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PLOS ONE: histona deacetilasa 1 /SP1 /microARN-200b Cuentas de señalización para el mantenimiento de las células de vástago como el cáncer de pulmón humano Adenocarcinoma


Extracto

La presencia de células madre, como el cáncer (CSC) es uno de los mecanismos responsables de la quimio-resistencia que ha sido un obstáculo importante para el tratamiento de adenocarcinoma de pulmón (LAD). Recientemente, hemos identificado microRNA -200b (MIR) como un regulador clave de la quimiorresistencia en las células LAD docetaxel resistente humanos. Sin embargo, si el miR-200b tiene efectos sobre la regulación de células madre cancerosas sigue siendo en gran medida poco clara y debe ser estudiada posteriormente. Aquí, mostramos que el miR-200b se downregulated significativamente en CD133
+ /CD326
+ células que exhiben propiedades de células madre cancerosas derivadas de células LAD docetaxel resistente. Además, la restauración de miR-200b podría inhibir el mantenimiento y la quimio-resistencia de los CAC inversa. Por otra parte, supresor de zeste-12 (Suz-12) fue identificado como un objetivo directo y funcional de miR-200b, y el silenciamiento de Suz-12 phenocopied los efectos de miR-200b en células madre cancerosas. Además, la sobreexpresión de la histona deacetilasa (HDAC) 1 fue identificado como un mecanismo fundamental responsable de la represión de miR-200b en los CAC a través de una proteína de especificidad (Sp) mecanismo de 1-dependiente, y la restauración de miR-200b por la represión HDAC1 suprimió significativamente la formación de células madre cancerosas y revertido la quimio-resistencia de células madre cancerosas mediante la regulación de la señalización de Suz-12-E-cadherina. Además, regulación a la baja de HDAC1 o regulación al alza de miR-200b redujeron el
in vivo
tumorigenicidad de las células madre cancerosas. Por último, Suz-12 se correlaciona inversamente con el miR-200b, una correlación positiva con HDAC1 y hasta regulado en los tejidos LAD docetaxel resistente en comparación con los tejidos sensibles a docetaxel. En su conjunto, el /miR-200b /señalización Suz-12-E-cadherina HDAC1 podría explicar el mantenimiento de células madre cancerosas y la formación del fenotipo quimioresistente en las células LAD docetaxel resistente

Visto:. Chen DQ, Huang JY, Feng B, Pan BZ, De W, Wang R, et al. (2014) de la histona deacetilasa 1 /SP1 /microARN-200b Cuentas de señalización para el mantenimiento de las células de vástago como el cáncer de pulmón humano adenocarcinoma. PLoS ONE 9 (10): e109578. doi: 10.1371 /journal.pone.0109578

Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América

Recibido: 17 Junio, 2014; Aceptado: 1 de septiembre de 2014; Publicado: 3 Octubre 2014

Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov.cn/) (LBC n . 81272474, BF No. 81301914). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de pulmón para la mayoría de las muertes por cáncer en hombres y mujeres en todo el mundo [1]. La quimioterapia es un componente importante de las terapias de primera línea para el adenocarcinoma de pulmón (LAD) que constituye la forma histológica más común de cáncer de pulmón. Sin embargo, la quimiorresistencia representa un obstáculo predominante hacia el tratamiento quimioterapéutico de LAD, que conduce a un mal pronóstico de los pacientes. Por lo tanto, la exploración de los posibles mecanismos moleculares implicados en la quimio-resistencia se ha convertido en una cuestión clave en el tratamiento clínico de LAD humana.
Células
Cáncer madre-como (CSC) o las células madre tumorales que inician son una subpoblación de células tumorales y desempeñar un papel fundamental en la iniciación del cáncer, la progresión, recurrencia y la quimio-resistencia [2] - [5]. Los CCC, derivada de ambas células madre cancerosas y no las CSC, dan lugar a los tumores a través de auto-renovación y son capaces de diferenciarse en múltiples tipos de células [6] - [9]. Muchas terapias para el cáncer, incluyendo quimioterapias que matan a la mayoría de las células cancerosas, en última instancia, puede fallar ya que no eliminan células madre cancerosas que entonces causan una recaída de tumores [10]. Recientemente, se ha establecido firmemente que las CSC están vinculados a epitelio-mesenquimal transición (EMT), metástasis, resistencia a los medicamentos, la progresión y la recaída de cáncer de pulmón [11] - [15]. Como resultado, la explotación de las terapias específicas dirigidas a las CSC ha sido un tema crucial en el tratamiento quimioterapéutico del cáncer de pulmón. Los microARN (miARN) la expresión de genes silencio mediante la unión a la región 3 'no traducida de los genes diana y se han reportado para regular CSC auto-renovación, la tumorigenicidad, la metástasis, y la quimiorresistencia en muchos cánceres humanos [2], [7], [ ,,,0],dieciséis]. Por ejemplo, la represión de miR-34a hace que las CSC de colon para llevar a cabo la división celular asimétrica y promueve las células hijas a permanecer células madre cancerosas de colon mediante la regulación de la señalización de Notch. Regulada por incremento de miR-143 en la diferenciación de células madre cancerosas de próstata promueve la metástasis de cáncer de las células mediante la modulación de la expresión FNDC3B. MiR-21 regula fenotipo EMT y la expresión del factor inducible por hipoxia 1α en la tercera esfera de la formación de células similares a las células madre del cáncer de mama. MiR-200b, un miembro importante de miR-200 familias, se encuentra en el miR-200b cluster /c /gen 429, actúa como un supresor de tumores en una variedad de tumores sólidos humanos y tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de células madre cancerosas y la inversión de la EMT fenotipo de las células madre cancerosas [17], [18]. Recientemente, hemos identificado miR-200b como un regulador clave de la quimiorresistencia y restauración de miR-200b invierte significativamente quimiorresistencia de las células LAD resistentes docetaxel (DTX) mediante la inducción de la detención del ciclo celular y la mejora de la apoptosis [19]. Sin embargo, si el miR-200b regula células madre cancerosas derivadas de células LAD docetaxel resistente aún es poco conocido y tiene que ser estudiada posteriormente.

En este estudio, mostramos primera funciones que miR-200b como un supresor de tumores tanto
in vitro y en Hoteles en
in vivo Hoteles en células madre cancerosas que se originan a partir de células LAD docetaxel resistente humanos. Además, identificamos HDAC1 como regulador específico implicado en el silenciamiento de miR-200b a través de un mecanismo de Sp1-dependiente, y la restauración de miR-200b mediada por la represión HDAC1 suprime significativamente el mantenimiento de células madre cancerosas y revierte la quimio-resistencia de células madre cancerosas mediante la regulación de Suz-12-E -cadherin de señalización. A lo mejor de nuestro conocimiento, no ha habido informes sobre red de regulación HDAC1 /miR-200b /Suz-12 /E-cadherina en la regulación de células madre cancerosas mantenimiento y quimio-resistencia en las células LAD humanos y el trabajo actual proporcionará una nueva estrategia para revertir la quimio-resistencia de LAD humana

Materiales y Métodos

ética declaración

Este estudio fue aprobado por el comité ético de investigación del hospital de la Universidad de Nanjing Jinling (Número de Permiso: 12-027). y se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki. Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con el Hospital Jinling de la Universidad de Nanjing Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

microperlas Ordenando
En pocas palabras, 3,0 × 10
7 células individuales eran pasado a través de malla de nylon 30 micras y se centrifugó a 300 xg durante 10 minutos. a continuación, se aspiró el sobrenadante. Después, se añadieron 300 l de tampón y 100 reactivo FcR l y se mezcló. se añadieron 100 l microperlas CD326, se mezcló bien y se incubó durante 30 minutos en el refrigerador (2-8 ° C). Las células fueron lavadas mediante la adición de 2 ml de tampón y se centrifuga a 300 xg durante 10 minutos. a continuación, se aspiró el sobrenadante. Las células se resuspendieron con 500 l de tampón. A continuación, la suspensión celular se aplicó sobre la columna del separador colocado en el campo magnético. Se recogió el flujo a través que contenía células no marcadas. A continuación, la columna se lavó y se retira del separador y se coloca en un tubo de recogida adecuado. Entonces, la cantidad apropiada de tampón se pipeteó en la columna y se recogió el flujo a través que contiene células CD326. Por fin, después se solucionó el número apropiado de CD326
+ células CD133 con microperlas para el enriquecimiento de CD133
+ /CD326
+ células como se ha descrito anteriormente. El CD133
+ /CD326
+ CSC fueron cultivadas en un medio de CSC-cultivo libre de suero: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) /medio F12 que contiene 0,4% de BSA, 2% B27, 4 mg /ml de insulina y 40 ng /ml de EGF.

células y condiciones de cultivo

el LAD humana líneas celulares (SPC-A1 y H1299) fueron adquiridos de la célula tumoral Banco de la Academia china de Ciencias Médicas (Shanghai, China). Se prepararon las células LAD docetaxel resistente como se describe en nuestro trabajo anterior y conservados en 50.0μg /L docetaxel [19]. Las células se cultivaron como se describe en nuestro trabajo previo [20]. El CD133
+ /CD326
+ células fueron separadas de las células LAD docetaxel resistente de CD133 y CD326 microbolas (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante.

Las muestras de pacientes

el presente trabajo fue aprobado por el Comité de ética de nuestro hospital y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes. LAD tejidos fueron obtenidos de pacientes con LAD en etapa avanzada en nuestro hospital desde septiembre de 2006 a diciembre de 2008. Los pacientes cumplieron todos los criterios siguientes: diagnóstico histológico de LAD primaria con al menos una lesión medible; el estadio IIIB-IV clínica; quimioterapia de primera línea, ya sea con docetaxel 75 mg /m
2 y cisplatino 100 mg /m
2 o docetaxel 75 mg /m
2 y el área carboplatino bajo la curva de 6 mg /ml /min administrado cada 3 semana durante un máximo de 5 ciclos. Las muestras de tejido fueron divididos en (respuesta completa o parcial) "sensible" y "insensible" (enfermedad estable o progresiva) grupos que basan en las respuestas del paciente evaluada mediante análisis de imágenes médicas y detección de marcadores tumorales séricos después de 4 o 5 ciclos de docetaxel- quimioterapia basada.

plásmidos y transfección de células

los estudios recientes han informado de que el miR-200b tiene dos promotores funcionales, que se encuentra ~ 4 kb y ~ 2 kb aguas arriba del extremo 5 'de horquilla, respectivamente [ ,,,0],21]. Entonces, las dos regiones centrales, ubicadas chr1: 1.087.797 a 1.088.137 (341 pb) y chr1: 1.089.316 a 1.090.354 (1039 pb), respectivamente (UCSC Genome Browser, marzo de 2006) se amplificaron por PCR y se clonaron en el vector pGL3-basic (Promega ) con KpnI y HindIII sitios, con nombre (pGL3 promotor)-1 y el promotor-2. Además, se observaron múltiples sitios de unión Sp1 en las dos regiones centrales. Y, los sitios SP1 de unión situados chr1: 1087926 hasta 1087932, chr1: 1088073-1088079 y chr1: 1089779 a 1089785, respectivamente. Entonces, vectores informadores mutantes dirigida Sp1 vinculante de sitio se construyeron por mutación PCR. reportero de luciferasa de tipo silvestre que contiene 3'-UTR de Suz-12 (pLUC /Suz-12 /3'-UTR-en peso) en la que los nucleótidos de la Suz-12-3'-UTR complementarias para miR-200b se insertan en el pLUC vector, y también generan un reportero mutante (pLUC /Suz-12 /3'-UTR-mut), en la que se mutaron los primeros seis nucleótidos en la región de la semilla sitios complementarios de miR-200b. Todas las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1. plásmido de expresión de miR-200b (pcDNA /miR-200b), la maqueta de control pcDNA-negativo (pcDNA /miR-NC), el miR-200b inhibidor (anti-miR-200b) y el control de los genes miARN no específica (anti-miR-NC) eran utilizado como nuestra anterior se describe [18]. HDAC1-shRNA (o control-shRNA), Sp1-shRNA (o control-shRNA) se obtuvieron de vectores GenePharma. Suz-12 plásmido de expresión (pcDNA /Suz-12) se construyó por subclonación Suz-12 en el vector pcDNA 3.0 (Invitrogen) mediante PCR con los cebadores listados en la Tabla S2. Todos los vectores se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las células fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

Flujo de análisis de citometría de CD133
+ /CD326
+ células

Flujo de análisis de citometría de CD133
+ /CD326
+ células se realizó con anticuerpos CD326-FITC CD133-PE y (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. En resumen, aproximadamente 1,0 × 10
6 células se centrifugaron a 300 xg durante 10 minutos. a continuación, se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron con 80 l de tampón. 20 l de FcR bloqueo de reactivo se añaden a continuación en la memoria intermedia. se añadieron 10 l de anticuerpo CD133 /CD326, se mezcló bien y se incubó durante 10 minutos en la oscuridad en el refrigerador (2-8 ° C). A continuación, las células se lavaron mediante la adición de 1 a 2 ml de tampón y se centrifuga a 300 xg durante 10 minutos. a continuación, se aspiró el sobrenadante. Por fin, las células se volvieron a suspender en 400μL de tampón para su análisis por citometría de flujo.

mammosphere ensayo de formación de

ensayo de formación de mammosphere se realizó para evaluar la capacidad de auto-renovación CSC. ensayo de formación de mammosphere se llevó a cabo en placas de una sola célula suspensiones (1000 células /pocillo) en placas adherentes ultra-bajas de 6 pocillos. Entonces, las células se cultivaron en medio CSC-cultivo libre de suero y suplementado con el medio cada 3 días. Después de 7 días de incubación, se analizaron las placas para la medición de los números mammosphere.

Western Blot ensayo

Los anticuerpos primarios contra la E-cadherina, Sox-2 y Octubre-4 (Abcam, Hong Kong ), el IMC-1, HDAC1, Suz-12 (Tecnologías de Señalización celular) y GAPDH (Santa Cruz de Biotecnología) se utilizaron en este estudio. GAPDH se utilizó como control interno. lisado de proteína total fue separado por 10% de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Las proteínas se transfirieron a continuación en fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore). A continuación, se realizó la inmunotransferencia y se visualizó con un kit de quimioluminiscencia (Thermo Scientific).

reacción cuantitativa con transcripción inversa en cadena de la polimerasa en tiempo real (QRT-PCR)

El ARN total se extrajo con TRIzol reactivo (Takara). La transcripción inversa se realizó con PrimeScript RT kit de reactivos (Takara) basándose en las instrucciones del fabricante. QRT-PCR se realizó con SYBR PrimeScript RT-PCR Kits (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de miR-200b o ARNm se calcularon con el 2
- △△ método Ct usando U6 rRNA o mRNA GAPDH como los genes de referencia. Los niveles de expresión se midieron en relación con el pliegue del cambio de las células de control que se definió como 1.0. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Todos los pares de cebadores fueron listadas en la Tabla S3.

sensibilidad a los fármacos y ensayo de viabilidad celular

sensibilidad a los fármacos y ensayo de viabilidad celular se midió con el ensayo Kit-8 Recuento celular (CCK-8) ( Dojindo) según las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de sensibilidad al fármaco, 3 × 10
3 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos 24 horas después de la transfección. Después de la unión, se añadió después docetaxel recién preparada en diferente concentración final. 48 horas más tarde, se añadieron 10 l de CCK-8 y se incubó durante 4 horas a 37 ° C. entonces absorbancia se midió a 450 nm. Para el ensayo de viabilidad celular, 2,0 × 10
3 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos 24 horas después de la transfección con los vectores indicados. 12, 24 o 48 horas más tarde, se añadieron 10 l de CCK-8 y se incubó durante 4 horas a 37 ° C. entonces absorbancia se midió a 450 nm. Todo el experimento se realizó por triplicado y se repitió al menos tres veces.

reportero de luciferasa ensayo

Aproximadamente 2,0 × 10
3 /pocillo células madre cancerosas fueron sembradas en placas de 96 pocillos y luego se cotransfectaron con los plásmidos informadores de luciferasa específicos, miR-NC o miR-200b. Renila-TK plásmido (Promega) se cotransfectaron en todas las muestras. 48 horas después de la transfección, las actividades de luciferasa se midieron con kits Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). Las actividades de luciferasa se normalizaron por las actividades de luciferasa de Renilla. Los datos fueron en relación con el pliegue del cambio de los correspondientes grupos de control que se definió como 1.0. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Co-inmunoprecipitación ensayo

El ensayo de co-inmunoprecipitación se realizó usando kits de Co-inmunoprecipitación (Thermo Pierce científica) basándose con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 75μg de anticuerpos purificados por afinidad (Sp1, HDAC1, Cell Signaling Technologies) se acoplaron a las columnas de centrifugación. A continuación se preparó lisado celular y pre-aclaró con las resinas de control de agarosa. Posteriormente, el lisado celular se co-inmunoprecipitó y se eluyó. Finalmente, las muestras se midieron mediante el ensayo de Western Blot.

inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayo

chip de ensayo se realizó con Immunoprecipitation ensayo Kits (Millipore) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron reticuladas con formaldehído al 1% durante 10 minutos a 37 ° C. Las células se resuspendieron en 200 l de tampón de lisis y se incubaron durante 10 minutos en hielo. El lisado se cortó a longitudes entre 200 y 1000 pares de bases por tratamiento con ultrasonidos. El sobrenadante se aclaró previamente con un ADN de esperma de salmón /proteína A agarosa-50% de lechada. El sobrenadante recuperado se incubó con Suz-12 anticuerpo inmunoprecipitación (Abcam), Histona H3 trimetil-lisina 27 (H3-trimetil-K27) de anticuerpos inmunoprecipitación (Millipore), acetil-histona H3 (Lys9) (Millipore), o un isotipo de control IgG durante la noche a 4 ° C con rotación. A continuación, se recogió el complejo de anticuerpo /ADN usando ADN de esperma de salmón /proteína A de agarosa de lechada durante una hora a 4 ° C con rotación. El complejo se eluyó mediante tampón de elución. A continuación, los enlaces cruzados se invirtieron con calefacción 5 M de NaCl a 65 ° C durante 4 horas. Las muestras de ADN fueron entonces purificados y medidos mediante qRT-PCR. Los cebadores se enumeran en la Tabla S4.

xenoinjerto trasplante

BALB /c atímicos ratones desnudos (Hombre, SPF, 4-6 semanas) fueron proporcionados por el departamento de centro de animales experimento de nuestro hospital . Y el estudio in vivo fue aprobado de forma ética y lleva a cabo de acuerdo con las directrices institucionales. Para llevar a cabo la tumorigenicidad en ratones desnudos, los CAC a partir de células /DTX SPC-A1 transfectadas de forma estable con miR-200b, miR-NC, de control de sh o 2 vectores SH-HDAC1#se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. Los tumores fueron cosechadas mientras que eran palpables. Para investigar el efecto de miR-200b HDAC1 expresión o represión de
in vivo
regulación de las células LAD, 3,0 × 10
6 H1299 /DTX células transfectadas de forma estable con el control sh-sh-HDAC1, miR NC o vectores de miR-200b, se trasplantaron por vía subcutánea en el lado derecho del flanco posterior de ratones desnudos. Los volúmenes tumorales se midieron como se describe anterior [19]. Mientras que la dimensión promedio del tumor alcanzó alrededor de 50 mm
3, una concentración de 1,0 mg /kg de docetaxel (DTX), una dosis cada dos días, con tres dosis en total, se administró a través de inyección intraperitoneal [19]. Después de 5 semanas, todos los ratones fueron sacrificados y los tejidos tumorales fueron utilizados para los estudios posteriores.

El análisis estadístico

Todo el análisis estadístico se llevó a cabo el programa SPSS versión 17.0 del programa (SPSS Inc., Chicago, IL , ESTADOS UNIDOS). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media, y las barras de error son representativos de al menos tres experimentos independientes. Los valores medios de los dos grupos fueron comparados por
t de Student
. Las diferencias entre los varios grupos se analizaron mediante análisis unidireccional ANOVA. Todos los
P
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas propiedades

Resultados

CD133
+ /CD326
+ células de exhibición de los CAC
. células p> para entender mejor los mecanismos subyacentes responsables de la quimio-resistencia en KOP, CD133
+ /CD326
+ fueron ordenados de las células LAD docetaxel resistente de CD133 y CD326 microbolas. células de la pureza de CD133
+ /CD326
+ ordenados desde SPC-A1 /DTX y H1299 /DTX fue del 93,13% ± 4,06% y 92,74% ± 3,12%, respectivamente, y el CD133
+ /CD326
+ células podían diferenciar a las células LAD docetaxel resistente, mientras que bajo condiciones de diferenciación (Figura 1A
1, a
2 y a
3). A continuación, se determinó si el CD133
+ /CD326
+ células propiedades de las células madre cancerosas muestran. En primer lugar, se analizó la capacidad de formación de mammosphere del CD133
+ /CD326
+ células, y los datos mostró que el número de mammosphere en CD133
+ /CD326
+ células fue significativamente más que eso en las células LAD docetaxel resistente correspondientes (Figura 1B). Además, el CD133
+ /CD326
+ células expresan mayores niveles de expresión de marcadores de células madre (tales como Sox-2, Oct-4, Suz-12, y Bmi-1) que el correspondiente LAD docetaxel resistente las células (Figura 1C, 1D
1 y D
2). En segundo lugar, analizamos la capacidad tumorigénico del CD133
+ /CD326
+ células, y luego sobre 1,000~100,000 CD133
+ /CD326
+ células o de las células LAD docetaxel resistentes fueron por vía subcutánea inoculado en ratones desnudos. 1.000 CD133
+ /CD326
+ células fueron suficientes para formar tumores en todos los ratones desnudos, sin embargo, hasta el 1,0 × 10
5 células LAD docetaxel resistente podido formar con éxito tumores en cada desnuda los ratones, lo que indica que el CD133
+ /CD326
+ células poseían una mayor capacidad de tumorigenicidad de las células LAD docetaxel resistente parentales (Figura 1E). Por lo tanto, el CD133
+ /CD326
+ subpoblación de células muestran propiedades de células madre cancerosas.

(A
1, A
2, A
3) Porcentaje de CD133
+ /CD326
+ células madre cancerosas analizados por citometría de flujo en el tiempo indicado después de cultivarse CD133
+ /CD326
+ células madre cancerosas (adquirida por la clasificación SPC-A1 /DTX y las células H1299 /DTX, respectivamente) en condiciones de diferenciación. (B) mammosphere formación de capacidad de las células indicadas (1000 células) después de 7 días en condiciones de cultivo de CSC. detección (C) QRT-PCR de los niveles de ARNm relativas de los marcadores relacionados con el CSC en las células indicadas. Los datos se calculó con la 2
- método △△ Ct usando GAPDH RNA como el gen de referencia. El nivel de expresión se mide en relación con el pliegue del cambio de los grupos de células parentales que se han definido como 1,0. (D
1, D
2) Los niveles de proteína de los marcadores relacionados con el CSC en las celdas indicadas. GAPDH se utilizó como control interno. (E) la incidencia de tumores en ratones desnudos que fueron subcutáneamente inyectado con las células indicadas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p
. & Lt; 0,01

miR-200b inhibe la formación de células madre cancerosas y revierte la quimio-resistencia de los CAC

Anteriormente, hemos demostrado que la regulación positiva de miR-200b puede revertir quimiorresistencia de las células LAD docetaxel resistente al inhibir el crecimiento celular, la inducción de la detención del ciclo celular y la mejora de la apoptosis. A continuación, se realizó un ensayo de QRT-PCR para detectar la expresión de miR-200b en células madre cancerosas y las correspondientes células LAD docetaxel resistente, y puso de manifiesto que el nivel relativo de miR-200b en los CAC fue menor que en las células LAD docetaxel resistente (Figura 2A). Para investigar más a fondo si tiene efecto de miR-200b en células madre cancerosas en las células LAD docetaxel resistente, pcDNA /miR-200b (o pcDNA /miR-NC) o anti-miR-200b (o anti-miR-NC) era estable o transitoria transfectadas en SPC-A1 /DTX o H1299 /células DTX. Como se muestra en la Figura 2B, el nivel relativo de expresión de miR-200b se upregulated significativamente en las células LAD docetaxel resistente transfectadas de forma estable con pcDNA /miR-200b, mientras que su nivel relativo de expresión se downregulated significativamente en las células transfectadas transitoriamente con anti-miR 200b. La citometría de flujo ensayo mostró que la regulación al alza de miR-200b disminuyó significativamente el porcentaje de CD133
+ /CD326
+ crecimiento de células madre cancerosas en las células LAD docetaxel resistente y regulación a la baja de miR-200b tenido el efecto contrario (Figura 2C). El fenómeno similar se observó en el ensayo de capacidad de formación de mammosphere así (Figura 2D). Mientras tanto, la restauración de miR-200b podría conducir a la disminución de la IC
50 valor de DTX en los CAC desde SPC-A1 /DTX o células H1299 /DTX (Figura 2E). Estos resultados indicaron que el miR-200b podría desempeñar un papel fundamental en el crecimiento de células madre cancerosas y quimio-resistencia de LAD humana.

(A) Detección de QRT-PCR de miR-200b en células madre cancerosas. Los datos se normalizaron a U6 rRNA y determinaron con relación a los grupos celulares parentales correspondientes. (B) Detección de QRT-PCR de ARNm nivel relativo de miR-200b en las células LAD docetaxel resistente después de la transfección con los vectores indicados. Los datos se normalizaron a U6 rRNA y determinaron en relación con los grupos de control correspondientes. (C) Porcentaje de CD133
+ /CD326
+ células madre cancerosas analizados por citometría de flujo después de la transfección con los vectores indicados. (D) mammosphere formación de capacidad de las células indicadas (1000 células) después de la transfección de los vectores indicados. (E) La viabilidad celular se midió por recuento de la célula Kit-8 de ensayo (CCK-8). Los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p
. & Lt; 0,01

Suz-12 está regulada positivamente en células madre cancerosas y se identificó como un objetivo funcional de miR 200b

Suz-12 es un componente de la polycomb represivo complejo 2 (PRC2) y es esencial para el silenciamiento de genes PRC2 mediada por la generación de trimethylation en lisina 27 residuos de la histona H3 (H3K27me3). En los CAC generadas a partir de células epiteliales de mama transformadas (MCF-10A), Suz-12 ha sido confirmado como un gen diana de miR-200b. Sin embargo, si el miR-200b pueden dirigirse a Suz-12 en las células madre cancerosas derivadas de las células LAD docetaxel resistente no está claro. QRT-PCR y ensayos de transferencia de Western indicaron que Suz-12 fue hasta reguladas en células madre cancerosas en comparación con las correspondientes células LAD docetaxel resistente tanto a nivel de transcripción y traducción (Figura 3 A y B). A continuación, se analizaron los efectos de miR-200b en la expresión de Suz-12 en células madre cancerosas. La regulación positiva de miR-200b condujo a la disminución de expresión de Suz-12 en células madre cancerosas de SPC-A1 /DTX y las células H1299 /DTX, mientras que el silenciamiento de miR-200b dio lugar a la expresión aumentada de Suz-12 en esas células madre cancerosas (Figura 3C y RE). Para obtener más evidencia directa de que Suz-12 era un objetivo de miR-200b, se investigó el sitio de unión de miR-200b en la secuencia 3'-UTR de Suz-12 mRNA. Hemos construido un indicador de luciferasa (pLUC /Suz-12 /3'-UTR-en peso) en la que los nucleótidos de la Suz-12-3'-UTR complementarias para miR-200b se insertan en el vector pLUC, y también genera una reportero mutante (pLUC /Suz-12 /3'-UTR-mut), en la que se mutaron los primeros seis nucleótidos en la región de la semilla sitios complementarios miR-200b. La actividad de luciferasa en el pLUC /Suz-12 /3'-UTR--WT transfectadas las células co-transfectadas con pcDNA /miR-200b se redujo significativamente que la de las células-mut-transfectadas 3'-UTR pLUC /Suz-12 /co-transfectadas con pcDNA /miR-200b (Figura 3E). Estos resultados sugieren que Suz-12 podría ser un objetivo directo de miR-200b en las células madre cancerosas derivadas de las células LAD docetaxel resistente.

(A) Detección de QRT-PCR de la expresión de ARNm Suz-12 relativa en el células indicadas. Los datos se normalizaron a GAPDH ARN y determinaron con relación a los grupos de células de los padres correspondientes. (B) Los niveles de proteína de Suz-12, medida por transferencia de Western en las células indicadas. GAPDH se utilizó como control interno. (C) QRT-PCR detección de Suz-12 mRNA expresión en células madre cancerosas después de la transfección de los vectores indicados. (D) de detección de transferencia Western de Suz-12 expresión de proteínas en células madre cancerosas después de la transfección con los vectores indicados. GAPDH se utilizó como control interno. (E) La actividad de luciferasa de la células madre cancerosas (SPC-A1 /DTX) co-transfectadas con pcDNA /miR-200b (o pcDNA /miR-NC) o pLUC /Suz-12 /3'-UTR-peso (o pLUC /Suz -12 /3'-UTR-mut). Los datos fueron media ± SD de al menos tres experimentos independientes. *
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A fin de determinar si Suz-12 estuvo involucrado en la regulación de las células madre cancerosas, Suz- 12-shRNAs (Suz-12-shRNA#1,#2 y#3) se diseñaron y se transfectaron en células LAD docetaxel resistente y el efecto inhibidor de Suz-12-shRNA3 fue mayor (Figura 4A). El silenciamiento de Suz-12 podría reducir significativamente la capacidad de formación de mammosphere de SPC-A1 /DTX y las células H1299 /DTX (Figura 4B). Además, el porcentaje de CD133
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+ crecimiento de células madre cancerosas en transfectadas-Suz-12-shRNA3 SPC-A1 /DTX o células /DTX H1299 fue significativamente menor que el de las células transfectadas con el control shRNA ( Figura 4C). Entonces, que además analiza los efectos de la expresión Suz-12 sobre la tumorigenicidad y quimiosensibilidad de células madre cancerosas. En primer lugar, hemos detectado la expresión de la proteína de Suz-12 en células madre cancerosas de Suz-12-shRNA3 o control-shRNA transfectadas SPC-A1 /DTX y células /DTX H1299, y puso de manifiesto que el nivel de expresión de la proteína Suz-12 en Suz- 12 transfectadas con-shRNA3 células fue significativamente más bajo que en las células transfectadas-shRNA de control (Figura 4D). El análisis funcional indica que el silenciamiento de Suz-12 podría inhibir significativamente
in vitro
crecimiento y
in vivo
tumorigenicidad de las células madre cancerosas (Figura 4E y F). Por otra parte, el silenciamiento de Suz-12 podría disminuir significativamente el IC
50 valor de DTX en la células madre cancerosas (Figura 4G). Por lo tanto, el silenciamiento de Suz-12 podría imitar los efectos de miR-200b en el crecimiento de células madre cancerosas y quimio-resistencia, lo que sugiere que Suz-12 se dedica a la regulación de las células madre cancerosas inducidas por el miR-200b.

(A) La proteína nivel de Suz-12 en las células LAD docetaxel resistente después de la transfección con los vectores sh-ARN indicados (sh-ARN-SUZ12#1, sh-ARN-SUZ12#2, y sh-ARN-SUZ12#3). (B) mammosphere formación de capacidad de las células LAD docetaxel resistente (1000 células) después de la transfección de los vectores indicados. (C) La citometría de flujo análisis de porcentaje de CD133
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+ células madre cancerosas analizados por LAD en las células resistentes a docetaxel después de la transfección de los vectores indicados. (D) El nivel de proteína Suz-12 en células madre cancerosas después de la transfección con el ARN de control de sh o sh-ARN-SUZ12#3 vectores. (E) CCK-8 análisis de la viabilidad celular de las células madre cancerosas transfectadas con los vectores indicados en el momento indicado. (F) Efecto de Suz-12 inhibición de
in vivo
tumorigenicidad de las células madre cancerosas de las células /DTX SPC-A1. (G) Efecto de la inhibición Suz-12 en la quimio-resistencia de los CAC. La viabilidad celular se midió por CCK-8 ensayo. GAPDH se utilizó como control interno. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. *
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Para confirmar aún más que Suz-12 era un objetivo funcional de miR-200b en la regulación de las células madre cancerosas, pcDNA /Suz-12 o pcDNA /de control se transfectó en células madre cancerosas (SPC-A1 /DTX) establemente transfectadas con pcDNA /miR-200b o pcDNA /miR-NC. 48 horas después de la transfección, ensayo botting Western se realizó para detectar la expresión de la proteína Suz-12, y mostró que pcDNA /Suz-12 podría invertir la disminución de expresión de Suz-12 en células madre cancerosas de las células /DTX SPC-A1 inducidos por MIR upregulation -200b (Figura 5A). Mientras tanto, la sobreexpresión de Suz-12 no sólo podría revertir la disminución en el porcentaje de CD133
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+ crecimiento de células madre cancerosas y mammosphere capacidad de formación, sino también revertir la capacidad de crecimiento disminuido y IC
50 valor de docetaxel en las células madre cancerosas de las células /DTX SPC-A1 inducidos por miR-200b regulación hacia arriba (Figura 5B-E). De este modo, la sobreexpresión de Suz-12 podría revertir los efectos de la regulación positiva de miR-200b en la regulación de las células madre cancerosas, lo que sugiere que Suz-12 era un objetivo funcional de miR-200b en la regulación de células madre cancerosas de las células LAD docetaxel resistente.

(a) El nivel de proteína Suz-12 en células madre cancerosas de las células /DTX SPC-A1 transfectadas con los vectores indicados. GAPDH se utilizó como control interno. (B) La citometría de flujo análisis de porcentaje de CD133
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+ células madre cancerosas en células /DTX SPC-A1 después de la transfección de los vectores indicados. (C) mammosphere formación de capacidad de las células /DTX SPC-A1 (1000 células) después de la transfección de los vectores indicados. *
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