Extracto
El cáncer de pulmón es el segundo cáncer más frecuente y la principal causa de las muertes relacionadas con el cáncer. A pesar de los recientes avances en el desarrollo de terapias dirigidas, los pacientes con enfermedad avanzada siguen siendo incurables, sobre todo porque no pequeñas carcinomas de pulmón de células metastásicas (NSCLC) con el tiempo se vuelven resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs). inhibidores de la quinasa tienen el potencial para la promiscuidad objetivo porque la superfamilia de quinasa es la mayor familia de genes druggable que se une a un sustrato común (ATP). Como resultado, a menudo TKIs desarrollado para un propósito específico se han encontrado para actuar sobre otros objetivos. cromatografía de afinidad de drogas se ha utilizado para demostrar que dasatinib interactúa con el receptor de TGF tipo I (TβR-I), una serina-treonina quinasa. Para determinar el potencial importancia biológica de esta asociación, se estudiaron los efectos combinados de dasatinib y el TGF en líneas celulares de cáncer de pulmón. Se encontró que el tratamiento con dasatinib solo no tuvo un efecto muy pequeño; sin embargo, cuando las líneas celulares de cáncer se trataron con una combinación de TGF y dasatinib, se indujo apoptosis. Combinado TGF-1 + dasatinib tratamiento no tuvo efecto sobre la actividad de Smad2 o otros mediadores intracelulares TGF no canónicos. Curiosamente, combina TGF y tratamiento dasatinib resultó en un aumento transitorio de p-Smad3 (visto después de 3 horas). Además, cuando las células de NSCLC fueron tratados con esta combinación, se reguló el BIM proteína pro-apoptótica. Desmontables de la expresión de Smad3 usando Smad3 ARNsi también dio lugar a una disminución de la proteína BIM, lo que sugiere que TGF-1 + dasatinib inducida por apoptosis está mediada por la regulación de Smad3 BIM. El dasatinib es solamente eficaz en matar las células mutantes de EGFR, que se muestra sólo en el 10% de NSCLC. Por lo tanto, la observación de que los cánceres de tipo salvaje EGFR pulmonares pueden ser manipulados para hacerlos sensibles a la destrucción por el dasatinib podría tener importantes implicaciones para el diseño de estrategias de tratamiento innovadoras y potencialmente más eficaces para esta enfermedad
Visto:. Gordiano E, Li J, Pevzner Y, Mediavilla-Varela M, Luddy K, Ohaegbulam K, et al. (2014) Transforming Growth Factor β señalización supera la resistencia de dasatinib en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (12): e114131. doi: 10.1371 /journal.pone.0114131
Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Marzo, 2014; Aceptado: 3 de octubre de 2014; Publicado: Diciembre 11, 2014
Derechos de Autor © 2014 gordiano et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención SPORE P50 CA119997-02-S2. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el segundo cáncer más común y representa aproximadamente el 15% de todos los diagnósticos de cáncer. A pesar de los recientes avances en el desarrollo de terapias dirigidas, los pacientes con enfermedad avanzada siguen siendo incurables. Debido a la diversidad genética dentro de los tumores, las células con vías alternativas de crecimiento activados finalmente emergen; por lo tanto la comprensión de los mecanismos por los cuales las diferentes vías se conectan y desconectan es importante en la elaboración de terapias novedosas. Aunque algunos tipos de cáncer son inicialmente muy sensibles a los inhibidores de tirosina quinasa (TKIs), la resistencia se desarrolla con el tiempo. Por ejemplo, una mayoría de cáncer metastásico de pulmón no microcítico (CPNM) pacientes con mutaciones de EGFR de activación responden al tratamiento con erlotinib; Sin embargo, en última instancia, todos los pacientes progresan. Por lo tanto, las terapias alternativas se necesitan con urgencia para pacientes con mutaciones de EGFR que inicialmente responden a las terapias EGFR TKIs pero con el tiempo el desarrollo de la resistencia, así como para los pacientes que presentan el genotipo EGFR de tipo salvaje [1]. Esta resistencia podría ser en parte debido a la complejidad que caracteriza la señalización de estos tipos de proteínas, así como la heterogeneidad de los adenocarcinomas de pulmón [2]. Dasatinib, un TKI con varios destinos de quinasa, que actualmente está siendo probado para el tratamiento de diferentes tumores malignos en los que se sobreexpresan estos objetivos, incluyendo la leucemia mielógena crónica y cánceres de mama y de pulmón [3], [4], [5]. Los ensayos clínicos han probado la eficacia de dasatinib en CPNM como agente único [6], en combinación con regímenes de quimioterapia que se utilizan actualmente como el erlotinib inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [7], y en pacientes que han desarrollado resistencia al erlotinib y gefitinib [8]. Canción
et al
demostró que dasatinib induce la apoptosis en una serie de células de NSCLC que exhiben un fenotipo mutante EGFR; sin embargo, este efecto no se observó en líneas celulares de NSCLC con un fenotipo EGFR de tipo salvaje [9].
factor de crecimiento transformante β (TGF) es una citoquina implicada en numerosos procesos celulares, incluyendo el crecimiento, la proliferación, adhesión , la migración y la apoptosis. Además, la pérdida de capacidad de respuesta a TGF-1 se ha correlacionado con la tumorigenicidad en muchos diferentes tipos de cáncer [10]. TGF transducción de la señal comienza con la unión del ligando a la TGF tipo II receptor (TβR-II), seguido por el reclutamiento del receptor de tipo I (TβR-I) y la formación de un complejo hetero-oligoméricos de TGF-1, TβR-II, y TβR -I [11]. Después de la formación del complejo, el constitutivamente autophosphorylated TβR-II fosforila TβR-I, iniciando una cascada de fosforilación de sustratos citoplásmicos aguas abajo, incluyendo las proteínas Smad, con la posterior activación de los genes diana [10]. La diafonía entre la vía TGF y muchas otras vías de transducción de señales como resultado la modificación de la señal original TGF través de vías no canónicos y se utiliza para explicar los múltiples efectos de TGF [12], [13], [14]. En las células epiteliales normales, TGF inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis, actuando así como un supresor de tumor; Sin embargo, en muchos tipos de cáncer, TGF actúa como un promotor de tumores (invasión celular, la metástasis, la regulación inmune y la modificación microambiente) [15].
afinidad de Drogas experimentos de cromatografía revelaron que dasatinib, desarrolló originalmente como un inhibidor de SRC [16], interactúa con más de 40 quinasas, incluyendo tirosina quinasas, tirosina quinasas receptoras, serina /treonina quinasas y MAP quinasas. Una de las quinasas serina /treonina que se identificó utilizando este enfoque fue el receptor TGF tipo I (TβR-I) [17]. Con el fin de determinar el potencial importancia biológica de esta asociación, se estudiaron los efectos combinados de dasatinib y el TGF en líneas celulares de cáncer. Se encontró que el tratamiento con dasatinib solo no tuvo un efecto muy pequeño; sin embargo, cuando las líneas celulares de cáncer se trataron con una combinación de TGF y dasatinib, se indujo apoptosis. Dasatinib sólo es eficaz en matar las células mutantes de EGFR [9], que representa el 10% de NSCLC; Por lo tanto, la observación de que los cánceres de pulmón pueden ser manipulados para hacerlos sensibles a la destrucción por el dasatinib podría tener importantes implicaciones para la elaboración innovadora y potencialmente más eficaces estrategias de tratamiento para esta enfermedad.
Materiales y Métodos
cultivo de células
el adenocarcinoma de pulmón humano NCI H292 y células A549 líneas se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en medio RPMI-1640 (Thermo Scientific, Waltham, MA) suplementado con 10% suero fetal bovino (Atlanta Biologicals Inc, Lawrenceville, GA), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, y glutamina 1 mM. Las líneas celulares se mantuvieron en una incubadora húmeda a 37 ° C y 5% de CO
2.
Los anticuerpos y compuestos
anticuerpo anti-SHC1 policlonal se obtuvo de Thermo Scientific Pierce (Rockford , IL), y el anticuerpo policlonal anti-MADH7 (Smad7) fue adquirido de Abcam Inc. (Cambridge, MA). Anti-HDAC2 se adquirió de Millipore (Billerica, MA). Los siguientes anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA): anti-pSma2 (enlazador y la fosforilación específica COOH), anti-Smad2, anti-pSmad3, anti-Smad3, anti-pAKT, anti-Perk, anti-BIM, anti-PARP, y anti-GAPDH. Humano recombinante de proteínas TGF-1 se adquirió de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN) y se reconstituyó en HCL 4 mM y solución de albúmina 1 mg /ml de suero bovino. El dasatinib y erlotinib se obtuvieron de ChemieTek (Indianapolis, IN) y se diluyeron en DMSO. LY-364947 fue la compra de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). AZD0530 se obtuvo de AstraZeneca (Londres, Reino Unido)
estudios de acoplamiento TβR-I
La estructura cristalina de TβR-1 en el complejo con péptido FKBP12 y dorsomorphin (AP ID: 3H9R). Se utilizó para las coordenadas de partida [18]. Todos los átomos que no pertenecen a la proteína se eliminaron manualmente usando entorno de modelado molecular de Schrodinger Maestro [19]. La proteína se preparó usando el protocolo de preparación de proteína de Schrodinger [20]. La etapa inicial de preparación de proteína incluye además de la asignación de los átomos de hidrógeno de órdenes de enlace apropiados a todos los átomos, seguido de la creación de enlaces disulfuro, adición de cadenas laterales que faltan utilizando el software Primer [21], y la eliminación de todas las moléculas de agua. Después de la preparación inicial, la estructura de la proteína se ha optimizado para reflejar un pH de 7,0 usando PROPKA [22], [23] software seguido por minimización de toda la estructura hasta que los átomos pesados convergieron a la desviación de la raíz cuadrada media de 0,30 Å.
Con el uso de Desmond [24], [25] software, la estructura de la proteína preparada se solvatada en un baño que contiene TIP3P [26] moléculas de agua y los iones de cloruro en una caja cúbica, de modo que había un tampón de disolvente de 10 Å entre la superficie de la proteína y el borde de la caja de disolvente. A continuación, simulación de dinámica molecular se llevó a cabo en el sistema. El uso de un defecto de la relajación y el protocolo de calentamiento Desmond, calentamos el sistema a 310 K y se equilibraron durante un tiempo química total de 10 ns utilizando presión constante y conjunto de la temperatura. interacciones interatómicas coulombic se calcularon para pares de átomos separados por hasta 13 Å, mientras que las partículas con malla lisa Ewald se utilizó para dar cuenta de las interacciones más allá del punto de corte. el análisis de trayectoria indica que el sistema alcanza el equilibrio en alrededor de 4,5 ns de tiempo química. Nueve capturas del sistema correspondiente a 4.613, 6.005 ns ns ns, 6.394, 7.123, 7.550 ns ns ns, 8.050, 8.789, 9.538 ns ns ns 10.00, y se escogieron al azar. El uso promedio de la escritura de la estructura del Maestro, la instantánea que representa el sistema en 7.123 ns fue elegida como la estructura representativa y se utiliza en los estudios de acoplamiento posteriores.
Los ligandos bosutinib, dasatinib, dorsomorphin, y LY-364947 fueron procesados con LigPrep [27]. El procesamiento garantizada órdenes de enlace adecuados y, utilizando el Epik [28], [29] módulo, genera todas las posibles tautómeros de los ligandos para reflejar un pH en el intervalo de 5,0 a 9,0. Mapa del Sitio [30], [31] software se utilizó para sondear la superficie de la TβR-1 para posibles bolsas de enlace. Se identificaron un total de cinco bolsas de enlace; estos se clasifican en base a las características que incluían la hidrofobicidad, la exposición a disolventes, y el potencial de enlace de hidrógeno. Glide inicial [32], [33] SP (precisión estándar) seguido de XP (precisión adicional) de acoplamiento de los cuatro compuestos se realizó para los sitios de unión de la parte superior 3. Sobre la base de este acoplamiento inicial, el Sitio 1 fue elegido como el sitio más probable de unión. Sitio 1, que se correlaciona con el bolsillo en el que se describe dorsomorphin, también se ocupó el primer lugar por mapa del sitio.
estudios de acoplamiento posteriores se llevaron a cabo utilizando Docking ajuste inducido (IFD) [32], [34] en el flujo de trabajo de Maestro. cuentas de flujo de trabajo para IFD la flexibilidad receptor mediante el muestreo de las orientaciones de las cadenas de sitios dentro de la región de unión al acoplamiento del ligando. conformaciones ligando múltiples están atracados en la forma y anotaron utilizando Glide. Cada ligando estaba atracado en el Sitio 1 definido por mejor puntuación del ligando plantean desde el soporte SP inicial en lugar 1. Para cada ligando IFD marcó y reportó múltiples conformaciones (~ 50) ligando-proteína a partir del cual se calculó la puntuación media IFD.
proliferación /Cytotoxiticy
Las células A549 se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 x 10
3 células por pocillo por triplicado. Después de 24 horas, las células se trataron con las concentraciones indicadas de TGF-1, dasatinib, o TGF + dasatinib combinados. Después de una incubación de 48 horas, se midió la proliferación /citotoxicidad mediante la adición de CellTiter 96 Una solución (Promega Corporation, Madison, WI). Después de la adición, se dejaron las células en incubación durante 1 hora, y la absorbancia se midió a 490 nm en un lector de microplacas Biotek EL808 (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT). Las muestras tratadas se normalizaron a los controles no tratados, con resultados que se muestran como porcentajes.
Western blotting
extracción de proteínas de células entera se llevó a cabo mediante el desguace de las células en solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) 1X, seguido por ultrasonidos y la lisis en tampón 1X CHAPS (Cell Signaling Technology). Para determinar la localización subcelular de las proteínas Smads, las células se fraccionaron en componentes nucleares y citoplasmáticos como se describe anteriormente [35]. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). lisados de proteínas se resolvieron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), se transfirió a membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore Corporation, Billerica, MA), se bloquearon durante 1 hora en 1X TBST que contiene 5% de leche sin grasa, y se incubaron durante la noche en correspondientes anticuerpo primario a 4 ° C. Las transferencias se terminaron por incubación con anticuerpo secundario de rábano marcada con peroxidasa y se desarrollaron usando el reactivo ECL de Amersham Prime Western Blot Detección (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).
ensayo de caspasa
células A549 fueron sembradas en placas de 96 pocillos a 5 x 10
3 células por pocillo. Después de 24 horas, las células se trataron con las concentraciones indicadas de TGF-1, dasatinib, o TGF + dasatinib combinado, y el jugador celular de 96 pocillos se añadió reactivo cinética caspasa 3/7 simultáneamente (Essen Bioscience). Los tratamientos se realizaron por triplicado. La incubación se realizó en una incubadora húmeda a 37 ° C y 5% de CO
2 con el sistema IncuCyte imágenes de células vivas (Essen Bioscience), lo que nos permitió capturar una imagen de cada pocillo a través de un cubo de objetivo y el filtro de GFP × 20 a intervalos de tiempo de 2 horas durante 48 horas. Las primeras y últimas imágenes de cada conjunto de imágenes se extrajeron para su análisis con Definiens Developer versión 1.5 (Definiens Inc., Munich, Alemania), y la caspasa se identificaron y segmentados con un algoritmo de segmentación autothreshold 3 células /7-positivos. Esta segmentación se refinó aún más por el tamaño del objeto, y finalmente se enumeró el número de células de caspasa 3/7. Los valores se representan como la media de la caspasa 3 células /7-positivas a partir de tres experimentos independientes.
análisis del ciclo celular
Las células A549 se sembraron a 3 × 10
5 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron con 5 ng /ml TGF-1, 100 nM de dasatinib, o vehículo (DMSO). Después del tratamiento, se recogieron las células flotantes y luego combinar con células adherentes se recogieron mediante tripsinización. Las células se resuspendieron en 1X PBS, se fijaron en 2 ml de helado de etanol 70%, y se incubaron durante 2 horas a -20 ° C. Los sedimentos celulares se recogieron por centrifugación (5000 rpm durante 5 minutos) y se resuspendieron en 400 l de yoduro de propidio (0,6 mM), Triton X-100 (v /v 0,1%), y la ARNasa A (0,2 mg /ml). Después de una incubación de 30 minutos a 37 ° C, las células fueron analizadas por el contenido de ADN utilizando un FACS Calibur (BD Bioscience, San José, CA), y se analizaron los datos utilizando el software ModFit LT V3.3.11 (Verity Software House, Topsham, ME).
siRNA experimentos
ON TARGETplus de SMART piscina siRNA contra
SHC1
,
Smad3
, y control negativo fueron adquiridos de Dharmacon (Thermo Scientific) . Cada grupo se reconstituyó en tampón 1X siRNA (Dharmacon) y se diluyó en agua tratada con DEPC a una concentración final de 20 mM. Las transfecciones transitorias se realizaron con Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Grand Island, NY). Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron después de 24 horas a 60-70% de confluencia. La lipofectamina RNAiMAX, OptiMEM (Invitrogen), y 200 pmol de mezcla de siRNA se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a las células incubadas en medio libre de suero. Después de incubación a 37 ° C durante 4 horas, se retiró el medio. Después, las células se lavaron una vez en 1X PBS, y se añadió compuesto que contiene los medios de comunicación a las células. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección para la preparación de extracción de proteínas.
Resultados
estudios de acoplamiento TβR-I
Los experimentos utilizando cromatografía de afinidad de fármacos para identificar moléculas que interactúan directamente con dasatinib han identificado más de 40 quinasas, incluyendo tirosina quinasas, tirosina quinasas receptoras, serina /treonina quinasas y MAP quinasas. Una de las quinasas serina /treonina identificados mediante este enfoque es TβR-I [17]. TβR-I tiene un dominio N-terminal rica en cisteína implicados en la unión del ligando, una única hélice transmembrana, una región citoplasmática juxtamembrane reguladora, y un dominio de serina treonina quinasa C-terminal [36]. Para examinar la unión de dasatinib para TβR-I, hemos realizado estudios de acoplamiento con la estructura del cristal ya se ha informado de la TβR-I dominio citoplasmático [18]. Tal como se describe en Materiales y Métodos, el sitio designado como Sitio 1 fue elegido como el sitio más probable de unión. En nuestros estudios, se comparó la unión de dasatinib, bosutinib (estructuralmente relacionado con dasatinib), LY-364947 (TβR I-quinasa inhibidor disponible en el mercado [37]), y dorsomorphin (originalmente utilizado en los estudios de cristalización TβR-I). Cada ligando estaba atracado en el Sitio 1 definido por mejor puntuación del ligando plantean desde el acoplamiento inicial estándar de precisión en lugar 1. Para cada ligando, inducida por acoplamiento Fit (IFD) se anotó, con múltiples (~ 50) conformaciones de proteína-ligando informaron desde el cual la puntuación media se calculó IFD (fig. 1C). Nuestros resultados del acoplamiento de los cuatro ligandos de interés mostraron que dasatinib el puntaje más alto. protocolo IFD informó que TβR-I -dasatinib formó el mejor complejo de puntuación (puntuación IFD de aproximadamente -14 742 kcal /mol), así como obtuvieron mejores resultados en promedio (puntuación IFD de aproximadamente -14 694 kcal /mol) durante todos los complejos reportados. El complejo mejor TβR-I-dorsomorphin tenía una puntuación IFD de aproximadamente -14 519 kcal /mol con el promedio de -14.469 kcal /mol. Bosutinib y LY-364947 realizan los más pobres, con los mejores complejos de proteína-ligando anotando aproximadamente a -14 353 kcal /mol y -14 154 kcal /mol, respectivamente, y un promedio de -14 313 kcal /mol y -14 119 kcal /mol. Análisis de la parte superior pose producida por el modelo de acoplamiento flexible, revela que la interacción del bosutinib con el sitio de unión implica cuatro enlaces de hidrógeno con los residuos de Pro-439, Thr-378, Asn-341 y Tyr-219 a distancias de 2,4, 2,18, 2,37 y 2,25 Å y con respectivos ángulos de 120,7, 144,8, 154,1 y 151,6 grados (Fig. 1A). Por el contrario, el dasatinib forma tres enlaces de hidrógeno con Arg-218, Asn-341 y Su-284 a distancias de 1,97, 2,00 y 2,32 Å y ángulos de 145,9, 150,3 y 139,7 grados (fig. 1B).
Ligando diagrama de interacción de bosutinib (A) y dasatinib (B) atracado en TβR-1. Ligando se representa en negro. Los enlaces de hidrógeno son etiquetados por los números próximos a la unión. Las distancias y los ángulos de cada enlace de hidrógeno como los marcados en el diagrama se dan en las tablas dentro de cada figura. (C) Sitio 1 resultados IFD. Normal (negro) y mejor (blanco) IFD puntuaciones de los cuatro compuestos atracados en el sitio basado en 1 ~ 50 poses reportados para cada compuesto. IFDScore se multiplica por -1 para claridad de la presentación.
El dasatinib afecta la respuesta a TGF-1 en líneas celulares de cáncer
Para determinar el potencial relevancia biológica de la asociación entre el dasatinib y el TβR-I, las células de cáncer de pulmón A549 cultivadas en medio completo que contiene TGF-1 se incubaron en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de dasatinib como se describe antes [9]. tratamiento individual con la proliferación de TGF-1 o dasatinib celular inhibida (45% y 34%, respectivamente; la Fig. 2A, asteriscos). Curiosamente, esta inhibición de la proliferación se incrementó cuando las células fueron tratadas con una combinación de TGF-1 y dasatinib (75% de inhibición; la Fig. 2A, dos asteriscos). El aumento de la inhibición de la proliferación era dependiente de la dosis de dasatinib. Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó la viabilidad celular para determinar el número de células (S1 figura). Para entender aún más la inhibición observada en la proliferación celular, se analizó el efecto de este tratamiento combinado sobre la progresión del ciclo celular. Después de 48 horas de tratamiento con TGF-1 y dasatinib, el aumento de células en G1 no fue significativamente diferente de cuando las células se trataron con TGF-1 solo (Fig. 2B, línea continua). Del mismo modo, con el doble tratamiento, hubo un incremento en el número de células en G2 /M después del tratamiento TGF-1, pero el aumento de las células no fue diferente de cuando las células se trataron con dasatinib solo (Fig. 2B, línea de trazos) . Por lo tanto, la reducción del número de células después del tratamiento de combinación TGF-dasatinib no puede explicarse por cambios en el ciclo celular.
células A549 (A) se trataron con DMSO, diferentes concentraciones de TGF-1 (0-10 ng /ml; barras blancas), diferentes concentraciones de dasatinib (0-400 nM; barras negras), o una combinación de TGF-1 y dasatinib (discontinua bares) durante 48 horas. El tratamiento de las células con ambos agentes resultó en incremento de inhibición (**), en comparación a cuando las células fueron tratadas con cualquier agente solo (*). (B) las células A549 se trataron con DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 nM de dasatinib, o una combinación de 5 ng /ml TGF-1 y 100 nM de dasatinib durante 48 horas. Después de 48 horas, se analizaron las células teñidas con yoduro de propidio para determinar la distribución del ciclo celular y se analizaron como se describe en Materiales y Métodos.
aumento de la apoptosis en las células tratadas con TGF en combinación con dasatinib
TGF ha sido implicado en las respuestas pro-apoptóticos, así como las respuestas anti-apoptóticos [38]; Por lo tanto, se examinó si la inhibición de la proliferación observada después de TGF combinado + dasatinib en las células A549 fue el resultado de la muerte celular por apoptosis. La apoptosis se midió por poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión después del tratamiento con la combinación de TGF-dasatinib. El dasatinib o TGF-1 solo no indujo la apoptosis como se mide por la escisión de PARP (Fig. 3A). Esto está de acuerdo con lo que se ha informado antes, donde el tratamiento de las células A549 con dasatinib no dio lugar a la apoptosis [4]. En contraste, la combinación de TGF + dasatinib dio lugar a la apoptosis, específica para co-tratamiento con dasatinib, como la incubación con un inhibidor de EGFR (erlotinib) u otro inhibidor de SRC (AZD0530) no dio lugar a la escisión de PARP (Fig. 3A). Para evaluar si se requiere
de novo
la síntesis de proteínas de TGF + apoptosis dasatinib inducida, las células A549 se trataron previamente con 10 mg /ml de cicloheximida durante 1 hora, seguido de tratamiento TGF-1 con o sin dasatinib. Como se muestra en la Fig. 3B, la adición de cicloheximida no inhibió el aumento de la apoptosis, lo que sugiere que
No se requiere novo
la síntesis de proteínas. Se examinó el efecto del tratamiento de combinación en 15 líneas celulares de cáncer (13 WT y EGFR EGFR 2 MU) y encontramos una mayor PARP división en 5 de ellos cuando son tratados con la combinación TGF + tratamiento con dasatinib (S2 Figura).
células A549 (a) fueron tratadas con 100 nM de dasatinib, 1000 nM de AZD0530, o erlotinib con o sin 5 ng /ml TGF-1 durante 48 horas. (B) células A549 se pre-trataron con 10 mg /ml de cicloheximida (CHX) durante 1 hora, seguido de TGF-1 más o menos dasatinib. Después de la incubación, las células fueron cosechadas, lisadas, y la escisión de PARP detectados por Western blot. células A549 (C) se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 x 10
3 por pocillo.
C
ells fueron tratados, y jugador de células de 96 pocillos Kinetic caspasa 3/7 reactivo se añaden simultáneamente. Los tratamientos se realizaron por triplicado. Los valores se muestran como el número medio de la caspasa 3/7 células positivas a partir de 3 experimentos independientes.
Para confirmar la apoptosis inducida por TGF dasatinib-+, se utilizó
un ensayo de la caspasa-3/7 (Incucyte) para medir simultáneamente la muerte celular y la caspasa 3/7 actividad. Como se muestra en la Fig. 3C, el tratamiento de combinación dasatinib TGF + resultó en un aumento significativo (92%) en el número de células que experimentan apoptosis en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo (22% y 19%, respectivamente). Además, la combinación TGF-dasatinib resultado la pérdida de potencial eléctrico mitocondrial y liberación de citocromo c de la mitocondria (datos no presentados), lo que sugiere que la apoptosis observada es el resultado de la activación de la intrínseca (mitocondrial) las vías de apoptosis.
efecto TGF-1-dasatinib sobre la actividad de los mediadores intracelulares TGF
TGF se ha demostrado que estimula varias vías intracelulares, incluyendo la vía Smad (vía canónica) y otros mediadores intracelulares, incluyendo p38 mitogen-activated proteína quinasa (MAPK), AKT y ERK (vías no canónicos) [39]. Por lo tanto, el próximo examinado si el tratamiento con TGF-dasatinib activa estas vías mediante el uso de anticuerpos que detectan la forma fosforilada (activa) de los mediadores de las vías tanto canónicos y no canónicos. Como se muestra en la Fig. 4, la expresión de Smad2 activado o Smad3 no se observó en los extractos de células enteras de cualquiera de las células no tratadas o tratadas con dasatinib pero no se observó después del tratamiento TGF-1 o después del tratamiento con TGF + dasatinib. Curiosamente, los niveles de fosforilados Smad3 después del tratamiento con TGF-dasatinib son más altos que los niveles observados con TGF-1 tratamiento por sí solo. El aumento de la p-Smad3 visto después de 1 hora de tratamiento de combinación TGF-dasatinib en la activación de Smad3 es transitoria, ya que no se puede ver 48 horas después del tratamiento (datos no mostrados). Esto es en contraste a la fosforilación Smad2, que se puede ver a los 5 minutos y se mantiene fosforilada hasta 48 horas. Esto podría ser debido a la considerablemente más corta vida media de Smad3 (4,7 horas) en comparación con Smad2 (12,5 horas) [40]. Pre-tratamiento con el TβR-I inhibidor LY364947, bloques Smad2 fosforilación en presencia o ausencia de dasatinib (Fig. 4B). Como era de esperar, SRC fosforilación se inhibe en presencia de dasatinib, y la incubación con TGF-1 no afecta a esta inhibición.
células de NSCLC A549 se trataron con DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 nM de dasatinib , o una combinación de 5 ng /ml TGF-1 y 100 nM de dasatinib para diferentes cantidades de tiempo (1 hora para la detección de pSmad2 y pSmad3, y 48 horas para la detección de pSrc). Después de la incubación, se recogieron los lisados de células enteras y se sometieron a transferencia Western con los anticuerpos indicados.
localización y actividad de las proteínas Smads son dependientes del estado de fosforilación en el COOH y zonas de enlazamiento [41]. Para determinar si el aumento de la apoptosis observada con el tratamiento de combinación es debido a alteraciones en la localización de las Smads, hemos examinado el efecto del tratamiento de TGF-dasatinib combinado en la localización de las Smads activos. Después de 48 horas de TGF-1 o una combinación de tratamiento de TGF-dasatinib, extractos celulares se fraccionaron y las Smads fosforilados se examinaron en cada fracción. Como se muestra en la Fig. 5A, el Smad2 fosforilados en los extremos carboxi (p-Smad2 COOH) aumenta predominantemente en el núcleo. El Smad2 fosforilados en la región de enlazador (p-Smad2 Enlazador) también aumenta después del tratamiento con TGF-1, pero una mayor cantidad permanece en el citoplasma. Curiosamente, la cantidad de fosforilados Smad3 después de TGF-1 tratamiento también se acumula en el núcleo, independiente del tratamiento dasatinib (Fig. 5B).
células A549 se trataron con DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 dasatinib nM, o una combinación de 5 ng /ml TGF-1 y 100 nM de dasatinib durante 48 horas. Después del tratamiento, se recogieron los lisados celulares y las fracciones nucleares y citoplasmáticas se separaron como se ha descrito antes [35]. Después del fraccionamiento, los lisados se sometieron a transferencia de Western con los anticuerpos indicados.
El tratamiento con combinación TGF-dasatinib no tuvo un efecto significativo en la ERK vía no canónica TGF mediadores intracelulares, AKT, o p38 (Figura S3). Además, el tratamiento con TGF-1 no dio como resultado un aumento en la activación de Shc en células A549, como se informó anteriormente para otros tipos de células [42], [43], y desmontables de la expresión de SHCA usando SHCA siRNA no tener una efecto en la apoptosis en SHCA-negativo células A549 (datos no presentados), lo que sugiere que esta vía no está implicado en la apoptosis inducida observada con el tratamiento con TGF-dasatinib.
apoptosis TGF-1-dasatinib es mediada por Smad3- BIM inducida
Smad3 se ha informado de sensibilizar a las células a los efectos apoptóticos de TGF [40], y uno de los mecanismos sugeridos es la inducción de la expresión de la proteína pro-apoptótica BIM (Bcl-2- interactuando mediador de la muerte celular) [44]. Como se muestra en la Fig. 6A, a las 24 horas después del tratamiento de combinación, se observó un aumento en la expresión de la proteína BIM de la isoforma de alto peso molecular y de la BIM molecular y más citotóxica inferior. Recientemente se ha informado de que un deleción polimorfismos BIM (que resulta en una isoforma de BIM sin el dominio BH3) están implicados en la resistencia a los inhibidores de tirosina quinasa en varios tipos de cáncer [45], [46]. Proyección de las 15 líneas celulares usando cebadores descritos en la literatura [45] que no fueron capaces de detectar la isoforma BIM en cualquiera de nuestras líneas celulares (S5 Figura). Sin embargo, desmontables de la expresión de Smad3 usando Smad3 siRNA resultó en una disminución en la cantidad de BIM después del tratamiento de combinación, lo que indica que la expresión Smad3 es necesaria para el aumento de expresión de BIM (Fig. 6B). Se ha informado de que la expresión de Smad7 previene la apoptosis mediante la inhibición de la expresión de BIM [47]. Como se puede ver en la Fig. 6A con el tratamiento de TGF-dasatinib que dio lugar a la escisión de PARP, se observó reducción de expresión de Smad7. Esta disminución de Smad7 sugiere un mecanismo para mantener la vía de TGF activo. Nuestros datos sugieren que el tratamiento de combinación de TGF y dasatinib induce la apoptosis mediante el aumento de la activación de TGF de BIM y baja regulación de TGF señales inhibitorias de la vía, tales como Smad7.
(A) las células A549 se trataron con DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 nM de dasatinib, o una combinación de 5 ng /ml TGF-1 y 100 nM de dasatinib durante 48 horas. Después del tratamiento, se recogieron los lisados de células enteras y se sometieron a transferencia Western con los anticuerpos indicados.