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PLOS ONE: fibroblastos normales inducen E-cadherina y aumentar la pérdida de ganglios linfáticos Metástasis en gástrico Cancer


Extracto

Antecedentes

Un tumoral, se encuentra un complejo heterogéneo en un entorno tridimensional que es enjuagar con señales fisiopatológicos y biomecánicos. las interacciones célula-estroma guían el desarrollo y la generación de tumores. Aquí, evaluamos las contribuciones de los fibroblastos normales al cáncer gástrico.

Metodología /Principales conclusiones

Por co-cultivo de fibroblastos normales en monocapas de BGC-823 células de cáncer gástrico, las células tumorales desarrollan esporádicamente corta, husillo -Al igual que las características morfológicas y demostró una mayor proliferación y el potencial invasivo. Además, las células tumorales transformadas demostrado disminución de la formación de tumores y el aumento de potencial metastásico lymphomatic y intestinal. No transformadas células BGC-823, en contraste, demostraron la formación de tumor primario y el retraso en la invasión nodo intestinal y la linfa. También se observó pérdida de E-cadherina y la regulación al alza de la expresión de vimentina en las células tumorales transformadas, lo que sugiere que el aumento de la metástasis fue inducida por epitelio-a-mesenquimal transición.

Conclusión

Colectivamente , nuestros datos indican que los fibroblastos normales suficientemente inducen la transición epitelio-mesenquimal de las células cancerosas, lo que conduce a la metástasis

Visto:. Xu W, X, Hu, Chen Z, X Zheng, Zhang C, G Wang, et al. (2014) Los fibroblastos normales inducir el E-cadherina y la pérdida Aumento de ganglios linfáticos metástasis en el cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10.1371 /journal.pone.0097306

Editor: Elad Katz, AMS Biotecnología, Reino Unido

Recibido: Diciembre 10, 2013; Aceptado: April 16, 2014; Publicado: 20 de mayo de 2014

Derechos de Autor © 2014 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyado por becas de la Caja Nacional de Salud llave especial (http://program.most.gov.cn; No.200802112), el Comité Nacional de Ciencia Fondo (http://www.nsfc.gov.cn; n general del proyecto .81372302 No.81272120), el Fondo del Departamento de Salud (http://program.most.gov.cn; No.2007A093), el Proyecto llave de la provincia de Zhejiang (http://www.zjkjt.gov.cn; N 2013C030445 2009C030125). El Fondo de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121, y Z2080514), y el Fondo de Medicina Tradicional China Oficina (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Las metástasis son responsables de hasta el 90% de la mortalidad asociada al cáncer. Muchos pacientes que muestran ninguna evidencia de metástasis en el momento del diagnóstico inicial con el tiempo desarrollarán metástasis. Aunque las metástasis causan la mayoría de las muertes por cáncer, este proceso sigue siendo uno de los aspectos más enigmáticos de la enfermedad.

células tumorales metastásicas entren en el tejido a través de la extravasación. El tejido, sin embargo, se somete a procesos poco claros por el que las células están incrustados en la matriz de tejido y entran en contacto directo con las células del estroma, la mayoría de los cuales son los fibroblastos normales. Las células tumorales tienen todas las posibilidades de entrar en contacto con las células del estroma, incluyendo las células neoplásicas y metastásicas [1]. Esto conduce a la recíproca diafonía con fibroblastos normales en el tejido.

Los fibroblastos son las células del estroma más abundantes, y que estimulan el microambiente y sirven como una fuente rica para la vía paracrina durante la tumorigénesis y progresión. Los efectos de los fibroblastos normales en células tumorales están en disputa. Se ha informado de que los fibroblastos normales suprimen la conversión maligna del epitelio de próstata inmortalizada [2], mientras que en los tumores de mama, los fibroblastos se transforman en carcinoma ductal carcinoma invasivo [3].

Este desacuerdo indica que la influencia de los fibroblastos sobre las células tumorales es diferente que para los CAF (fibroblastos asociados con cáncer). Para este estudio, se cocultivaron células tumorales con los fibroblastos normales en placas de Petri con el fin de imitar cómo las células tumorales en contacto con fibroblastos. Nos centramos en la contribución de los fibroblastos normales de cáncer gástrico. Nos cultivadas Las fibroblastos normales para formar monocapas densos, que a continuación se difunden con células tumorales con el fin de imitar las células tumorales metastásicas. La hipótesis de que la alta proporción de fibroblastos de células tumorales podría imitar los tejidos donde residen las células tumorales con metástasis. Por lo tanto, se utilizaron fibroblastos dérmicos de individuos sanos para producir el entorno celular. La línea celular de cáncer gástrico, BGC-823, se utilizó aquí porque es morfológicamente distinta de fibroblastos.

Se obtuvieron Materiales y Métodos

Declaraciones éticas

tejidos dérmicos humanos primarios de los niños que se sometieron a la circuncisión después de obtener el consentimiento informado por escrito de sus cuidadores, que fue incluida en sus registros médicos. Este experimento fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional del Segundo Hospital Afiliado de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang de (código de revisión ética: Investigación 2013-047). Los pacientes incluidos en este estudio se les proporcionó una copia del consentimiento informado por escrito y le dieron permiso para publicar.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo de Ciencia y Tecnología de China. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Zhejiang.

Reactivos y anticuerpos

La penicilina G /estreptomicina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), Triton X-100, bovino albúmina de suero, colagenasa de tipo I, y la tripsina se adquirieron de Jinuo (china). DMEM de alta glucosa se obtuvo de Gibco (China), y suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Gibco (SA). El cisplatino, 5-fluorouracilo, puromicina, y colágeno de tipo I fueron adquiridos de Sigma (EE.UU.). El cisplatino se disolvió en dimetilformamida (DMF), 5-fluorouracilo en DMSO, y puromicina en PBS con el fin de hacer que las soluciones madre se almacenaron a -20 ° C. El colágeno tipo I (5 mg /ml) se diluyó a 1 mg /mL. DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol · HCl) en PBS se obtuvo de Roche, y de cabra anti-ratón y IgG de conejo, anticuerpo secundario-TIRTC, y anticuerpos secundarios se obtuvieron de Bio-ZSGB (China). conejo antihumano-E-cadherina (ab40772), conejo antihumano-vimentina (ab92547), y anticuerpos de conejo antihumano-β-catenina (ab9274) se obtuvieron de Abcam (UK). Antihumana-pan-CK anticuerpo de ratón (C11) y anticuerpo de conejo N-cadherina (C4061) se obtuvieron de Cell Signaling Technology (China), y anti humana-β-actina y los anticuerpos anti-conejo de cabra secundaria se obtuvieron de Boster (China) . Los anticuerpos se diluyeron con FBS al 5% a las concentraciones de trabajo a menos que se indique lo contrario.

Cell Culture

La línea celular establecida, las células de cáncer gástrico humano BGC-823 utilizados en nuestro experimento se adquirieron en el banco de células de Guangzhou Instituto de Biomedicina y Salud. Las células se descongelaron y se pasaron por 4-5 veces y luego se utilizaron en los experimentos de co-cultivo. fibroblastos dérmicos primarios se obtuvieron de las muestras quirúrgicas de los niños que se habían sometido a la circuncisión y dieron su consentimiento informado. Los fibroblastos fueron utilizados después de que el tercer paso (dentro de los 50 pasajes), cultivadas en DMEM de alta glucosa que contenía FBS al 10%, y se mantuvieron en un incubador humidificado (5% de CO
2) a 37 ° C. El medio celular se sustituyó cada dos días.

Para la generación de los TBGCs, los fibroblastos (FBS) y células BGC-823 se cocultivaron en una proporción de 10:01 durante 10 días adicionales después de las células cultivadas alcanzado la confluencia. se observó la formación de cúpula en el sistema de co-cultivo. Después, la mezcla de células se pasó por tripsinización con fibroblastos frescos (1 × 10
6 células /ml). Durante la segunda y siguientes pasajes, la formación de fatalidad aparente y las células con forma redonda en suspensión aparecido que presentaban diversas características morfológicas y apego prolongado después de su paso. Después del quinto paso de las células suspendidas mixtas y fibroblastos normales densos, uniformes, las células cortas, de tipo huso denominado "TBGCs" se produjeron y no demostraron la reversión morfológica de las células BGC-823 hasta & gt;. 10-15 pasajes

Ensayo de proliferación

exponencialmente se sembraron las células que crecen en placas de 96 pocillos durante 6 días adicionales de incubación a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera. La proliferación celular se midió por quintuplicado cada día pipeteando 20 l CellTiter 96 acuoso Una solución de reactivo (Promega, EE.UU.) en cada pocillo que contenía DMEM 100 l alta de glucosa, a continuación, se incubaron las células durante otras 2 horas antes de la determinación de la absorbancia relativa a 490 nm usando un lector de placa de microtitulación.

Droga Ensayo de inhibición de

Cinco duplicaciones de células de crecimiento exponencial se sembraron en un placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas. Después de 24 horas, el medio se sustituyó con diferentes concentraciones de fármacos (0-80 mM) y se cultivaron durante 24 horas adicionales. La toxicidad del fármaco se evaluó mediante la medición del número de células viables usando el ensayo de proliferación descrito más arriba.

Rascar Ensayo

Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (5 x 10
4 células /bien) y se cultivaron hasta confluencia. Puntas de pipeta se utilizaron para generar los arañazos. PBS se utilizó para eliminar los residuos celulares, a continuación, se reemplazó con medio FBS-libre. Se obtuvieron imágenes por 3 días consecutivos. La anchura de la cero se midió utilizando software ImageJ 1.47 para Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) y se representa como la distancia cero por día.

migración y la invasión de ensayo

ensayar la motilidad celular se realizó utilizando transwell insertos (8 micras de tamaño de poro) (Corning, EE.UU.). Las células-GFP (proteína verde fluorescente) (1 × 10
5/500 l) se suspendieron en medio FBS-libre y se colocan por encima de los insertos por triplicado, con medio de cultivo 800 l cargado debajo. Después de la incubación durante la noche, los insertos se lavaron 3 veces con PBS y se limpió con un hisopo mojado por encima de donde se fijaron con PFA al 4% y a continuación se observa usando un microscopio de fluorescencia (Olympus, Japón). El mismo procedimiento se utiliza para realizar el ensayo de invasión, pero se utilizaron insertos que fueron recubiertas previamente con Matrigel (BD, EE.UU.). Ambos ensayos se cuantificaron como el número de células contadas en 5 campos aleatorios (200 aumentos).

Apoptosis Ensayo
se midieron las células
apoptóticas usando el V-FITC kit de detección de apoptosis con anexina (Keygen, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se dejaron sin tratar o se trataron con fármacos durante 24 horas, y después se recogieron, se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en tampón que contiene 5 l de FITC-anexina V y 5 l PE de unión, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. El análisis se realizó mediante citometría de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson, EE.UU.). Se prepararon

Cuantitativo PCR en tiempo real

Los extractos nucleares usando el mini-kit RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN purificado (1 mg) en agua DEPC fueron transcrito de forma inversa usando el kit de PrimeScript II 1ª Strand cDNA de síntesis (Takara, China). RT-PCR y amplificación se realizaron utilizando el kit de SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara).

Un sistema de reacción de 20 l que contiene 1 l diluido muestras de cDNA, 10 l SYBR Premezcla Ex Taq II (2 ×), 0,4 l ROX referencia tinte (50 ×), 7 l estéril bidestilada H
2O, y 1 mu l adelante y atrás primers (ver Materiales y Métodos S1) Se prepararon y evaluaron usando análisis de la curva de fusión y la comparativa ciclo umbral (Ct) Método. Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo: 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 58 ° C durante 1 minuto. GAPDH se utilizó como gen de control.

Western Blot Analysis

Las proteínas se extrajeron a partir de células en crecimiento exponencial y tejidos primarios. Los extractos se hirvieron en tampón de carga, se resolvieron en 10% de Tris-HCl geles de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, EE.UU.), utilizando métodos estándar. Las membranas se bloquearon utilizando 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron con TBST y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra E-cadherina (1:5000), vimentina (1:5000), β-catenina (1:5000), N-cadherina (1:1000), y β-actina (1:1000). Después del lavado, se añadieron 3 veces con TBST secundario de cabra anti-conejo (1:1000) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, los complejos inmunes se visualizaron mediante quimioluminiscencia utilizando ECL (Electro Química luminiscencia) (Millipore). La concentración de proteína se normalizó a ß-actina.

Los análisis histológico e inmunohistoquímico

Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, almacenado a -80 ° C, fijadas en PFA al 4%, y se seccionaron a un espesor de 10 micras (Leica, Alemania).

para hematoxilina y eosina (HE) tinción, los portaobjetos desparafinados se tiñeron con hematoxilina durante 15 minutos, se lavó 3 veces con PBS, ácido alcohol durante 5 segundos, a continuación, eosina durante 5 minutos (Boster, China).

para la tinción inmunohistoquímica, las diapositivas se rehidratan y recuperación de epítopo inducida por calor se llevó a cabo en tampón citrato, usando una olla a presión (20 minutos a 80 pKA), se bloquearon con 3 % H
2O
2 durante 15 minutos y, a continuación suero normal de cabra se aplicó (30 minutos a temperatura ambiente). Las láminas fueron incubadas en los siguientes anticuerpos primarios: anti-E-cadherina (1:250), anti-vimentina (1:250), anti-β-catenina (1:250), y anti-pan-CK (1:250 ). Las muestras se incubaron durante la noche a 4 ° C, se enjuagó dos veces con PBS, y se incubaron con el anticuerpo secundario durante 2 horas a 37 ° C. DAB Plus cromógeno kit (Boster) se utilizó para detectar todos los antígenos. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina, deshidratados, y montadas con cubreobjetos utilizando balata neutro. Ambos análisis se realizaron por separado por los patólogos y médicos que estaban ciegos a los grupos de la muestra. Las disputas se resolvieron por consenso.

inmunofluorescencia y microscopía confocal de

Las células se sembraron en portaobjetos de cámara, y las secciones congeladas se fijaron con PFA al 4% y se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100. Los portaobjetos se bloquearon con suero normal de cabra durante 1 hora a 37 ° C, se enjuagó y se incubó durante la noche con anticuerpos primarios a 4 ° C, después se transfirió y se incubó con anticuerpos de cabra anti-ratón y anti-conejo-TIRTC durante 1 hora a 37 ° C en la oscuridad. Las láminas fueron lavadas usando glicerina y montado con cubreobjetos. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. La fluorescencia se detecta utilizando un microscopio de escaneo láser confocal (Olympus). Las criosecciones desparafinados se tiñeron con DAPI y se analizaron usando un microscopio de inmunofluorescencia.

Modelo Animal

Ochenta y cuatro semanas de edad ratones hembra BALB /c fueron comprados desde el Centro de Investigación Animal de Shanghai y mantenidos en el centro animal de experimentación de la Academia de Ciencias Médicas de Zhejiang. De acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo de Ciencia y Tecnología de China, todos los animales se mantuvieron en condiciones estériles asépticas y se administran los alimentos y el agua tratada en autoclave de acuerdo con los Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Zhejiang. Cuarenta y cuatro ratones fueron utilizados en el modelo subcutáneo, y se dividieron de manera uniforme en los grupos de control y de experimentación. Los BGC-GFP se utilizaron como control, donde los TBGC-GFP eran usos como el experimento. Se recogieron las células tumorales durante la fase de crecimiento, y se suspendieron en medio libre de FBS (1 × 10
6 células /ml). Las células se pipetearon a suspensiones de una sola célula, y cada solución de 500 l se inoculó por vía subcutánea en ambos lados del pecho. Los ratones fueron sacrificados cada 2 semanas hasta 10 semanas, y se llevaron a cabo exámenes patológicos. Todos los ratones se pesaron cada 3 días. Todas las cirugías se realizaron bajo pentobarbital de sodio al 1%, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento
.
Treinta y seis ratones fueron utilizados en el grupo de inyección en la vena para la evaluación de la distribución del cáncer (18 ratones en el grupo de control BGC-GFP y 18 ratones del grupo experimento TBGC-GFP). 500 l suspensión de células (5 × 10
5 células) se inyectó en la vena de la cola de ratones desnudos. Los ratones se sacrificaron a las 2
ª, 5
ª, 8
y 10
ª semanas para el examen patológico.

Análisis estadístico

Se recogieron los datos experimentales y entró en hojas de cálculo. pruebas de normalidad se realizaron antes de comparar los datos. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante
t de Student
. Se utilizó un análisis unidireccional de varianza para comparar & gt; 3 grupos, y el método de Tukey se utilizó para
post hoc
comparaciones de grupos. En este estudio,
p Hotel & lt; 0,05 se considera estadísticamente significativo. SPSS 20.0 para Windows (SPSS Statistics IBM, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) se utilizó para realizar todos los análisis estadísticos. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) se utilizó para generar todas las presentaciones gráficas

Resultados

1. Los cambios morfológicos en BGC-823 células Las células estromales mimick

Los fibroblastos (FB) y las células BGC-823 fueron cocultured en una proporción de 10:01 a 10 días adicionales después de las células cultivadas alcanzaron la confluencia. Después, la mezcla de células se pasó por tripsinización con fibroblastos frescos (1 × 10
6 células /ml) (Figura 1.1). se observó la formación de cúpula en las células BGC-823 después del primer paso. Durante la segunda y siguientes pasajes, suspendieron las células en forma de ida y aparecieron en el sistema cultivadas: algunos agregados en grupos o grupos y fueron conectados débilmente a la superficie de los fibroblastos. Las células se cultivaron en paralelo-BGC-823 demostraron sólo unas pocas células con forma redonda en la base cuando la cultura se convirtió en hacinamiento. Las células mezcladas en suspensión exhiben diversas características morfológicas y prolongada después del paso de unión. Estas células demostrado ya sea un aspecto en empedrado parecido similar a BGC-823 células o características cortas de huso similares. Uniforme, células cortas, de tipo huso fueron producidos por el paso de las células suspendidas mixtas y fibroblastos normales densos. En contraste, el paso del sobrenadante de las células BGC-823 sólo demostró desechos después de 24 horas de cultivo, en la que pequeñas cantidades de células sobrevivieron para formar clones de adoquines-como similares a las células BGC-823 parentales (Figura 1.3A-H).

Figura 1.1. Esquemática del protocolo experimental. Figura 1.2. Origen de las células del sobrenadante. (A) BGC-823 células GFP-etiquetados (verde). (B) BGC-823 células que fueron cocultivadas con fibroblastos (rojo). (C) BGC-823 células crecieron en cúmulos y formas redondas demostrado en suspensión. (D) TBGCs fueron inducidos por cocultivo. 100 × magnificación. Figura 1.3. La transformación de las células BGC-823 a TBGCs bajo un microscopio de contraste de fase. (A-D) BGC-823 células en un sistema de cultivo denso pueden formar agrupaciones y arrojar fuera de las células en la suspensión. (E-H) La aprobación de las células tumorales en suspensión. Figura 1.4. tinción de inmunofluorescencia de pan-CK (rojo), E-cadherina (rojo), vimentina (rojo) y N-cadherina (rojo). BGC-823 células (arriba) y TBGCs (abajo) fueron marcadas con GFP (verde). El núcleo fue teñido con DAPI (azul). Figura 1.5. parcela de calor de los perfiles de expresión de genes analizados utilizando fluorescencia de RT-PCR cuantitativa. La profundidad de la color indica la expresión génica relativa. Figura 1.6. Las transferencias Western de las proteínas. Figura 1.7. diagrama de barras de la expresión de la proteína determinada mediante análisis de transferencia Western. Barras indican los niveles de expresión relativos medidos usando IOD. Las líneas verticales indican diferencias estándar. ** P & lt;. 0.01

se realizaron experimentos posteriores para determinar la fuente de las células suspendidas en el sistema cocultured. BGC-823 células y los fibroblastos se transfectaron con el cassette GFP-puro y el casete RFP-puro, respectivamente, y se nombran BGC-GFP y FB-RFP, respectivamente. Después de co-cultivo, BGC-GFP se convirtió en multicapas y formó una estructura en forma de cúpula. Mientras tanto, las células con forma redonda o esferoide que fueron suspendidas en los medios de comunicación se transfirieron a placas de cultivo y se marcaron con fluorescencia verde, lo que demuestra que el co-cultivo a largo plazo con los fibroblastos induce la transformación BGC. Las células redondas y esferoides que fueron suspendidas en el medio, también se observaron utilizando fluorescencia verde y podrían ser pasados ​​sin la adición de fibroblastos (Figura 1.2A-D). Después de varias rondas sucesivas de co-cultivo, las células transformadas BGC-823 (TBGCs) se obtuvieron de que apareció más uniforme, corta, y de tipo huso. Estas células se pasaron sin la adición de los fibroblastos. Curiosamente, estas células eran más propensos a formar estructuras esferoides que las células que crecieron hasta confluencia y no demostraron la reversión morfológica de BGC-823 células hasta & gt;. 10-15 pasajes

Un estudio informó de que los fibroblastos inhiben el crecimiento de otras células cuando cocultured
in vitro fotos: por el mecanismo de inhibición por contacto [4]. En nuestros experimentos, sin embargo, los fibroblastos normales no en contacto con-inhiben la proliferación de células BGC-823. En su lugar, FB-RFP pereció gradualmente con la proliferación BGC-GFP cuando el cultivo se extendió a 10 días. Por lo tanto, se requiere un complemento de FB consecutiva al paso y mantener la producción estable de TBGCs. También se observó que cuando se añadió una pequeña cantidad de TBGCs a la lámina de fibroblastos confluente, las células tumorales que crecían fuera fueron empujados fuera por los fibroblastos. En el centro de la colonia tumoral, fueron de ida y forma de las células, con archivos adjuntos simplemente sueltos a la base (Figura 1.3A-H).

2. La transición epitelio-mesenquimal de BGC-823 Cell para TBGC

-PCR en tiempo real se utilizó para analizar la expresión de ARNm. Los resultados muestran que la expresión de E-cadherina se downregulated notablemente junto con la regulación al alza de la vimentina en TBGCs. Mientras tanto, las expresiones de giro, caracol, barra, y N-cadherina fueron upregulated (Figura 1.5). La tinción de inmunofluorescencia y blot confirman la pérdida de E-cadherina Occidental y el aumento de la expresión de vimentina, N-cadherina, y β-catenina (Figura 1.4), lo que confirma que la transición epitelio-mesenquimal a largo plazo (EMT) se produce en TBGCs. E-cadherina es un sello distintivo probada de EMT y mantiene unión célula-célula en el epitelio. pérdida de E-cadherina podría dar lugar a que el tumor derramar más células fuera de la masa tumoral.

3. Proliferación, invasión, y la movilidad de TBGCs

TBGC proliferación se analizó usando el ensayo de MTS. TBGCs demostró una tasa de proliferación acelerada (
p Hotel & lt; 0,01) (Figura 2.1). La citometría de flujo (ver Materiales y Métodos S1) muestra que el 13% de TBGCs se retiene en la fase S, en contraste con sólo 7% de BGC-823 células (Figura S1.3). El ensayo de rascado indica que TBGC la motilidad aumentó en comparación con las células BGC-823 paternos (Figura 2.2-2.3A-H). TBGC anastomosis requiere 3 días después de la iniciación de los arañazos, mientras que & gt; se necesitan 4 días para las células BGC-823 (
p Hotel & lt; 0,05). (Figura 2.2)

Figura 2.1. la representación lineal del ensayo de proliferación. Las líneas verticales indican diferencias estándar. ** P & lt; 0,01. Figura 2.2. La representación lineal del ensayo de rascado. Las líneas verticales indican diferencias estándar. ** P & lt; 0,01. Figura 2.3. Rascarse ensayo de BGC-823 células (arriba) y TBGCs (abajo) bajo un microscopio de contraste de fase. (A-D, E-H) Tiempo de inicial a 72 horas. Figura 2.4. Diagrama de cajas de los ensayos invasivos y migración. Las diferencias entre BGC-823 células y TGBCs son significativas (p & lt; 0,01). Figura 2.5. Los 2 mejores fotos muestran los resultados del ensayo transwell modificado invasiva con Matrigel. Imágenes representativas de los ensayos de invasión Transwell para (A) y BGC TBGC (B). se muestran las células invasoras la parte inferior de la pieza de inserción transwell. Las 2 últimas fotos son imágenes representativas de los ensayos de migración transwell para (C) BGC y (D) TBGC. se demostró que las células que migran a la parte inferior de la inserción transwell.

Los resultados de los ensayos de invasión de Matrigel muestran que TBGCs son más agresivos que las células BGC-823. En total, 683.67 ± 170.83 TBGCs se infiltraron en el Matrigel en comparación con 188.33 ± 58.62 BGC-823 células en el grupo control (
p Hotel & lt; 0,01) (Figura 2.4, Figura 2.5 A, B). Sin embargo, TBGCs demostró una reducción significativa en las células migradas: 2 veces menos que las células BGC-823 de acuerdo con el ensayo de migración transwell (
p
& lt; 0,01) (Figura 2.4, Figura 2.5C, D). La naturaleza condicional de las TBGCs podría explicar esta reducción, la tasa de adhesión fue sólo 68,33 ± 10,41% en TBGCs en Matrigel, mientras que el 99,77% ± 6,25% en las células BGC-823, demostró unión lenta a la superficie de Matrigel en TBGCs (Tabla S1) .

para imitar mejor
in vivo
el comportamiento del tumor, se utilizó gel de colágeno de tipo I para determinar la relación entre los fibroblastos y las capacidades invasivas de BGC-823 células y TBGCs. gel de colágeno de tipo I se preparó sobre los insertos transwell con fibroblastos (véase Materiales y Métodos S1). geles de fibroblastos-cargado se cultivaron durante 7 días, y luego se sembraron células de cáncer de GFP-etiquetados sobre el gel y se cultivaron durante los siguientes 7 días. La inspección de los geles cosechadas reveló que las células tumorales habían penetrado en los geles de colágeno. Cuando los geles se cargaron con fibroblastos, TBGCs exhibió capacidad invasiva más reforzada que las células BGC-823, como se indica por el número de células que se infiltró en los geles (Figura S1.2).

4. Expuesto TBGCs resistencia a cisplatino

A continuación, se evaluó la sensibilidad de TBGCs a agentes quimioterapéuticos estándar con cáncer gástrico. Viables BGC-823 células y TBGCs se determinaron después de 24 horas de exposición a cisplatino (0, 20, 40, 60, 80 M) mediante la medición de la incorporación de MTS. Los resultados demuestran que TBGCs exhibió notable resistencia al cisplatino, mientras que pocas células BGC-823 sobrevivieron cuando la concentración de cisplatino fue elevada a 40 M (
p
& lt; 0,001) (Figura 3.1). TBGCs viables incluso podría ser detectado cuando la concentración de cisplatino fue elevado hasta 200 mM (datos no mostrados). Se realizó el análisis de células contra la apoptosis mediante citometría de flujo para validar la resistencia a cisplatino. Los resultados muestran que la tasa de supervivencia de TBGCs estaba por 42,40% en comparación con 13,80% para las células BGC-823 después del tratamiento con 40 M de cisplatino durante 24 horas (Figura 3.3 a 3.4). Sin embargo, cuando son tratados con 5-FU, no hubo diferencias significativas en la inhibición de tumores entre TBGCs y células BGC-823 de acuerdo con el ensayo de MTS (Figura 3.2). Tanto las células tumorales demostraron la quimio-resistencia a 5-FU (Figura 3.2).

Figura 3.1. diagrama de puntos de veinticuatro horas de la prueba de inhibición de cisplatino. ** P & lt; 0,01. Figura 3.2. diagrama de puntos de veinticuatro horas de la prueba de inhibición de 5-FU. Figura 3.3. La citometría de flujo se utilizó para evaluar la apoptosis en células de BGC y TBGC después de la exposición a diferentes concentraciones de cisplatino (20, 40 M) durante 24 horas. Las células se tiñeron con Anexina V-FITC (marcador de la apoptosis) y yoduro de propidio (PI) (marcador de células muertas). Figura 3.4. diagrama de barras de la apoptosis inducida por cisplatino en BGC-823 células y TBGCs. Gráfico de barras que muestra el porcentaje de células apoptóticas según la citometría de flujo. ** P & lt;. 0,01 vs células en los pocillos de control de sulfóxido de dimetilo (DMSO)

5. TBGCs de exposición
En vivo
de ganglios linfáticos Propensión

Para determinar el
in vivo
distribución de TBGCs, 5 × 10
se inyectaron 5 BGC-823 células o en TBGCs la vena de la cola de los ratones BALB /c. se observaron dos semanas después de la inyección, la varianza en auxiliar y cervical ganglios linfáticos metástasis en ambos grupos, como se indica por la evaluación de un trazador fluorescente (Figura 4.3A-F). se encontraron células positivas para GFP en el ganglio linfático inguinal auxiliar y en ambos grupos (Figura 4.3a, B, D, E). Sin embargo, las células GFP-positivas aparecieron solamente en los pulmones de los ratones en el grupo de BGC (Figura 4.3c, F).

Figura 4.1. El riesgo acumulado de los ganglios linfáticos metástasis en diferentes grupos que recibieron inyecciones vena de la cola. Figura 4.2. Tinción HE (a las 10 semanas) de órganos en el grupo que recibió inyecciones de vena. La positividad se observó en los intestinos de ambos grupos y en los pulmones de los grupos de BGC. No se encontraron metástasis hepáticas o renales evidentes. Figura 4.3. rastreo fluorescente de las células tumorales en la semana 2 en los grupos que recibieron inyecciones vena de la cola. Las células tumorales se marcaron con fluorescencia verde como se indica por las flechas amarillas. El núcleo fue teñido con DAPI (azul). 100 × magnificación. Figura 4.4. La tinción inmunohistoquímica para la E-cadherina y β-catenina en los ganglios linfáticos de los grupos que recibieron inyecciones de la vena de la cola en cada punto de tiempo. 200 × magnificación. Figura 4.5. diagrama de barras de los niveles relativos de expresión de E-cadherina y β-catenina en los ganglios linfáticos de los grupos que recibieron inyecciones vena de la cola en cada momento. ** P & lt; 0,01; * P & lt;.
0,05
En la semana 5, además de una amplia invasión de los ganglios linfáticos, también se observó infiltración de órganos. Más invasión de los ganglios linfáticos se observó en el grupo de TBGC que el grupo control BGC en cada punto de tiempo (Figura 4.1, Video S1). Estos ganglios linfáticos se determinó que eran pan-CK positivo (Figura S2.1). También observamos diferente TBGC y distribución BGC en los órganos. TBGCs se limitan a los tejidos gastrointestinales, mientras que BGCS se acomodaron en los pulmones y los intestinos (Figura 4.2A-H). En la semana 5, la metástasis intestinal se observó por primera vez en 3/4 ratones que fueron inyectados con TBGCs, mientras que sólo 25% ratones demostraron metástasis intestinales visibles después de la inyección BGC (Figura S2.3).

A medida que los tumores desarrollados, el número medio de metástasis intestinales TBGC aumentó (5,6 ± 3.911
vs
3,5 ± 1.914 BGCS en la semana 8; 6,33 ± 1,52
vs
5.6 ± 1.342 en la semana 10) (Figura S4.2) . Curiosamente, 3 de 5 ratones del grupo TBGC demostraron neoplasias megascópica en el gastrum después de 10 semanas, no se observó en el grupo de BGC. metástasis pulmonares megascópica se encontraron en 3 de 4 ratones BGC en la semana 8. Sin embargo, no se observaron metástasis pulmonares TBGC visible en la semana 10 (Figura 4.2A-H). La inspección microscópica reveló la infiltración de TBGCs a la linfa cervicales y axilares tan pronto como 1 semana después de la inyección en vena de cola, mientras que BGCS necesarios más tiempo (3 semanas) para entrar en estos ganglios linfáticos (Figura 4.1). Cinco semanas después de la inyección de células, se observó infiltración pulmonar en el grupo de BGC. Sin embargo, no se detectaron en los órganos TBGCs hasta 10 semanas después de la inyección (Figura 4.2b, F, Figura S2.3).

La tinción inmunohistoquímica indica el aumento gradual de la E-cadherina en los ganglios linfáticos del grupo TBGC , mientras que la expresión de E-cadherina se redujo ligeramente en el grupo de BGC (
p Hotel & lt; 0,01) (Figura 4.4A-P). Las diferencias fueron significativas a las 8 y 10 semanas, cuando la expresión de E-cadherina era mucho mayor en el grupo TBGC comparación con el grupo BGC (Figura 4.5).

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