [6], [7]. En particular, también se ha observado que los efectos del campo del cáncer y /o cambios de adaptación pueden cambiar el estroma y el epitelio glandular en el tejido no maligno que rodea de manera pronóstica significativa [2], [8], [9], [10] .
PDGF α- y receptores β-tirosina quinasa ejercen funciones de control importantes en células mesenquimales, tales como los pericitos, fibroblastos y células musculares lisas vasculares durante el desarrollo [11], [12]. Los estudios experimentales han identificado diferentes efectos funcionales de estroma receptor de PDGF señalización en varios modelos tumorales. Se ha demostrado que la activación paracrina de receptores de PDGF en fibroblastos actúa como una señal potente para el reclutamiento estroma del tumor [13], [14], [15]. Otros estudios han demostrado beneficios terapéuticos de la orientación receptores de PDGF estromales la que se utilizan los efectos anti-tumorales directas, así como efectos beneficiosos sobre la absorción del fármaco del tumor [16], [17], [18], [19], [20]. importancia clínica de los resultados obtenidos en modelos experimentales se indica mediante numerosos estudios que demuestran la expresión del receptor de PDGF estromal en diferentes tumores sólidos humanos [13]. Más recientemente, estos estudios han sido complementados con análisis que revela que la expresión del receptor de PDGF alta estromal es un marcador de un resultado desfavorable en pacientes con cáncer de mama [21].
Los efectos biológicos de los receptores de PDGF en fibroblastos de tumores y los pericitos, junto con el advenimiento de los fármacos con actividad del receptor inhibidor PDGF, tales como imatinib, sorafenib y sunitinib, así motiva una caracterización sistémica del patrón de expresión de los receptores de PDGF en los tumores sólidos humanos. Con este fin, este estudio describe la expresión de PDGFR en aproximadamente 300 casos de cáncer de próstata y en el tejido prostático no maligno que rodea emparejado, y también informa sobre asociaciones entre la expresión PDGFRß y las características moleculares, histopatológicos y clínicos.
resultados
PDGFRß expresión variable en
de próstata normal y tejido tumoral
con el fin de evaluar la importancia de PDGFRß en el cáncer de próstata, con adición de un TMA emparejados no maligno y tejido tumoral de 377 pacientes con cáncer de próstata hasta un 25 año de seguimiento se analizó mediante inmunohistoquímica PDGFRß.
de acuerdo con estudios anteriores, la expresión PDGFRß se encuentra predominantemente en el estroma fibromuscular y en las células perivasculares (Figura 1 y Tabla 1). En la próstata no maligno 27% y 18% fue evaluado como teniendo expresión PDGFRß positiva en el estroma fibromuscular y células perivasculares, respectivamente. Perivascular y tinción estroma no se correlacionaron. En las zonas tumorales 34% fueron positivas en el estroma similar a fibroblastos y el 17% en las células perivasculares. La tinción en el estroma del tumor y alrededor de los vasos sanguíneos del tumor fueron correlacionados (R = 0,59). asociaciones significativas también se observaron entre el estado PDGFRß en el estroma maligno y no maligno (Tabla 1).
Las secciones se tiñeron para la PDGFRß de no maligno (A, B y C) y tumores (D, E y F) de tejido de pacientes con cáncer de próstata. Casos A y D muestran la tinción negativa, B y E muestran tinción estromal moderada mientras que C y F presentan una fuerte tinción estromal. Barra de nivel = 200 mM.
En algunos casos, la expresión PDGFRß también variar dentro del tejido de la próstata del mismo paciente (Figura S1).
producirse la expresión del estroma PDGFRß predominantemente en αSMA-positivo células
Para caracterizar adicionalmente la expresión de la estroma PDGFRß, un doble tinción se realizó con anticuerpos contra αSMA y PDGFRß.
Estos análisis confirmaron que la mayoría de la expresión en el PDGFRß fibromusclar no malignas y el estroma tumoral similar a fibroblastos se produjeron en células αSMA-positivos (Figura 2). Por otra parte, los análisis también demostró la presencia de células αSMA-positivas en el estroma de los tejidos tumorales y no malignas que no mostraron ninguna expresión del estroma PDGFRß.
tinciones dobles de tejido prostático con PDGFRß (verde) y αSMA (rojo) en el tejido (a y B) no maligno y el tejido del tumor (C y D). Barra de escala = 100 mM.
Estos hallazgos confirman así la existencia de subconjuntos de células estromales αSMA-positivos, que difieren con respecto a la expresión PDGFRß.
y del estroma perivascular PDGFRß tinción de los tumores de próstata se correlaciona con marcadores de pronóstico se realizaron
los análisis para investigar las posibles asociaciones entre la expresión PDGFRß en los tumores y los parámetros clínicos o características histológicas de los tumores.
la presencia de tinción PDGFRß en el fibroblast- como estroma tumoral fue significativamente correlacionado positivamente con el tamaño grande del tumor, estadio avanzado, la puntuación de Gleason alta y alta densidad de los vasos (Tabla 1). En los pacientes con una puntuación de Gleason 4-6 o Gleason 7 tumoral, sólo alrededor del 20% de los tumores de estroma mostró PDGFRß tinción, pero era mucho más común en casos con una puntuación de Gleason de 8-10 tumores (Figura 3 A).
tinción PDGFRß en el estroma del tumor fue más frecuente en los casos con una puntuación de Gleason de 8-10 tumores en comparación con los pacientes con una puntuación de Gleason 4-6 o Gleason 7 (a). Presencia de PDGFRß inmunotinción fue más común en el estroma normal de tejido de la próstata cuando una puntuación de Gleason de 8-10 tumor estaba presente en la próstata en comparación a si el tumor había puntuación de Gleason 4-6 (B).
expresión perivascular PDGFRß en el área del tumor también se correlacionó positivamente con la etapa avanzada, la densidad de vasos del tumor y la alta puntuación de Gleason (datos no mostrados).
en conjunto, estos resultados demuestran previamente no reconocidas asociaciones entre estroma perivascular y expresión en PDGFRß los tumores de próstata y las características asociadas con un fenotipo más agresivo del cáncer.
estroma PDGFRß tinción en el tejido no maligno adyacente se correlacionan con marcadores de pronóstico
PDGFRß expresión en tejido no maligno adyacente se analizaron también respecto a las asociaciones con las características del tumor (Tabla 1).
High PDGFRß en no maligno, estroma fibromuscular se correlaciona con el tamaño tumoral, estadio avanzado, la proliferación de las células epiteliales y la puntuación de Gleason alta (Tabla 1). Era mucho más común encontrar la expresión PDGFRß en el estroma normal de tejido de la próstata cuando una puntuación de Gleason de 8-10 tumor estaba presente en otras partes del órgano en comparación a si el tumor era Gleason 4-6 (Figura 3 B).
expresión perivascular PDGFRß en el tejido no maligno que rodea también se correlacionó positivamente con la proliferación de células epiteliales (datos no mostrados).
Estos análisis tanto sugerir nuevas relaciones entre las propiedades de cáncer de próstata y el fenotipo del estroma de la tejido de la próstata no maligno adyacente a los tumores de próstata.
expresión del estroma PDGFRß en los tumores y en el tejido de la próstata no maligno que rodea los tumores predice la supervivencia específica del cáncer
los resultados de los análisis de expresión eran PDGFRß por último se combina con los datos de supervivencia para investigar el posible significado pronóstico.
los valores de corte del estroma del tumor estromal PDGFRß y no maligno PDGFRß en los análisis se establecen en el tercer cuartil, lo que corresponde a 1,0 y 0,5 para el tumor y no estromal -malignant PDGFRß tinción, es decir, alta inmunorreactividad PDGFRß era ≥1.0 ≥0.5 de tumor y de estroma no maligno.
de Kaplan-Meier análisis mostró que los pacientes en espera vigilante con el cuartil más alto de expresión PDGFRß en estroma tumoral una supervivencia específica del cáncer significativamente más corto había comparado con el resto (probabilidad de 15 años de supervivencia libre de eventos (P-EFS) fue de 67 ± 5% y 34 ± 9% en ambos grupos) (Figura 4 a).
Los pacientes divididos en dos grupos en función de la expresión del estroma de PDGFRß en el tumor (a) y los tumores de próstata de tejido no maligno circundante (B). línea continua, alta PDGFRß en el estroma tumoral (≥1.0); línea discontinua, baja PDGFRß en el estroma tumoral (& lt; 1,0; A). línea continua, alta PDGFRß en el estroma no maligno (≥0.5); línea discontinua, baja PDGFRß en el estroma no maligno (& lt; 0,5; B).
Curiosamente, la alta expresión de PDGFR en el estroma de tejido de próstata normal adyacente también se asoció con una reducción de la supervivencia significativamente en pacientes administrados por la espera vigilante (15 años P-SSC fue de 68 ± 5% y 41 ± 9% en ambos grupos)
High estroma tumoral y no maligno PDGFRß inmunotinción se asoció (Figura 4 B). con un aumento del riesgo relativo de muerte específico del cáncer de próstata en un análisis de regresión de Cox univariante (Tabla 2). En el análisis multivariado de regresión de Cox que incluye el conocido marcador pronóstico GS y el estadio tumoral local, alta estromal PDGFRß en el tejido tumoral y no malignas no fue un marcador pronóstico independiente (datos no mostrados).
Discusión
el presente análisis reveló una serie de nuevas asociaciones entre el estroma tumoral estado PDGFRß y las características histopatológicas, incluyendo correlaciones positivas con puntuación de Gleason, estadio del tumor y el tamaño del tumor (Tabla 1). Estos resultados son una reminiscencia de la situación descrita recientemente en el cáncer de mama en donde la expresión del estroma PDGFRß se correlacionó positivamente con alto grado [21]. Estos resultados plantean la cuestión del mecanismo (s) subyacente. A partir de ahora, no es posible concluir si las asociaciones son causadas por un fenotipo epitelial estromal inducido o por un fenotipo epitelial inducida por estroma.
Los análisis del presente estudio también reveló asociaciones significativas entre las características clínicas, incluyendo la supervivencia, y la expresión del estroma PDGFRß en el tejido presente no maligno (Tabla 1). Esta observación de las propiedades de pronóstico significativos del tejido no maligno se suma a una serie de observaciones similares que juntos han llevado a proponer el término "tumor que indica tejido no maligno" (tinte), que implica que los análisis de tejido de la próstata no malignos pueden proporcionar información pronóstica [2], [10]. Otros estudios recientes han presentado hallazgos similares siguientes análisis de, por ejemplo, pAKT, pEGFR y AR [2], [10], [22]. Desde un punto de vista práctico esto es importante ya que muchas biopsias diagnósticas única muestra de tejido no maligno.
La biología subyacente de las variaciones en la expresión del estroma PDGFRß debería aclararse en mayor medida. Desde el presente análisis no está claro si las alteraciones en el tejido no maligno son secundarios a la presencia de cerca-por tejido maligno como se sugiere en modelos animales [8], o si más bien refleja un entorno de tumor permisiva que contribuye causalmente a formación de tumores más malignos
.
los análisis incluyendo doble tinción con anticuerpos αSMA y PDGFRß reveló que la expresión PDGFRß ocurrió en αSMA células positivas (Figura 2). Sin embargo, también se observó que estas células, en los tumores marcados como teniendo un estroma PDGFRß-positivo, se produjo junto con células αSMA -positivo /PDGFRß-negativos. Por tanto, estos resultados ejemplifican claramente la heterogeneidad molecular entre las células del estroma fibromusclar no maligno y del estroma tumoral similar a fibroblastos. Hallazgos similares se han realizado en los tumores experimentales [23]. Como también se ha sugerido por otros [24], los resultados deben estimular a una clasificación mejorada de estos subconjuntos y análisis de su significado funcional continua.
Las asociaciones entre la expresión de alto estromal PDGFRß y una supervivencia más corta indican que este receptor es causalmente relacionado con el curso clínico de la enfermedad y por lo tanto también sugiere la orientación de los receptores de PDGF para fines terapéuticos. Se han notificado algunos estudios más pequeños donde imatinib se han utilizado en el cáncer de próstata sin efectos evidentes [25], [26]. Los hallazgos del presente estudio, lo que demuestra grandes variaciones en la expresión del estroma PDGFRß, sugieren que los futuros estudios que evalúan este enfoque requieren procedimientos más rigurosos para la selección de pacientes. En este contexto, también cabe señalar que PDGFRß epiteliales expresión se detecta sólo en raras ocasiones en este estudio (datos no mostrados). Además, no se observaron asociaciones entre esta expresión y las características clínicas o histopatológicas.
Una serie de temas para futuros estudios son sugeridos por los resultados actuales. Los estudios experimentales que implican co-cultivos de células epiteliales y del estroma deben ayudar a clarificar si las asociaciones estroma-epitelio tienen su base mecánica predominante en el estroma o el compartimento epitelial. Otro tema interesante para futuros estudios sería investigar en qué medida el estroma y fenotipos epiteliales están ligados a los genes de riesgo de cáncer de próstata individual. Finalmente, se requieren análisis continuos de entender si las variaciones asociadas a tumores en el tejido no maligno son una causa o una consecuencia de la formación de tumores. analiza el tejido cuidado en estudios prospectivos podrían ser necesarias para aclarar esta cuestión.
Materiales y Métodos
Los pacientes y los microarrays de tejidos
Las muestras de tejido se obtuvieron de los pacientes sometidos a resección transuretral de la próstata (RTUP) en el hospital en Västerås, Suecia, entre 1975 y 1991. el análisis histológico demostró la presencia de cáncer de próstata. La mediana de edad en la RTUP fue de 74 años (rango 51-95 años). La información relativa a la ausencia o presencia de la hiperplasia benigna de la próstata no estaba disponible. Las muestras de tejido fueron fijadas en formalina y embebidas en parafina seguidos por la reclasificación de acuerdo con el sistema de Gleason. Las muestras se utilizaron para construir una matriz de micro tejido (TMA) usando un instrumento Beecher (Sun Prairie, WI, EE.UU.). El TMA: contenía 5-8 muestras de tejido tumoral que representa tanto el grado Gleason primario y secundario y 4 muestras de tejido no maligno de cada paciente. Los pacientes que no habían recibido ninguna terapia contra el cáncer antes de la RTUP. gammagrafía ósea radionucleidos se llevó a cabo poco después del diagnóstico para la detección de metástasis. Hubo 377 pacientes incluidos en el estudio, de los cuales 293 pacientes fueron seguidos con la espera vigilante después de la RTUP. En los síntomas de los pacientes con metástasis recibido tratamiento paliativo con la ablación de andrógenos y de la radioterapia pocos casos o terapia de estrógenos, de acuerdo con las tradiciones de terapia en Suecia durante ese tiempo. Además, se analizaron 84 pacientes que fueron tratados con tratamiento paliativo inmediatamente después del diagnóstico. La mediana de supervivencia global para el grupo de pacientes siguió con Espera en observación fue de 5,6 años. Noventa y dos de las muestras de RTUP se calificaron como puntuación de Gleason (GS) 4-5, 107 pacientes como GS 6, 63 pacientes tenían GS 7, y 115 pacientes GS 8-10. 3 pacientes (4,1%) con GS 6, 4 pacientes (8,2%) con GS 7, y 33 pacientes (33,7%) con GS 8-10 tenían metástasis óseas al momento del diagnóstico. En agosto de 2003, 36 pacientes (9,5%) estaban todavía vivos, 131 pacientes (34,7%) habían muerto de cáncer de próstata y 210 pacientes (55,7%) habían muerto por otras causas. El material se recogió conforme a las disposiciones suecas en un momento en que no se requiere el consentimiento informado. El comité de ética de la investigación en Umea hospital universitario (Regional de Ética Junta de Revisión de Umeå) aprobó el estudio y renunciado a la necesidad del consentimiento.
En este material ya hemos analizado los factores de potencial importancia pronóstica como la puntuación de Gleason, el volumen del tumor, el estadio tumoral, la proliferación de células tumorales y la densidad vascular y los datos obtenidos ahora estaban relacionados con los hallazgos actuales PDGFRß [2], [27].
PDGFRß inmunohistoquímica
PDGFRß inmunohistoquímica se realizó como se describe en Nupponen
et al
2008 [28]. Anti- PDGFRß (monoclonal de conejo,#3169, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) se utilizó a una concentración de 2 mg /ml. La intensidad de la tinción se puntuó por separado en el estroma y alrededor de los vasos como negativo (0), débil (1), moderada (2) o fuerte (3). La puntuación de tinción PDGFRß son los valores de la mediana de cinco a ocho muestras de tejido tumoral anotados o cuatro obtuvieron muestras de tejido no maligno. Para el análisis de correlación de las muestras se puntuaron como positivos para PDGFRß si se detectó tinción en al menos uno de los núcleos de TMA.
inmunofluorescencia
tinciones de inmunofluorescencia de la TMA se realizó como anteriormente (en la inmunohistoquímica sección) hasta que la incubación con el anticuerpo anti-PDGFR. a continuación, las secciones se lavaron en PBS con 0,1% de Tween-20 (PBT) 3 × 5 min. Esto fue seguido de una 1 h de incubación con el segundo anticuerpo primario, ratón monoclonal αSMA (M0851, clon 1A4, Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) diluido 1:100 en 20% de suero de cabra en PBT. Después del lavado en PBT de 3 × 5 min, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-ratón de cabra biotinilado (E0432, Dako Cytomations 1:500) durante 45 min a TA. Esto fue seguido por otro 3 × 5 min de lavado en PBT. Los portaobjetos se incubaron después con Alexa-Flour 488 de cabra anti-conejo anticuerpo secundario (A11008, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) diluido 1:100 en PBT durante 45 min a RT. Después del lavado; los portaobjetos se incubaron durante 45 min con Cy3-estreptavidina conjugada (Sigma-Aldrich) diluido 1:500 en PBT durante 45 min a RT. Después de lavar los portaobjetos se secan y se montaron con Vectashield medio con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) de montaje.
Estadísticas
correlaciones bivariadas se calcularon con la prueba de correlación de Pearson. Las correlaciones entre las variables categóricas y las variables continuas se analizaron mediante la prueba de correlación de Spearman. Los datos se recogieron en el momento del diagnóstico de cáncer de próstata.
Los pacientes incluidos en los análisis de supervivencia con la regresión de Kaplan-Meier y Cox se siguió con la espera vigilante. La duración de la supervivencia libre de eventos (SLE) se define como el tiempo desde la RTUP hasta la fecha de muerte por cáncer de próstata, la muerte de otra causa, o hasta la fecha de la última visita de seguimiento. Evento en el análisis de supervivencia se define como muerte por cáncer de próstata, lo que demuestra la supervivencia específica del cáncer. Las diferencias en los resultados fueron probados con la prueba de log-rank. La importancia pronóstica de PDGFRß inmunorreactividad se evaluó con el análisis de regresión de Cox solo y combinado con GS y el estadio tumoral local. La probabilidad de supervivencia libre de eventos (P-EFS) se presenta ± error estándar (SE). El nivel de significación estadística se definió como
P Hotel & lt; 0,05 (dos caras). El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 17.0.0 para Mac OS X (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Apoyo a la Información
Figura S1. expresión
PDGFRß varía de vez en cuando en el tejido de la próstata de la misma paciente. patrones de tinción PDGFRß heterogéneas se observó en muchos tumores. A y B ilustran las diferentes partes de la misma cáncer de próstata. Barra de escala = 200 M
doi:. 10.1371 /journal.pone.0010747.s001
(7.24 MB EPS)
Reconocimientos
Los miembros del laboratorio de A.Ö. Se hace mención de los comentarios productivas y de apoyo en todo el proyecto.