Extracto
Los cánceres de vejiga comúnmente muestran aberraciones genéticas en la vía de señalización de la fosfatidilinositol 3-quinasa. Aquí hemos proyectado para las mutaciones en
PIK3R1
, que codifica p85, una de las subunidades reguladoras de PI3K. Doscientos sesenta y cuatro tumores de vejiga y 41 líneas de células tumorales de vejiga fueron evaluados y se detectaron 18 mutaciones. Trece mutaciones estaban en dominios C-terminal y se prevé que interfieren con la interacción entre p85 y p110α. Cinco mutaciones estaban en el dominio de BH PIK3R1. Esta región ha sido implicada en funciones p110α-independiente de p85, tales como la unión a y la modificación de las actividades de PTEN, Rab4 y Rab5. La expresión de estas formas BH-p85 mutante en ratones knockout fibroblastos embrionarios con p85 indicó que todas las formas, con excepción de los mutantes de truncamiento, podrían unirse y estabilizar p110α pero no aumentó la fosforilación de AKT, lo que sugiere que las mutaciones BH funcionan independientemente p110α. En un panel de líneas celulares tumorales de vejiga 44, 80% había reducido la expresión mRNA PIK3R1 relación con las células uroteliales normales. Esto, junto con la mutación de
PIK3R1
, puede alterar el funcionamiento BH dominio. Nuestros resultados sugieren que las formas mutantes de p85 pueden desempeñar un papel oncogénico en el cáncer de vejiga, no sólo a través de la pérdida de la capacidad de regular p110α pero también a través de la función alterada del dominio BH.
Visto: Ross RL, Burns JE, Taylor CF, Mellor P, Anderson DH, Knowles MA (2013) La identificación de mutaciones en regiones distintas de p85 alfa en cáncer urotelial. PLoS ONE 8 (12): e84411. doi: 10.1371 /journal.pone.0084411
Editor: Karl X Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de septiembre de 2013; Aceptado: 18 Noviembre 2013; Publicado: 18 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Ross et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero Yorkshire proporcionada por el Cancer Research (http://yorkshirecancerresearch.org.uk/) (L362) y la Universidad de Leeds MRC beca (MK, RR), Institutos canadienses de Investigación en Salud (http: //www.cihr-irsc.gc. Fundación ca /e /193.html) (MOP84277) (DA), y Saskatchewan Health Research Fellowship (http://shrf.ca/)(PM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) vía de señalización juega un papel crítico en la regulación del crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia [1] y las mutaciones que conducen a la activación aberrante de la vía se encuentran en prácticamente todos los tipos de cáncer. En el carcinoma urotelial (UC) de la vejiga, se han identificado varias alteraciones genómicas que conducen a la desregulación de la vía. Estos incluyen la inactivación de las mutaciones en
PTEN
y
TSC1 Opiniones y mutaciones activadoras en
PIK3CA
y
AKT1
[2,3,4,5,6, 7,8]. Anteriormente se demostró que varios de estos eventos son no redundante, lo que sugiere que la mutación de más de un miembro de vía puede tener efectos aditivos o sinérgicos [4]. Estas alteraciones se encuentran tanto en la Universidad de California de bajo grado, no invasiva y músculo-invasivo, lo que indica que esta vía tiene un papel crítico en el desarrollo de la UC y sugiriendo que representa una importante diana terapéutica en estos tipos de cáncer.
PI3 quinasas fosforilan la posición 3` en el anillo de inositol de phosphinositol-4,5-bifosfato (PIP2) para generar el segundo mensajero lipídico phosphinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) que activa AKT señalización corriente abajo. La clase IA PI3Kαis un heterodímero obligado consistentes en la subunidad p110αcatalytic (p110α), codificadas por el
PIK3CA
gen, y una subunidad reguladora, codificada por uno de los 3 genes,
PIK3R1, PIK3R2 Opiniones y
pik3r3
. Las subunidades reguladoras son esenciales para la estabilidad de p110α y en el estado de reposo suprimir su actividad catalítica [9]. Cada uno tiene dos dominios SH2 que se puede unir activados receptores de factores de crecimiento unidos a la membrana o moléculas adaptadoras, alterando su conformación, aliviando la inhibición de la p110α y permitiendo p110α a fosforilan PIP2 [10].
Las mutaciones de
, que codifica p85, se han reportado en algunos tipos de cáncer. En un linfoma de ratón inducida por irradiación con rayos X, una forma truncada (p65) que contiene sólo aminoácidos 1-571 se identificó y se demostró que confieren un aumento en
in vitro
la actividad quinasa en el p110α [11]. Esta forma truncada de p85 más tarde se demostró que carecen de la región crítica entre SH2 (iSH2) requerida para la inhibición de la actividad p110α [12]. Una forma truncada similar se informó en la línea de un Hodgkin de células de linfoma humano [13] y 4 deleciones pequeñas, dentro de los exones 14 o 15 que codifican la región iSH2, en los cánceres de ovario y de colon [14]. Dos mutaciones de empalme también fueron identificados, los cuales dieron lugar a la omisión del exón 15. La expresión de una de estas formas mutantes con una deleción del exón 13 dieron como resultado la activación constitutiva de la ruta de PI3K en las células, proporcionando evidencia de que p85 mutante puede actuar como una oncogén en el cáncer humano. Una deleción de 9 pb que abarca la unión exón-intrón del exón 12 [15] y 9 otras mutaciones, de las cuales 8 fueron en la región iSH2 fueron identificados en los glioblastomas [16] y 15 se encontraron mutaciones en el cáncer de colon, la mayoría de los cuales eran demostrado reducir su actividad p110α inhibidora mientras que conserva la capacidad para estabilizar el complejo [17]. Una sola
PIK3R1
mutación se informó recientemente en un estudio de la Universidad de California que proyectará los exones 12, 14 y 15, (& lt; 1% de frecuencia) [18]. En contraste con estas bajas frecuencias de mutación, recientemente se ha informado de que 20 - 40% de los cánceres endometriales endometrioid contiene
PIK3R1
mutaciones, la mayoría de los dominios nSH2 y iSH2 [19,20].
Nuestro hallazgo previo de mutaciones en varios componentes de la vía PI3K en la Universidad de California, y el hallazgo de
PIK3R1
mutaciones en otros tipos de cáncer, nos llevó a buscar mutaciones en
. Como ha surgido evidencia de que los que los dominios N-terminal de p85 tienen funciones oncogénicas, elegimos para detectar la secuencia de codificación de
PIK3R1
, en lugar de centrarse en los exones 12, 14 y 15. Aquí mostramos una serie de mutaciones en líneas derivadas-UC celulares y los tumores de la UC primarios, incluyendo deleciones en la región iSH2 y una serie de mutaciones de sentido erróneo, (BH) de dominio de varios en la homología breakpoint cluster region, que tiene actividad GTPasa hacia Rab5 [21] y se puede unir PTEN [22,23]. Nuestros resultados sugieren que las formas mutantes de p85 pueden desempeñar un papel oncogénico en el cáncer de vejiga, no sólo a través de la pérdida de la capacidad de regular p110α pero también a través de la función alterada del dominio BH.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Leeds East (99/156) y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes.
Las muestras de los pacientes y de aislamiento de ADN
biopsias con pinza fría de 264 carcinomas uroteliales (CU) se recogieron, se congelaron y se almacenaron en nitrógeno líquido. El resto de los tejidos se embebió en parafina para la evaluación de diagnóstico. El panel del tumor consistió en 10 pTaG1, 42 pTaG2, 24 pTaG3, 7 pT1G1, 27 pT1G2, 57 pT1G3, 2 pT2G1, 13 pT2G2, 54 & gt; pT2G3, 5 G1, 8 G2 y 4 tumores G3 sin estroma subyacente (PTX) y 11 tumores que no tienen información [24,25]. Todos eran carcinoma de células transicionales. Se extrajo ADN de las secciones congeladas y muestras de sangre venosa como se describe anteriormente [4].
líneas de células uroteliales
Cuarenta y cuatro líneas celulares de la UC (253J, 5637, 639V, 647V, 92-1 , 94-10, 96-1, 97-1, 97-18, 97-24, 97-7, aC-3C, BFTC905, BFTC909, CAL29, DSH1, HT1197, HT1376, J82, JMSU1, JO'N, KU -19-19, LUCC1, LUCC2, LUCC3, LUCC4, LUCC5, LUCC6, LUCC7, LUCC8, MGH-U3, RT112, RT4, SCaBER, SD, SW780, SW1710, T24, TCCsup, T-bLC1, UM-UC3, VM -CUB-1, VM-CUB-2 y se investigaron VM-CUB-3) (Tabla S1). Se establecieron líneas LUCC1-LUCC8 en el laboratorio de los autores de los tejidos tumorales de vejiga obtenidas con el consentimiento informado por escrito. identidad de la línea celular fue verificado por la repetición en tándem corto tipificación de ADN utilizando Powerplex 16 kit (Promega). Los perfiles se compararon con los datos disponibles (ATCC, DSMZ), o cuando no se disponía de perfil de referencia, se confirmaron públicamente como único. Se extrajo el ADN como se describe anteriormente [4].
Mutación análisis
toda la secuencia codificante de
PIK3R1
se examinó en 18 fragmentos por análisis de fusión de alta resolución como se describe [26 , 27]. Se analizó el ADN de muestras de sangre emparejados para confirmar el estado de mutación somática. Las secuencias de cebadores se dan en la Tabla S2. Las mutaciones se registran con referencia a NM_181523.
Alelo específico PCR (AS-PCR) se llevó a cabo para establecer la fase de los pares de las mutaciones en la línea celular LUCC3 y en la muestra de tumor 2 (Tabla 1). Un cebador directo fue diseñado para amplificar específicamente el alelo mutante en el sitio de la mutación y 5` fue emparejado con un cebador inverso colocado para incluir la segunda mutación en el producto de PCR (Tabla S3). Los productos se ejecutan en un gel de agarosa para identificar la amplificación exitosa de sólo el ADN línea de tumor /célula y no la amplificación de la sangre y ADN WT. productos de PCR se secuencia verificada
Muestra del tour /fase
Exon
de nucleótidos pronosticada cambiar
cambio de aminoácido
1TaG32
1c..409G & gt;. AE137K2TxG35c.652GT E218 * 6c.862ACK288Qintron 12c.1426-49 G & gt; Aunknown3T4G35c.710_727del18W237-Y242del4T1G35c.785GCR262T5TaG310
2c.1072CT R358 * 14c.1735_1740del6Q579-Y580del6T1G3 11c.1131TGN377K7TaG312c.1322ATN441I8T1G113c.1441ATR481W
3LUCC3 T2G313 c.1519GC E507Q 14c.1670GCR557P9T2G313c.1552GCE518Q10T1G314c.1585GAD529N11TaG214c.1696_1734del39I566-D578del12T1G216c.1934CTT645I13TaG2Exon 17 de empalme acceptorc.1986-1 G & gt; Cunknown Tabla 1. Las mutaciones en PIK3R1 identificados en los tumores de vejiga y líneas celulares
1cDNA secuencia de referencia:. NM_181523;
2 mutación en solamente una población minoritaria de secuencias;
3CELL línea. Descargar CSV CSV
Los vectores de expresión y la transducción de líneas celulares
La clonación de insertos que codifican los de larga duración de tipo salvaje (WT) p85 humana y bovina p85 mutante R274A en pGEX-6P (GE Healthcare Life Sciences) se ha descrito [21]. Mutantes E137K, R162 *, E-218 *, Δ237_242, R262T, K288Q fueron creados por mutagénesis dirigida al sitio usando el método QuikChange (Stratagene, CA, EE.UU.) y se clonó en pFB Hyg [28] en el marco con una etiqueta HA N-terminal utilizando el método de infusión (Clontech, CA, EE.UU.)
.
control de ADNc, N564D y p85Δ, fueron amablemente proporcionados por Genentech [17] y se subclonó en pFB Hyg por el mismo método. Todos los plásmidos fueron secuencia verificada. Las construcciones se transfectaron en células Phoenix A USO DEL TRANSPORTE 293 (Mirus, Madison, EE.UU.). Ratón fibroblastos embrionarios (MEFs) con extracción de p85, β, δ (una especie de regalo de Lewis Cantley, Escuela de Medicina de Harvard), NIH3T3 fibroblastos de ratón y fibroblastos de rata Rat1, se incubaron con sobrenadante retroviral que contiene 8 mg /ml de polibreno y se seleccionaron con 500 , 200 y 250 mg /ml de higromicina, respectivamente.
caracterización funcional de mutantes de dominio BH
Las células fueron lisadas y las proteínas extraídas con CelLytic Mammalian Cell reactivo de lisis (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuantificada como se describe anteriormente [29]. Anti-HA inmunoprecipitación Kit (Sigma-Aldrich) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para experimentos de co-inmunoprecipitación. proteínas inmunotransferencia se incubaron con anticuerpos primarios; anti-p85 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-p110α, anti-pAKT (Ser473), anti-panAKT (Cell Signaling Technology, Boston, Reino Unido) y alfa anti-tubulina (ABD Serotec, Kidlington, Oxford, Reino Unido). anticuerpos primarios unidos se detectaron usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP y Iluminada Forte occidental HRP Sustrato (Millipore, Watford, Reino Unido). Independiente de anclaje de crecimiento se llevó a cabo como se describe anteriormente [29] y las colonias con un diámetro ≥ 50 micras se contaron dentro de 2,5 mm
2.
Análisis de PIK3R1 ARNm y la expresión de proteínas en UC
PIK3R1 de mRNA expresión de datos de 105 muestras de tumores de vejiga y 52 muestras normales de la vejiga reportados por Sánchez-Carbayo et al [30] se accedió. PIK3R1 expresión de la proteína se evaluó en 44 líneas celulares de la UC y se agruparon las células uroteliales normales humanos (NHU-pool) por el Western Blot y normalizado a la tubulina.
Resultados
Identificación de somática
PIK3R1
mutaciones
Hemos examinado toda la secuencia de codificación de
PIK3R1 Opiniones de mutaciones en los tejidos tumorales 264 UC y 41 líneas de células de la UC. Las tres isoformas conocidas de PIK3R1, p55α p85 y p50α contienen diferentes exones. Los exones 1-6 son exclusivos de p85, exón 7 está presente sólo en p50α y el exón 8 sólo en p55α. Los exones 9-17 están presentes en todas las isoformas pero el uso de un sitio de empalme críptico en el exón 16 resultados en la generación de ADNc que difieren en longitud por 8 codones [31], los cuales fueron cubiertos por esta pantalla. Dieciocho mutaciones se identificaron en 13 tumores. Un tumor (tumor 2) contenía tres y uno (tumor 5) contenía dos mutaciones (Tabla 1). Todos fueron confirmados como mutaciones somáticas por su presencia en el ADN derivado del tumor pero no la sangre del paciente. Una línea celular derivada de tumor (LUCC3) contenía dos mutaciones y estos también se confirmó que somática en origen. Todas las mutaciones fueron confirmados por PCR amplificaciones de repetición para descartar artefactos de PCR. La naturaleza y distribución de las mutaciones se muestran en relación a la estructura de proteínas p85 en la Figura 1. Cinco fueron localizados en el dominio BH (Figura S1). Ninguno estaba en los exones que son únicos para p50α o p55α, aunque varios estaban situados en los exones 2, 5 y 6, que son exclusivos de p85. No se identificaron mutaciones en la región del exón 16 que se empalma alternativamente.
El alelo-específica de PCR (AS-PCR) se utiliza para determinar si las 2 mutaciones en la línea celular LUCC3 (c.1519GC y c.1670GC; E507Q y R557P) y las 2 mutaciones en exonic 2 tumoral (c.652GT y c.862AC; E218 * y K288Q) estaban presentes en
cis
o en
trans
. En LUCC3, un cebador específico para la mutación c.1519C amplificó con éxito un producto de PCR del exón 13 hasta 14 (Figura S2A). La secuenciación de este producto confirmó la presencia de c.1670C mutación, lo que indica que ambas mutaciones de dominio iSH2 están en el mismo alelo. AS-PCR análisis de tumor 2 también confirmó que los 2 mutaciones exónicas (dominio E218 BH * y mutaciones K288Q) estaban presentes en el mismo alelo (Figura S2B).
En tumor 5, los perfiles de secuencia indicó que una de las mutaciones (R358 *) estuvo presente, ya que sólo una población menor de moléculas, mientras que el otro (Q579_Y580del) apareció heterocigotos. La genómica distancia entre los exones 10 y 14 de desarrollo excluida de un ensayo de PCR alelo-específico para determinar si estas mutaciones estaban en el mismo alelo. La pequeña señal del R358 * mutación puede indicar que estaba presente sólo como un evento menor sub-clonal. Este parece ser el caso, como el análisis de tejido de una recurrencia de la enfermedad posterior en este paciente mostró que sólo Q579_Y580del.
prevista efecto de las mutaciones en la proteína de función
Las posiciones de los residuos de sentido erróneo mutado que están representadas en la estructura cristalina disponibles se muestran en la Figura 2. Dos mutaciones, R358 * y N377K, fueron identificados en el dominio nSH2. Hallazgos recientes sugieren que esta región de actos p85 como un andamio para la p110α - complejo p85, con interacciones con C2, los dominios helicoidales y de la quinasa de p110α y con p85 iSH2 [32]. R358 * trunca la proteína en el sitio de unión de fosfopéptidos nSH2 (FLVRDAS). Esta misma mutación se informó recientemente en 5 muestras de cáncer de endometrio en el que representaba el 5% de todas las mutaciones identificadas [20]. La arginina 358 se ha identificado como la formación de un puente de sal con E542 en p110α [32] y la mutación R358A fue mostrado por ingeniería para abolir la unión fosfopéptido [9]. Por lo tanto, es probable que resulte en la interrupción de la unión de fosfopéptidos y la interacción de p85 con el dominio helicoidal del p110α pérdida de R358 y el truncamiento en este punto y puede imitar el efecto de las mutaciones de dominio helicoidales p110α. Hemos demostrado previamente que las mutaciones en el dominio helicoidales E542K y E545K son, con mucho, las mutaciones más comunes que se encuentran en
PIK3CA Hoteles en cáncer de vejiga [4] y son más potentes que H1047R en la inducción de la señalización aguas abajo de AKT y la proliferación en la confluencia y en condiciones de agotamiento de los nutrientes cuando se expresa en células uroteliales normales [29]. Como el mutante de truncamiento R358X elimina ambas regiones iSH2 y CSH2 de la proteína, la interacción con el dominio C2 de p110α se pierde y efectos pueden imitar los descritos para las mutaciones y truncamientos que afectan a estos dominios [33]. De los datos de secuenciación, y el conocimiento de que había mínima de tejido normal de contaminante en la muestra, esta mutación parecía ser heterocigótico. Por lo tanto, se prevé que, además de la proteína truncada, la proteína no mutante estaba disponible para p110α de unión y estabilización en este tumor.
A. diagrama de cintas de la estructura del complejo de p110α con la región niSH2 de p85 (código PDB 2RD0) que muestra los residuos mutados en UC. B. Relación de p85 nSH2 a p110α C2 dominio que muestra la proximidad de la N377 en nSH2 a C2 E365 residuo de dominio. C. Relación del dominio iSH2 de p85 con el dominio C2 del p110α que muestra la proximidad de R557 al N345 en C2. modelo que muestra los residuos R481 y R557 en iSH2 de p85 en contacto con el C2 del p110α D. de compilación. E. Estructura del dímero p85 (AP código 1PBW) que muestra la posición de los residuos de punto mutado PIK3R1 E137, R262 y K288 y la región suprimida (W237-Y242) en la Universidad de California en relación con los residuos que participan en la dimerización p85 (M176, verde /luz oscura cian; L161, i177 y V181, luz verde /cian). También se muestra la posición del residuo R274 (magenta), que está implicado en la actividad de Rab-GAP. Además, tres residuos de ácido glutámico (E266, E284 y E291) que interactúan con R262 se indican, con E291 también interactuar con K288.
N377, que fue mutado a lisina, se encuentra junto a G376, que fue encontrado con anterioridad a mutar a la arginina en 3 casos de glioblastoma [16,34]. Ambos residuos son dentro de una región (374 a 377) que se prevé para interactuar con los residuos 364-371 en el dominio C2 de p110α [32]. En la estructura cristalina de p110α en complejo con p85niSH2, tanto G376 y N377 están a poca distancia del enlace de hidrógeno E365 en p110α C Figura 2B.
Seis mutaciones sin sentido y dos deleciones en marco se identificaron en el dominio iSH2. Esta es la región donde la mayoría de las mutaciones se han encontrado en otros tipos de cáncer, aunque ninguna de las alteraciones que se encuentran aquí son idénticos a los descritos anteriormente [14,16,17,19,20]. Esta región de la proteína está implicada en la interacción con la región de unión adaptador de p110α y en la estabilización y la inhibición de su actividad catalítica en el estado basal a través de la interacción con el dominio C2. El efecto predicho de algunas mutaciones en iSH2 es interrumpir la interfaz con p110α C2 [16,33]. Por ejemplo, p85 residuos, N564, está a poca distancia de los enlaces de hidrógeno en C2 N345 p110α (Figura 2C), un residuo que se ha encontrado mutado en p110α [35]. D560Y reportado en glioblastoma [16] también está a un enlace de hidrógeno de N345 y ambos se predice, por tanto, para imitar la mutación oncogénica N345. Aquí nos encontramos con una nueva mutación, R557P que también está cerca de la N345 p110α (Figura 2C). R481, que se encuentra mutado a triptófano, también se encuentra en las proximidades del dominio C2 de p110α Figura 2D).
Los dos deleciones en marco identificados en iSH2 (I566_D578del y Q579_Y580del) eliminar eventuales residuos de aminoácidos que tienen ha encontrado para ser eliminados en los cánceres de ovario y colorrectal [14,17] y glioblastoma [16] y se prevé que romper la estructura secundaria helicoidal en esta región y perturbar la interacción con p110α C2. El Q579_Y580del mutación se ha informado de obligar y estabilizar p110α pero han reducido la capacidad de regular la actividad de la quinasa de lípidos de la p85 p110α holoenzima [17]. Recientemente, nueve de las mutaciones nSH2 y iSH2 que se encuentran en otros tipos de cáncer se expresaron en fibroblastos de embrión de pollo y toda transformación inducida, medida por la actividad de formación de foco, aumento de la proliferación y el aumento de la señalización a través PI3K [36]. Los inhibidores específicos de p110α, pero no inhibidores de p110γ p110β, o p110δ abolieron los efectos fenotípicos de dos de estas formas mutantes derivados del tumor (KS459delN, DKRMNS560del), lo que indica que la actividad oncogénica de estos mutantes está mediada únicamente por p110α.
el más mutación N-terminal iSH2 identificado, N441I, se encuentra en una zona de enlazamiento entre nSH2 y iSH2, y se encuentra cerca del final de la segunda hélice alfa de iSH2. Esta región no se resuelve en las estructuras cristalinas publicados y su efecto potencial no está claro. T654I en el dominio CSH2 está cerca de varios restos que están mutados en el cáncer de colon [17] y se encuentra inmediatamente adyacente al motivo FLVRES (residuos 646-651) que se requieren para la participación de fosfotirosina. Un residuo de serina o treonina en esta posición se encuentra en los dominios SH2 de una amplia gama de proteínas. Varias mutaciones dentro de este dominio se han reportado en los cánceres de colon [17], pero no en el glioblastoma [16,34], aumentando la posibilidad de que puede haber diferencias específicas de tejido.
Curiosamente, encontramos cinco mutaciones dentro de la BH dominio de PIK3R1 (28% de las mutaciones encontrado) (Figura 1; la Figura S1). pantallas de mutación previos han identificado sólo siete mutaciones en esta región (K142fs, E160 *, * R162, I177N, E217K, N285H, E297K) en más de 1550 muestras de otros tumores reportados hasta la fecha [14,16,17,18,19, 20,34] (& lt; 0,5%). Todas las mutaciones de aminoácidos en esta región (E137K, y R262T K288Q) están en residuos altamente conservados (Figura S3). La estructura de esta región de la proteína (aminoácidos 105-319) como un homodímero ha informado [37]. La interfaz entre los dominios BH se demostró que implican la interacción de M176 de un monómero con L161, i177 y V181 en el otro. Las tres mutaciones puntuales y eliminación identificados aquí están alejadas de esta región de interacción (Figura 2E).
p85 mutantes de dominio BH interactúan y se estabilizan p110α
Para determinar si las proteínas mutantes de dominio BH tienen p110α efectos dependientes, que pusieron a prueba su capacidad de interactuar con y estabilizar p110α. p85, β δ nocaut (nulo pan-p85) MEFs fueron transducidas con vectores de expresión retrovirales que codifican N-terminal HA-etiquetados p85 cDNA que codifica las formas mutantes de dominio BH identificados en la Universidad de California (E137K, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q), otra formas mutantes como controles (R162 *, p85Δ, R274A-bovina, N564D), de tipo salvaje (WT) o vector vacío. R162 * mutante p85 es una mutación de dominio BH previamente identificados en el cáncer [17] y como p85Δ carece de la región de unión p110α (n-iSH2) [38]. Ambos han sido previamente demostrado que no interactuar con p110α [17]. N564D iSH2 p85 mutante se utilizó como control positivo, ya que previamente se ha demostrado que se unen p110α, aumentar la actividad AKT PI3K y, e inducir la supervivencia de las células, el crecimiento independiente de anclaje y fenotipos relacionados de transformación-P110 que eran dependientes de [17]. También se utiliza aquí para evaluar las posibles diferencias entre las formas mutantes de dominio BH y iSH2 de p85. R274A es una forma mutante de dominio BH ingeniería de p85 bovina que se ha demostrado previamente para inhibir la actividad de p85-GAP y fue oncogénico [21,39].
La expresión de p85 fue confirmada por Western Blot (Figura 3A). Una proteína p85 truncada era visible en el R162 * -MEF (18 kDa), pero en el E218 * -MEF, se expresó la proteína truncada (24 kDa) a un nivel muy bajo. Tres transducciones independientes con E218 * virus indujeron consistentemente baja expresión de la proteína lo que sugiere que esta proteína puede ser inestable. Curiosamente, R162 * -MEF expresó también una pequeña cantidad de proteína p85 de longitud completa.
A. Inmunotransferencia que muestra los niveles de expresión de proteínas p85 en las células transducidas. B. Co-inmunoprecipitación de proteínas marcadas con HA seguido de inmunotransferencia con p85 y p85 para determinar p110α-P110 vinculante. C. El análisis por inmunotransferencia de la señalización de PI3K (niveles de pAKT (Ser473)) en medio que contiene suero y gráfico de barras muestra la cuantificación de pAKT normalizado a AKT total en relación con el control. D. Análisis de inmunotransferencia de pAKT (Ser473) en medio que contiene suero y gráfico de barras muestra la cuantificación de pAKT normalizado a AKT total en relación con el control.
Pan-p85 MEF nulos tienen bajos niveles de p110α, que puede ser restaurado mediante la expresión de p85 de tipo salvaje [40]. Se confirmó esto y mostró que todas las formas mutantes excepto E218 *, R162 * y p85Δ tuvieron el mismo efecto (datos no mostrados). Co-immunopreciptation de las proteínas p85 marcadas con HA se utilizó para evaluar p110α de unión (Figura 3B). Los resultados indicaron que todas las proteínas p85, excepto E218 *, * R162 y p85Δ, podría obligar p110α.
BH y iSH2 dominio mutantes de p85 muestran diferentes efectos sobre la activación de AKT y el crecimiento independiente de anclaje
p85 formas mutantes del dominio C-terminal que afectan la actividad p110α normalmente como resultado la activación de AKT. Esto ha sido demostrado por varios mutantes de p85 que se pueden unir p110α [17,19,20]. En pan-p85 MEF nulos reconstituidas con el tipo salvaje y formas mutantes de p85, se observa que sólo el mutante N564D indujo mayores niveles de fosfo-AKT (Ser473), tanto en medio que contiene suero (Figura 3C), y en condiciones de suero -deprivation (datos no mostrados). Esto también se observó en NIH3T3 que expresan de tipo salvaje y formas mutantes de p85 cuando se mantiene en condiciones suplementado con suero (Figura 3D). Esto es consistente con el hallazgo anterior en NIH3T3 que bovina R274A no afecta a la fosforilación de AKT después de la estimulación con PDGF [21]. Este patrón se refleja en las tasas de proliferación de células MEF y NIH3T3 cuando mantuvieron en medio que contiene suero y la hora de evaluar el crecimiento independiente de anclaje de células NIH3T3 (datos no mostrados). Análisis del crecimiento independiente de anclaje de células Rat1 que expresan de tipo salvaje y formas mutantes de p85 mostró que mientras que los mutantes de dominio BH indujeron alguna formación de colonias en relación con p85 de tipo salvaje, N564D tuvo el mayor efecto (figura S4).
Relación con otras mutaciones en los genes de la vía PI3K
Anteriormente hemos examinado las muestras analizadas aquí por
PIK3CA mutación
[[4] y datos no publicados]. Sólo dos muestras contenían tanto
PIK3R1
y
PIK3CA
mutaciones (E545K) y uno de ellos fue el tumor que tenía una mutación de dominio BH (E137K) en
PIK3R1
. En general, 61 de los tumores examinados contienen
PIK3CA
mutaciones (23%). Por lo tanto,
PIK3CA
mutación fue insuficientemente representadas en el subconjunto que tenía
PIK3R1
mutación (1 observada; 5 espera). De este modo
PIK3R1
no mutaciones en el dominio BH parecen ser mutuamente excluyentes con
PIK3CA
mutación en la UC. No hubo una relación significativa de
PIK3CA
o
PIK3R1
mutación con el grado del tumor o de la etapa. Cuatro de las muestras contienen
AKT1
mutaciones (E17K), ninguno de los cuales coexistieron con
PIK3R1
mutación.
TSC1
estado de la mutación es conocida por 148 tumores de la serie, de los cuales 14 contienen una mutación [4]. Uno de estos tumores tenían una mutación en el dominio BH de
PIK3R1
(W237_Y242del). Sin embargo el tamaño de la muestra y de mutación frecuencias son demasiado pequeños para cualquier coincidencia significativa o exclusividad mutua ser identificado.
PIK3R1 expresión se reduce en la UC y líneas celulares
A medida que las mutaciones p85 pueden alterar interacciones proteína: proteína de p85, algunas de las cuales, en particular los del dominio BH, podría indicar un papel supresor de tumores , hemos considerado la posibilidad de que la regulación a la baja de la proteína podría contribuir al desarrollo de tumores.
PIK3R1
se localiza en el cromosoma 5 (5q13.1). La pérdida de heterocigosidad (LOH) y el número de copias de secuencias en la pérdida del cromosoma 5q se han reportado en el cáncer de vejiga [41,42]. Por CGH array se ha encontrado que el 29% de músculo invasivo UC tiene pérdida de número de copias en la región de
PIK3R1
[43]. El examen de los datos de expresión públicamente disponibles se indica que la UC tiene una reducción significativa en la expresión PIK3R1 a nivel del ARN (Figura 4A).
A. Análisis de los niveles de expresión p85 mRNA en 105 muestras de tumor de vejiga y 52 muestras de vejiga normales. Los datos de Sánchez-Carbayo et al [30]. B. Análisis cuantitativo de p85 immunoblotted muestras de proteínas a partir de líneas celulares de cáncer de vejiga normalizados a la tubulina y muestran relación con las células normales agrupados humanos urotelial (NHU-piscina).
Se evaluó la expresión de la proteína p85 en células UC 44 líneas utilizando el Western Blot. Esto reveló una amplia variación en los niveles de expresión con la mayoría de las líneas celulares (80%) que muestra reducida expresión de la proteína p85 en comparación con las células uroteliales normales (Figura 4B).
Discusión
En este estudio se encontró
PIK3R1
mutaciones en el 4,9% de la UC. La mayor frecuencia encontrado aquí que en el estudio previo de UC [18] refleja nuestra evaluación de todo el gen en lugar de solamente exones 12, 14 y 15. Los datos para esos tres exones revelaron 5 mutaciones (1,8% de los tumores), compatibles con este estudio anterior. La mayoría de las mutaciones se encuentra en la región C-terminal de p85 similares a los hallazgos en otros cánceres humanos [14,16,17,19,20]. Las mutaciones identificadas en los dominios nSH2 y iSH2 puede imitar el efecto de las mutaciones p110α por el alivio de la regulación inhibidora de p110α por p85 y la actividad oncogénica de estos mutantes parece estar p110α dependientes [36].
Curiosamente, encontramos una mayor frecuencia de mutaciones en el dominio BH en comparación con pantallas de mutación anteriores. Si esto es específico de la UC aún no es clara debido a que el foco de muchos estudios sólo en la región p110α -interacting del gen. Los datos recientes sugieren que dominio BH formas mutantes de p85 pueden alterar la estabilidad de PTEN [20]. p85 se une a PTEN no fosforilada en el complejo de alto peso molecular asociado PTEN (PAC) [22]. Esta interacción implica la región N-terminal de p85 (SH3-BH) y se ha demostrado que regulan positivamente la actividad lípido cinasa de PTEN en un factor dependiente de la forma de crecimiento [23]. La expresión de p85 con deleción del dominio BH sola interacción reducida significativamente con PTEN y la supresión de ambos dominios abolió, lo que aumenta la amplitud y la duración de la activación de AKT después de la estimulación del factor de crecimiento [23]. Por lo tanto, PTEN: p85 interacción parece potenciar la capacidad de PTEN para reducir los niveles de PIP3 y terminar de señalización a AKT. De hecho, la mutación E160 * identificado en carcinoma endometrial ha sido demostrado para desestabilizar PTEN y resultar en aumento de la fosforilación de AKT [20].
La región BH también muestra homología de secuencia con proteínas RhoGAP y posee actividad GAP hacia Rab5, Rab4, Cdc42 y Rac1 [21].