Extracto
Antecedentes
Los niveles circulantes de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) han sido ampliamente utilizados como biomarcadores para la actividad angiogénica en el cáncer. Para este fin, se utilizaron las mediciones no normalizados en el plasma y el suero, sin ninguna corrección de la liberación de VEGF artificial por las plaquetas activadas
ex vivo
. Se postula que el "verdadero" circulantes (c) los niveles de VEGF en la mayoría de los pacientes con cáncer son bajos y sin relación con la carga del cáncer o la angiogénesis tumoral.
Metodología
Se determinó los niveles de VEGF en PECT, un medio que contiene inhibidores de la activación plaquetaria en el plasma de citrato, y en plaquetas aisladas en 16 sujetos sanos, 18 pacientes con cáncer renal metastásico no (no-RCC) y 12 pacientes con carcinoma de células renales (CCR). En pacientes no RCC, los niveles circulantes de VEGF en plasma fueron bajas y similares a los niveles de VEGF en los controles si la activación de las plaquetas se redujo al mínimo durante el procedimiento de la cosecha por medio PECT. En el plasma de citrato, los niveles de VEGF fueron elevados en pacientes no RCC, pero esto podría explicarse por una combinación de aumento de la activación de las plaquetas durante la recolección de la sangre, y por un aumento de dos veces en el contenido de VEGF de las plaquetas individuales (controles: 3,4 UI /10
6, no RCC: 6.2 UI /10
6 plaquetas, p = 0,001). En contraste, los niveles de cVEGF en pacientes de RCC fueron elevados (plasma PECT: 64 pg /ml vs. 21 pg /ml, RCC frente a no-RCC, p & lt; 0,0001), y no relacionada con la concentración de plaquetas VEGF
conclusiones
Nuestros hallazgos sugieren que los "verdaderos" libremente niveles cVEGF no están elevados en la mayoría de los pacientes con cáncer. Previamente reportado niveles elevados de VEGF en plasma en el cáncer parecen ser debido a la liberación artificial a partir de plaquetas activadas, que en el cáncer tienen un mayor contenido de VEGF, durante el procedimiento de cosecha sangre. Sólo en los pacientes con RCC, que se caracteriza por la producción excesiva VEGF debido a un defecto genético específico, fueron niveles elevados de cVEGF. Esta observación puede estar relacionada con un éxito limitado y selectivo de agentes anti-VEGF, tales como bevacizumab y sorafenib, como monoterapia en el RCC en comparación con otras formas de cáncer
Visto:. Niers TMH, Richel DJ, Meijers JCM, Schlingemann RO (2011) Factor de Crecimiento endotelial Vascular en la circulación en pacientes con cáncer puede no ser un biomarcador relevante. PLoS ONE 6 (5): e19873. doi: 10.1371 /journal.pone.0019873
Editor: Terence Lee, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 15 Abril, 2010; Aceptado: April 19, 2011; Publicado: 26-may 2011
Derechos de Autor © 2011 Niers et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
factor de crecimiento endotelial
Vascular (VEGF) es el mejor momento. regulador de la angiogénesis en los tumores [1] - [3]. Es liberado por las células cancerosas, las células hipóxicas y las plaquetas activadas y los leucocitos [4] - [8]. Las células diana de VEGF son principalmente las células endoteliales vasculares en los cuales tiene potentes efectos mitógenos a través de receptores de alta afinidad Flt-1 y [9] KDR /Flk-1, [10]. Como VEGF es un péptido difusible soluble secretado por los tumores, se propusieron sus niveles en la circulación para reflejar la actividad angiogénica de tumores malignos. Por tanto, en los últimos años, los niveles de VEGF y otros factores angiogénicos en circulación han sido ampliamente estudiados como marcadores indirectos de la actividad angiogénica y el pronóstico en pacientes con cáncer, para la respuesta al tratamiento de seguimiento y para la detección de recaída temprana [11].
Para este fin, se utilizaron los niveles de VEGF determinados en suero o plasma. Sin embargo, el suero contiene altos niveles de VEGF debido a la liberación por las plaquetas activadas durante la coagulación [5] - [7]. Por lo tanto, los niveles de VEGF en suero, que se correlacionan estrechamente con número de plaquetas, [12], no reflejan la concentración en circulación real de VEGF in vivo. En el citrato o plasma EDTA, donde se espera una menor activación de las plaquetas y la liberación de VEGF posterior que en el suero, se encontró que los niveles de VEGF ser aún mayor en los pacientes con cáncer que en los controles y esto fue interpretado como un reflejo de los niveles más altos de VEGF en la circulación y mayor actividad angiogénica [13] - [15]. Sino también por estos autores liberación artificial de VEGF a partir de plaquetas, o comportamiento alterado de plaquetas en pacientes con cáncer, no se descartó como fuente de aumento de los niveles de VEGF en las muestras de plasma
.
El objetivo de este estudio fue investigar la posibilidad de que la liberación de VEGF artificial por las plaquetas es la principal fuente de VEGF en muestras de plasma, y que los niveles circulantes de VEGF en pacientes con cáncer son bajos e incluso no relacionadas con la carga del cáncer o de la actividad angiogénica. Para este propósito, se determinó los niveles plasmáticos de VEGF con o sin la inhibición de la activación de las plaquetas, y se cuantificó la liberación de VEGF a partir de plaquetas in vitro, en las personas de control sin cáncer, los pacientes con pacientes con carcinoma de células no-renal metastásicos y pacientes con carcinoma de células renales metastásico.
Materiales y Métodos
Los pacientes y voluntarios
Se obtuvo sangre venosa de 16 voluntarios sanos (controles) y de 30 pacientes con cáncer, se separaron en dos grupos de pacientes: 18 pacientes con pacientes metastásicos no RCC (RCC no) y 12 con CCR metastásico (RCC). RCC se caracteriza por la producción de VEGF de alta intra-tumor por mutaciones en el gen supresor de tumor de von Hippel-Lindau, con la consiguiente actividad ilimitada del factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) causando alta VEGF transcripción [16] - [20].
Se investigaron los niveles de VEGF en plasma con citrato, plasma PECT y en las plaquetas. Las características de los voluntarios y pacientes son los siguientes: controles sanos (controles) mediana de edad, 53 [48-60]; pacientes con cáncer (Non-RCC-grupo); mediana de edad, 62 [57-72]; con el cáncer de páncreas (7), colangiopancreatografía (3), papilli de Vater (2), el esófago (1), colon y recto (2), melanoma (1), ovario (1), de mama (1). RCC (RCC-grupo) mediana de edad, 60 [56-65]; con los siguientes grupos de pronóstico: 5 de riesgo alto, intermedio y 5 riesgo 2 de riesgo favorable, de acuerdo con Motzer [21]. Todos los pacientes con cáncer tenían enfermedad metastásica. Para discriminar entre vivo la activación de plaquetas y artificial en la activación de plaquetas in vitro durante la cosecha plasma, β-TG y el PF4 se midieron en todas las muestras. Las muestras de sangre utilizadas en este estudio se obtuvieron a partir de pacientes con CCR incluidos en el estudio 43-9006 BAYER (aprobado por el Comité de Ética Médica (METC 05-262), Centro Médico Académico, Universidad de Amsterdam), los pacientes no-RCC no incluidos en una estudio específico, y los voluntarios. De todos los voluntarios y pacientes distinto y se obtuvo el consentimiento informado por escrito para la cosecha muestra de sangre y de biomarcadores angiogénesis determinaciones.
Preparados Plasma
Para la comparación con la recolección de plasma con citrato estándar, se empleó un método para (máximo) evitar artificial ex vivo la activación plaquetaria por la extracción de sangre sin torniquete, y la cosecha en un medio que contiene una mezcla de anticoagulantes a la que la prostaglandina e
1 y se añadió teofilina (medio PECT). Además, se utilizó una herramienta importante para discriminar entre vivo y la activación plaquetaria en artificial en la activación de plaquetas in vitro, es decir, mediciones de 4 (PF4) los niveles de β-tromboglobulina (β-TG) y el factor de plaquetas. Colección de PECT plasma y el uso concomitante de los marcadores de activación de plaquetas debe proporcionar una estimación precisa de los niveles circulantes de VEGF in vivo.
A partir de cada paciente o voluntario de sangre venosa fue tomada con un microperfuser (1 mm de diámetro, Microflex , Vycon, Ecouen, Francia) y se divide en diferentes tubos. De plástico (polipropileno) tubos de recogida de sangre se llenaron con 400 l de una solución que contiene: prostaglandina E
1 (94 nM), Na
2CO
3 (0,63 mM), EDTA (90 mM) y theophylin ( 10 mM) (PECT-media). Se recogieron muestras de sangre (4 ml) en estos tubos PECT en un sistema abierto, gota a gota y sin el uso de un torniquete a (máximo) evitar la activación de plaquetas ex vivo. La sangre recogida en los tubos PECT se colocó inmediatamente en hielo (en contraste con los de citrato y de sangre EDTA muestras que se mantuvieron a temperatura ambiente). plasma PECT en plaquetas empobrecido se preparó haciendo girar durante 60 minutos a 1.700 g a 4 ° C en 1 hora después de la recogida.
La sangre también se recogió en tubos llenos de citrato y en tubos llenos con EDTA utilizando un torniquete ( Becton Dickinson tubos al vacío Systems, Breda, Países Bajos). Las muestras de sangre se centrifugaron de citrato dentro de los 30 minutos durante 15 minutos a 1.000 g para obtener plasma. EDTA sangre extraída de la misma manera se utilizó para medir el número total de plaquetas. Para medir VEGF, PF4 y β-TG dentro de las plaquetas, se utilizó sangre EDTA en el que las plaquetas fueron destruidas por una combinación de Triton (2% de Triton X-100), sonicación durante 15 segundos en hielo (micropunta, Branson, amplitud 50% ) y centrifugando durante 5 minutos a 14.000 rpm en una microcentrífuga. plasma PECT en plaquetas empobrecido se utilizó para medir VEGF, PF4 y los niveles de β-TG. citrato en plasma se utilizó para medir los niveles de VEGF y PF4.
Las mediciones de los marcadores de activación de plaquetas y VEGF
concentraciones de PF4 y β-TG dentro de las plaquetas son similares y, tras la activación de las plaquetas que se liberan en cantidades similares [22], [23]. Debido a que despeje PF4 del plasma es mucho más rápido que ß-TG holgura (t ½ de PF4 es de varios minutos y de β-TG & gt; 100 minutos) [22], [23] un nivel normal o sólo ligeramente elevada PF4 y alta β-TG nivel sugieren la activación plaquetaria in vivo, mientras que un alto nivel de β-TG en combinación con un alto nivel de PF4 sugiere in vitro (ex vivo) la activación plaquetaria. por lo tanto, todas las muestras se ensayaron para VEGF, β-TG y PF4 utilizando comercialmente disponibles sándwich ligados a enzimas ensayos de inmunoabsorción (ELISA) de Roche (Asserachrom β-TG y Asserachrom PF4; Roche, Mannheim, Alemania) y el amplificador de I +; D Systems (Quantikine VEGF ; R & amp;. D Systems, Abingdon, Reino Unido)
recuperación de VEGF
Para excluir la posibilidad de que PECT o medio citrato afecta a la medición de los niveles de VEGF por ELISA, concentraciones conocidas del VEGF humano recombinante (estándar proporcionado en el kit de ensayo) se añadieron al suero, plasma PECT y muestras de plasma de citrato para producir concentraciones de VEGF de 250, 62,5, 31,2, 7,8 y 3,9 pg /ml. Las muestras se diluyeron con tampón de ensayo y la concentración de VEGF se determinó por ELISA.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión de programa de ordenador 12.0 (SPSS, Gorinchem, Países Bajos) y con el software GraphPad Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, EE.UU.). VEGF, PF4 y β-TG niveles en voluntarios sanos y pacientes con cáncer se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney (grupos, no distribuido normalmente no apareados). Los valores se presentan como mediana y rango intercuartil [T25-T75].
Resultados
plasma y plaquetas niveles de VEGF
En los tres grupos de pacientes, los niveles de VEGF en plasma de citrato ( Figura 1A) fueron significativamente más altos que en PECT plasma (Figura 1B). los niveles de VEGF en plasma con citrato fueron significativamente mayores en ambos grupos de pacientes con cáncer en comparación con los controles sanos, pero en el plasma PECT esto fue sólo el caso de los pacientes con CCR. El contenido de VEGF de plaquetas aisladas, un depósito bien conocido por VEGF, fue dos veces mayor en ambos grupos de pacientes de cáncer que en los controles (Tabla 1 y la Figura 1C).
A) de VEGF-niveles medidos en el plasma de citrato de los pacientes con cáncer en comparación con personas sanas. B) VEGF-niveles medidos en PECT plasma de pacientes con cáncer en comparación con personas sanas. niveles C) de VEGF medidos en las plaquetas de los pacientes con cáncer en comparación con personas sanas. Las barras representan las medianas.
En pacientes con CCR, los niveles de VEGF en plasma PECT fueron considerablemente más altos que en los pacientes que no son RCC, mientras que el contenido de VEGF plaquetas no fue diferente entre estos grupos. niveles de VEGF en plasma citrato, plasma PECT, y plaquetas en el grupo de pacientes se muestran en la Tabla 1 y la Figura 1. Estas mediciones no se vieron afectados por el tipo de medio utilizado, como la recuperación de VEGF era 100 a 107% en plasma PECT, 73 % -107% en el plasma de citrato y 78-100% en el suero.
in vitro
la activación plaquetaria
Debido a su baja vida media in vivo, PF4-niveles en muestras de sangre son una medida de la activación plaquetaria ex vivo artificial. En nuestro estudio, en ambos controles sanos y pacientes con cáncer de las concentraciones de PF4 fueron 50-100 veces más altos en plasma de citrato estándar (recogido con torniquete) que en PECT plasma (recogidos sin torniquete) (Tabla 2). Esto demuestra que el grado de activación de las plaquetas ex vivo artificial depende del método de la cosecha altamente, y que la activación de plaquetas en el plasma artificial PECT es baja y en muestras de plasma de citrato es alta.
Como plaquetas la activación se asocia con la liberación de VEGF, PECT los niveles de VEGF en plasma probablemente reflejan los niveles circulantes de VEGF, mientras que el aumento de los niveles de VEGF en plasma citrato son en su mayoría causadas por la activación de plaquetas ex vivo. Esta posibilidad está fuertemente apoyado por la correlación significativa que observamos entre los niveles de PF4 y VEGF en las muestras de plasma de citrato individuales (Figura 2).
VEGF y PF4 medida en plasma de citrato correlacionó significativamente (r = 0,457, p = 0,008 ).
en el plasma PECT, encontramos dos veces más altos valores de PF4 en los pacientes con cáncer en comparación con los controles sanos. Esto indica que las plaquetas de los pacientes con cáncer son más propensos a llegar a ser activado. Sin embargo, un aumento de la concentración de PF4 en las plaquetas individuales de los pacientes con cáncer también puede haber contribuido al aumento de la concentración plasmática PF4 en PECT (Figura 3).
A) β-TG y el PF4 se mide en PECT plasma de pacientes de cáncer en comparación con los controles. B) β-TG y PF4 midieron en las plaquetas de los pacientes con cáncer en comparación con los controles. Las barras representan las medianas.
Un alto nivel de β-TG en combinación con un nivel bajo en el plasma PF4 PECT es una indicación de la activación plaquetaria in vivo. No hemos podido demostrar tal en la activación plaquetaria in vivo en nuestros pacientes con cáncer, como β-TG en el plasma PECT no mostraron un aumento independiente del aumento de PF4.
Discusión
Nuestro estudio demuestra que los "verdaderos" los niveles circulantes de VEGF, según lo determinado por las mediciones en plasma PECT, son bajos en la mayoría de los pacientes con cáncer metastásico y que no difieren significativamente de los niveles circulantes de VEGF en los controles. Los niveles de VEGF elevados en las muestras de plasma de citrato se correlacionan con PF4, un marcador de activación plaquetaria ex vivo, lo que sugiere que la liberación de VEGF de las plaquetas durante el procedimiento de cosecha es responsable de los niveles de VEGF en estas muestras. Además, hemos observado que las plaquetas individuales en los pacientes con cáncer tienen un contenido de dos veces más alta de VEGF en comparación con controles sanos. Nuestros resultados muestran que los niveles de VEGF en las muestras de sangre dependen del método de recolección de contenido y VEGF altamente plaquetas, y cuestionan la pertinencia de VEGF 'circula' como un biomarcador. Nuestros resultados no descartan que eleva artificialmente los niveles de VEGF en las muestras de plasma de citrato, como una medida combinada de activatibility de plaquetas y el contenido de VEGF plaquetas, no podría ser un marcador sustituto útil de algunos aspectos de la biología del tumor.
Un marcado aumento de los niveles de VEGF en plasma se ha observado en varios tipos de cáncer empleando diversos métodos de recolección y determinación [11]. Un número de estudios informó de una correlación entre el recuento de plaquetas y VEGF en suero [24], [25], y los niveles de VEGF en suero más altos por plaquetas en pacientes con cáncer [26], [27]. Esto está en línea con nuestros hallazgos y la función de las plaquetas conocido como un importante reservorio para el VEGF. VEGF derivado de plaquetas puede tener un papel patológico importante en el cáncer debido a la trombina inducida por la activación de plaquetas y la liberación local subsiguiente de VEGF, la inducción de la permeabilidad vascular, activación de células endoteliales y la angiogénesis, promover la coagulación y la difusión del cáncer [4] [28], - [30 ].
en el presente estudio, se evaluaron dos métodos diferentes de recogida de plasma para la medición de VEGF en los controles sanos y pacientes con cáncer. El impacto de la utilización de un medio de torniquete y recogida (citrato frente PECT) en los niveles de VEGF se demostró en los controles sanos y pacientes con cáncer. No se detectaron diferencias significativas en los niveles de VEGF PECT entre controles sanos y pacientes con cáncer no-RCC.
En pacientes con CCR, los niveles de VEGF PECT fueron significativamente mayores en comparación con los controles, lo que sugiere que en estos pacientes VEGF es realmente elevada en el circulación. RCC se caracteriza por la producción de VEGF de alta intra-tumor por mutaciones homocigóticas en el gen supresor de tumor de von Hippel-Lindau, con la consiguiente actividad ilimitado de la 1α factor inducible por hipoxia (HIF1α) causando alta VEGF transcripción [20] - [26]. En muchos de estos pacientes, las otras células en el cuerpo son heterocigotos para la mutación VHL. Estos aspectos genéticos pueden explicar por qué los pacientes con CCR tienen diferentes niveles circulantes de VEGF que los pacientes no RCC estudiados.
Nuestros resultados están en línea con el éxito selectiva de anti-VEGF se acerca en el tratamiento del CCR en comparación con otros tipos del cáncer [31]. De hecho, bevacizumab (Avastin; Genentech, South San Francisco, CA) un anticuerpo que se une a todas las isoformas de cVEGF humano [32] produjo una prolongación significativa del tiempo hasta la progresión de la enfermedad en comparación con el placebo en pacientes con RCC [33]. Esto en contraste con la mayoría de otros tipos de tumores, en los que bevacizumab o bien no es eficaz o tuvo una eficacia solamente significativamente antitumoral cuando se utiliza en combinación con quimioterapia en lugar de como monoterapia (que actúa más como quimioterapia de potenciador) [34]. La explicación sencilla para la actividad clínicamente relevante de bevacizumab como monoterapia en RCC podría ser las funciones específicas de señalización de hipoxia defectuoso y la sobreexpresión de VEGF en la patogénesis de estos tumores.
Hemos observado que la activación de plaquetas in vitro durante la recogida procedimiento contribuye a los niveles de VEGF en plasma de citrato más altas. Esto fue demostrado por la alta liberación de PF4 de plaquetas en citrato en comparación con el plasma PECT, y la correlación positiva significativa entre los niveles de PF4 y VEGF en muestras de plasma de citrato individuales. Los niveles de dos veces más altos de PF4 en plasma PECT en pacientes con cáncer en comparación con los controles sugieren que también con el método de recogida óptima algunos activación de las plaquetas se sigue produciendo, pero lo más importante esto muestra que las plaquetas en pacientes con cáncer se activan más fácilmente que las plaquetas de los controles sanos .
en línea con otros estudios que demostraron que el contenido de VEGF plaquetas es mayor en pacientes con cáncer [26], [27], [35]. A la luz de nuestros hallazgos en plasma PECT, esto sugiere que ex vivo liberación de VEGF por las plaquetas se altera en pacientes con cáncer, debido tanto a un aumento en el contenido de VEGF de plaquetas, así como a un activatibility mayor de plaquetas en pacientes con cáncer. Un mayor contenido de VEGF de plaquetas puede proceder de aumento de la carga en la médula ósea o como resultado de una función de VEGF de barrido de las plaquetas [6], [35], [36]. Tal función de barrido serviría para eliminar el exceso de VEGF, producido localmente en los tejidos tumorales, de la circulación. Es notable que en nuestros dos grupos de pacientes el incremento en el contenido de VEGF plaquetas fue aproximadamente dos veces mayor en comparación con los controles, a pesar de los más altos niveles de VEGF en plasma de pacientes con CCR PECT. Por lo tanto, si las plaquetas realmente tienen una función de barrido para el VEGF, en el RCC esta función eliminadora parece fallar debido a la producción de VEGF excesivamente alta, lo que lleva a VEGF circulante. Además, a diferencia de VEGF circulante libre, el contenido de VEGF dentro de las plaquetas puede ser un biomarcador potencial interesante significativa para la actividad de la angiogénesis en pacientes con cáncer de VEGF y /o, que necesita más estudios.
En conclusión, los niveles de VEGF libres son baja o ausente en la circulación en la mayoría de pacientes con cáncer, con la excepción de RCC, un tipo de cáncer con la producción excesiva VEGF debido a un defecto genético específico. los niveles de citrato de VEGF no reflejan niveles reales de VEGF circulante sino que son el resultado de ex vivo la activación plaquetaria y la liberación de VEGF posterior a partir de plaquetas que tienen un mayor contenido de VEGF en pacientes con cáncer. Los niveles elevados de citrato de VEGF en pacientes con cáncer, los cuales han sido ampliamente utilizados como un biomarcador de la angiogénesis tumoral, son causadas por artefactos y una alteración de la conducta de plaquetas asociados con la enfermedad sistémica.
Reconocimientos
Estamos en deuda a la señora MA Weijne y la señora WF Kopatz en busca de ayuda y la cooperación; Profesor Dr. H. R. Büller para la lectura crítica de este manuscrito antes de su presentación, y para los pacientes y voluntarios incluidos en el estudio por su confianza y apoyo.