Extracto
Antecedentes
La migración celular es un proceso muy complejo, regulado por múltiples genes, vías de señalización y los estímulos externos. Para descubrir genes o agentes farmacológicos que pueden modular la actividad migratoria de las células, la selección de estrategias que permiten el seguimiento de los diversos parámetros migratorias en un gran número de muestras necesarias.
Metodología
En la presente estudio, se describe el desarrollo de un ensayo de migración celular cuantitativa, de alto rendimiento, basado en unas pistas phagokinetic modificados procedimiento (PKT), y aplicarlo para la identificación de nuevos genes pro-migratorias en una biblioteca de genes relacionados con el cáncer. En resumen, las células se siembran en placas de 96 pocillos recubiertas de fibronectina, cubierto con una monocapa de perlas de látex carboxilados. células móviles despejar las perlas, que se encuentra a lo largo de sus rutas migratorias, formando las pistas que se visualizaron utilizando un microscopio de proyección de luz transmitida automatizado. Las pistas están segmentados y luego caracterizan por multiparamétrica, análisis morfométrico, la resolución de una variedad de características morfológicas y cinéticos.
Conclusiones
En esta pantalla se identificaron 4 nuevos genes derivados de carcinoma de mama relacionado biblioteca de cDNA, cuya sobreexpresión induce alteración importante en la migración de las células MCF7 estacionarias. Este enfoque puede servir para el cribado de alto rendimiento para nuevas formas de modular la migración celular en estados patológicos como la metástasis tumoral y la invasión
Visto:. Naffar-Abu-Amara S, T Shay, Galun M, N Cohen, Isakoff SJ, Kam Z, et al. (2008) Identificación de nuevos pro-migratorias, los genes asociados con el cáncer Uso de cribado basados en la microscopía cuantitativa,. PLoS ONE 3 (1): e1457. doi: 10.1371 /journal.pone.0001457
Editor Académico: Neil Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 21 Octubre, 2007; Aceptado: 18 de diciembre de 2007; Publicado: 23 Enero 2008
Derechos de Autor © 2008 Naffar-Abu-Amara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación de Ciencias de Israel y una subvención NIGMS para la migración celular Consortium (NIH subvención U54GM64346), y por el fondo de Kahn para la biología de sistemas en el Instituto Weizmann
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
la migración celular desempeña un papel crítico en numerosos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, las respuestas inflamatorias, la cicatrización de heridas y la angiogénesis, así como en estados patológicos tales como la invasión tumoral y la metástasis [1], [2]. Para explorar los mecanismos que subyacen a la regulación de la migración celular, se han desarrollado una variedad de métodos cualitativos y cuantitativos. Estos incluyen películas a intervalos de 2 y 3 dimensiones, el seguimiento de la migración de las células cultivadas o de tejido incrustado-[3], [4], ensayos de cierre de heridas [5] - [7], ensayos de matriz de permeación [8] , [9] y la "grabación" de la migración de las células "historia", basado en ensayos tales como la formación de PKT [10]. El último ensayo es ampliamente utilizado para el estudio de las actividades migratorias de diferentes tipos de células [3], [11], matriz de remodelación [12], [13] y la perturbación de la migración celular por moduladores químicos o genéticos [14] - [19]. Tales estudios son de particular relevancia para la motilidad de células de cáncer, que se cree que reflejan el potencial invasivo o metastásico de estas células in vivo [14], [20] - [23]. Por lo tanto, la identificación de los productos químicos que alteran la migración celular, o genes específicos cuya perturbación afecta a la migración de células potencialmente podría utilizarse para la modulación de la migración celular metastásico.
Nuestro objetivo en el presente estudio fue desarrollar un enfoque basado en los PKT para el seguimiento de la migración de células, que es reproducible, compatible con microscopía de alto rendimiento, y proporciona información cuantitativa, morfológicos y dinámico, en el proceso migratorio. Mostramos aquí que mientras que el PKT registra la historia integral de la actividad migratoria en un solo punto del tiempo, el software de imagen cuantitativa, permite el cálculo de ambos parámetros "estáticos", tales como la longitud de la pista y la zona, y los parámetros "dinámicos", tales como las tasas de migración , la persistencia y la actividad lamelar.
el ensayo de migración de alto rendimiento descrito en este documento, y el software de imagen desarrollado para medir diferentes características del proceso migratorio, proporcionan un enfoque rápido, fiable y cuantitativa para evaluar la migración de células en diversas tipos de células, cultivadas bajo condiciones variables, y expuestos a una variedad de perturbaciones químicas o genéticas.
resultados
Desarrollo de una basada en perlas de alto rendimiento de ensayo PKT
crítica para el desarrollo de este ensayo PKT fue la selección de perlas adecuadas, con dimensiones óptimas y propiedades químicas (Tabla S1). Las perlas que se encontraron más adecuado para ensayos de PKT aplicadas a una amplia variedad de tipos de células eran de látex-carboxilato de metilo modificado (CML) perlas de poliestireno blanco, con un diámetro medio de 340 nm, y un contenido de carga negativa de 184,7 eq /g. Estas perlas forman una monocapa homogénea y visible; su adhesión al sustrato es suficiente para evitar el desprendimiento espontáneo firme, pero todavía son susceptibles a la eliminación por células que migran
Se encontró que la química de la superficie de las perlas de tener un fuerte efecto en el ensayo de PKT:. perlas con un aldehído superficie -Modificado unido firmemente al sustrato, y no puede ser eliminado mediante la migración de células. Granos con una superficie sulfatado tendían a agregarse, produciendo una monocapa no uniforme. perlas carboxiladas, con o sin grupos sulfato adicionales, tendían a formar suspensiones más bien homogéneas después de la centrifugación. La densidad superficial de los grupos carboxilato también afectadas formación pista: una densidad de carga baja (23,9 eq /g) causaron el cordón para interactuar fuertemente con la superficie, de modo que muchos tipos de células no lograron eliminar eficazmente las perlas a medida que migran. Granos con grupos carboxilato de densidad intermedia (91,4 eq /g) se encontraron óptima para algunas células adherentes (por ejemplo, H1299, REF52) pero no para las células con adherencias más débiles (por ejemplo, MCF7; B16-F10). Se encontraron perlas que contienen grupos carboxilo con una densidad de 160 a 185 eq /g para ser óptima para los ensayos aplicados a una amplia gama de tipos de células
.
Además, el diámetro de las perlas tuvo un efecto importante en la visibilidad de las pistas y de la estabilidad de la monocapa. Por lo tanto, pequeñas perlas (& lt; 300 nm de diámetro) no podrían ser visualizados, mientras que las grandes cuentas (~1,000 nm de diámetro) tienden a desprenderse de la superficie y vuelva a conectar de forma espontánea, lo que resulta en pistas mal definidos. Se encontró que el diámetro óptimo del grano para ensayos automatizados PKT en alrededor de 400 nm.
El desarrollo del sistema automatizado de microscopía
ensayos de PKT se registraron utilizando un microscopio de detección de células [24] equipado con una dispositivo de enfoque automático por láser [25]. El programa operativo del microscopio y el software de adquisición de imágenes se escriben como una aplicación dentro del entorno de la UCSF PRIISM (http://msg.ucsf.edu/ive). Para esta aplicación, se tomaron imágenes utilizando un objetivo de 10x /0,4, con iluminación de luz transmitida. Un difusor de luz se inserta por encima de la placa de múltiples pocillos, para reducir al mínimo la iluminación no homogénea y evitar las sombras causadas comúnmente por las paredes estrechas así
El programa de adquisición dedicada controla la iluminación.; autoenfoque y adquisición de imágenes pasos para todos los campos seleccionados dentro de cada pocillo, y para todos los pozos seleccionados en la placa, mientras que la optimización de los detalles experimentales (por ejemplo, número así, la posición de campo, tiempo de exposición, el objetivo, el establecimiento de óptica, y similares). Con el fin de grabar un número máximo de pistas de células completas, las imágenes de los campos adyacentes se funden en un montaje sin problemas, en el que realiza un seguimiento que abarca más de una imagen se fusionan a alta precisión (Figura S1).
La cuantificación de la migración parámetros, por su morfología PKT
para identificar las pistas individuales, las imágenes fueron sometidos a "aplanar", compensando así la iluminación no homogénea, alisar y mejora del contraste. El histograma de intensidad resultante produjo un pico principal, correspondiente al fondo imperturbable (Figura 1c, asterisco negro); un pico de alta intensidad correspondiente a las pistas libres de talón (Figura 1c, asterisco azul); y los píxeles de baja intensidad que corresponde a células de talón-cargado (Figura 1c, asterisco rojo). Mediante la aplicación de dos umbrales binarios, células (Figura 1d), y las pistas (Figura 1e) podría diferenciarse unos de otros. Escombros, los arañazos, las pistas que no tenga o más de una celda, las pistas que se cruzan, y las pistas que se extienden más allá de la frontera del montaje, se identificaron y se separa (Figura 1f, segmentos descritos en azul). Para obtener fina definición de las fronteras de la pista, que fueron un poco borrosa por el paso de suavizado (Figura 1g), se volvieron a calcular límites de las pistas de las imágenes originales, utilizando el análisis de segmentación multiescala [26] (Figura 1 h).
(una ) un montaje de 4 × 4 campos (1024 × 1024 píxeles), cada adquiridos utilizando un objetivo de 10x /0,4. (B) un solo campo (512 × 512 pixels, binned 2 × 2) (c) Histograma de intensidad de píxel: el pico principal (*) corresponde a los píxeles del fondo; el pico menor de la intensidad luminosa (*) corresponde a un seguimiento de píxeles; y los píxeles oscuros representan los cuerpos celulares y escombros (*). Las líneas verticales rojas marcan los dos umbrales que separan los píxeles de la pista de las células y el fondo. (D, e) las imágenes binarias, después de la aplicación de los umbrales. Los píxeles con intensidades por debajo del umbral inferior (células y los desechos) son de color blanco en (d), y los píxeles con intensidades por encima del umbral más alto (pistas) son de color blanco en (e). (F) Todos los componentes conectados de todo el montaje se describen: Las pistas se resumen en rojo. Los objetos demasiado pequeños o demasiado grandes en la zona que se incluirán en los análisis de la imagen, o localizados en las fronteras del montaje, se resumen en azul. (G) La ampliación de un campo segmentado siguiente segmentación binaria. (H) La misma área se representa en (g), después de la segmentación de escala múltiple, e incluyendo el esquema bien de la pista y los ejes de la pista. Las barras de escala: 250 micras
Después de la etapa de segmentación, cuantificamos los diversos parámetros morfométricos para cada tipo de célula.. Los parámetros de la pista que se midieron de forma automática incluyen zona de las vías, perímetro, eje mayor, eje menor, relación axial y solidez. Pista de larga trayectoria y la longitud de extremo a extremo se midieron manualmente. Los parámetros de pista calculados a partir de estos parámetros morfométricos incluyen la persistencia, la velocidad efectiva, la velocidad media de la migración, la actividad laminar, y la direccionalidad general. Estos parámetros morfológicos y "dinámico" se definen en la Tabla S2, y gráficamente presentados en la figura 2.
El cálculo automático de los diferentes parámetros morfométricos utilizados en este estudio, se demuestra usando PKTS formados por H1299, B16-F10 y células MCF7. Los parámetros calculados incluyen: Área total de la pista (m
2), delineado en rojo; superficie neta pista después de área de la celda se resta; ejes menor y mayor (M) de la elipse que mejor se adapta; relación de los ejes; velocidad de migración [longitud del esqueleto y ramas (verde + azul) /tiempo de migración], la velocidad efectiva [distancia de extremo a extremo (de color rojo) /tiempo de migración]; realizar un seguimiento de perímetro; rugosidad [Perímetro
2 /(4π * Área)] y solidez [área de la pista (azul) /área de la envolvente convexa (rojo + azul) que encierra la pista]. Los valores indicados en la figura se refieren a la vía única muestra.
En particular, incluso los parámetros aparentemente similares (por ejemplo, "velocidad de migración" y "velocidad efectiva") puede variar en gran medida. Por ejemplo, las células B16-F10, que se muestra en la Figura 2, mostró casi la misma velocidad de migración (62,4 micras /hr) como células H1299 (67,26 m /h), mientras que el segundo tipo de célula está representada una velocidad mucho más alta efectiva (57,26 m /h, en comparación con 20,4 micras /h en células B16-F10), lo que indica una migración más persistente que el primero. Para evaluar la actividad lamelar "lateral", que afecta a la anchura y rugosidad de las fronteras de la pista, que mide el perímetro pista y parámetros de rugosidad y solidez calculados. Este análisis mostró que mientras que los perímetros de pistas formadas por las células H1299 y B16-F10 eran casi de la misma, el parámetro de rugosidad fue considerablemente mayor en las células B16-F10 (5.2) que en células H1299 (3,2), lo que indica una mayor actividad lamelar en el células de melanoma. Este hallazgo fue confirmado directamente por las películas de lapso de tiempo (Figura 3, y películas S1 y S2).
Los diferentes puntos de tiempo se muestran en la cual la actividad laminar lateral de un H1299 (panel superior) o B16-F10 (menor las células del panel) dejan marcas en la forma y rugosidad de la frontera pista. (Películas completas están disponibles en línea de películas S1 y S2 de la película, respectivamente.)
Aplicación de morfometría PKT para la medición de tipo de células específicas y efectos inducidos por las drogas en los parámetros migratorias
a) los diferentes tipos de células producen PKT con características distintas.
el ensayo PKT descrito en este documento se utilizó para probar el comportamiento migratorio de una variedad de líneas celulares. Estos incluyen: B16-F10 y B16-F1 células del melanoma; células de carcinoma de mama MDA-MB-231 y MCF7, REF52, SV80 y de fibroblastos NIH3T3 líneas; células de carcinoma de pulmón H1299, y varias líneas de carcinoma de próstata (DU145, PC3 y CL1). Cuatro de estas líneas celulares (MDA-MB-231, MCF7, H1299 y B16-F10) se utilizan para los fines de ilustración (véase la figura 4a y en la Tabla S3). MCF7 células, por ejemplo, casi no migran, produciendo sólo una pequeña zona, sin cordón alrededor de cada célula, con una superficie media pista neto de 4.900 ± 2.400 m
2 (n = 93). Las células de melanoma B16-F10 producen ramificados pistas debido a la extensión de filopodios múltiple y láminas delgadas en gran medida perpendicular a la pista principal migratorio, con una superficie neta media de 7.400 ± 2.800 m
2 (n = 124). Las células MDA-MB-231 células metastásicas son altamente migratorias, la producción de pistas largas y anchas, con una superficie neta media de 13.500 ± 6.300 m
2 (n = 149). H1299 células se caracterizan por una migración rápida y muy persistente, formando pistas con una superficie neta media de 14.000 ± 7.600 m
2 (n = 104).
(a) Un montaje de 2 × 3 imágenes de el PKT de las células MCF7, así como para las células MDA-MB-231, células B16-F10, y las células H1299. Tenga en cuenta las diferencias en la pista de superficie neta (A
N) y la relación axial (X), dependiendo de la línea celular. (B) Un montaje 2 × 3 imagen de control de las células H1299, que exhiben rutas migratorias largas que son altamente persistente de. Las imágenes de montaje de la latrunculina A (4 M) - y Nocadazole (2,5 M) tratados con pozos indican la motilidad celular inhibida; PMA (100 ng /ml) tratados con bien muestra un aumento en la motilidad celular. Las barras de escala: 250 micras.
b) Los efectos de las drogas sobre el citoesqueleto PKT características estructurales y dinámicas
Con el fin de determinar si nuestro sistema automatizado de detección fue capaz de detectar cambios en el. características migratorios específicos inducidos por perturbaciones genéticas o químicas, se trataron las células H1299 con diversos compuestos (por ejemplo, latrunculin-a, nocodazol y PMA) que se sabe afectan la motilidad celular. El efecto de cada fármaco en los diferentes parámetros morfométricos se midió a continuación (Figura 4b). Dado que los valores de cada parámetro PKT no parecen tener distribuciones estadísticas normales, basamos nuestra comparación de los cambios en los valores de percentiles para cada parámetro morfométrico, en lugar de en los cambios en los valores promedio (Tabla S4). Análisis de la zona de PKT de células H1299 tratadas con los diversos inhibidores indicó que latrunculina-A o Nocodazol marcadamente reducida áreas de pista, relaciones axiales, las velocidades de migración y de rugosidad, en comparación con las células control. En las células tratadas con PMA, el área de PKT, eje mayor y velocidades de migración calculadas aumentaron (p & lt; 0,05), pero el eje menor, relaciones axiales y solidez no difirieron significativamente de los de las células de control
Aplicación. del ensayo PKT a la identificación de genes pro-migratorias en una biblioteca de genes relacionados con el carcinoma de mama (BC1000)
el ensayo descrito en este documento PKT se utilizó para seleccionar una biblioteca de genes relacionados con el cáncer por su capacidad para inducir un fenotipo migratorio en las células epiteliales de mama en gran medida estacionarios. A tal fin, se infectaron células MCF7 cultivadas con vectores retrovirales que codifican 55 genes seleccionados de la biblioteca BC1000 (cuadro S5) y probamos su actividad migratoria por medio de la detección cuantitativa PKT.
Tal como se muestra en la figura 5a y la Tabla S6 , la pantalla PKT nos ha permitido identificar cuatro nuevos candidatos pro-migratorias: HOXB7, FGF7, ERBB3 y PKCζ. El 80
º valores de los percentiles, así como la media y la desviación estándar, se presentan en la Tabla S6. Mientras que los cuatro genes estimulan la migración celular MCF7, sus efectos sobre los distintos parámetros diferían migratorias. Así, mientras que FGF7 y PKCζ clones inducidos, la formación de pistas persistentes largos, debido a la mejora de salientes de membrana de dirección, las pistas alargadas, inducidas por HOXB7 y ERBB3 parecían estar asociado con múltiples salientes de membrana en todas las direcciones. Por lo tanto, mientras que la prominencia de las direccionales "salientes delanteros" no se puede evaluar directamente por la pista morfometría, es evidente que el aumento de longitud de la pista que no vaya acompañado por altos valores de rugosidad es, muy probablemente, impulsado por el aumento de la actividad lamellipodial direccional (Tabla S6 y la figura 5). Es interesante observar que en la pantalla de la biblioteca BC1000, los cambios en el comportamiento migratorio se observaron para otro gen, a saber MFGE8 (también conocido como epiteliales de mama BA46 antígeno). Mientras que la sobreexpresión de este gen inducido solamente mejora de menor importancia en el área de PKT, que se mejoran en gran medida la pista rugosidad, lo que sugiere que mejora la protrusión de la membrana no direccional (Naffar Abu-Amara, datos no publicados).
(a) A montaje de 4 × 4 imágenes, comparando PKT producida por las células de control GFP-MCF7, a los producidos por las células MCF7 que expresan los genes BC1000 derivados HOXB7, PKCζ, FGF7, y ErbB3. Ampliación: 10 aumentos. Barras de escala: 250 m. (B) relación calculada entre cada uno de los parámetros morfométricos migratorias de los diferentes candidatos biblioteca BC1000, y los de las células control (GFP-MCF7). El enfoque estadístico primario utilizado se basa en el cálculo, para cada parámetro, el del efecto normalizado de GFP-de control siempre se define como cero "80
percentil.": Un valor de cero indica que no hay diferencia entre el "80
th "valor del percentil del gen candidato, y de las células de control. Los números que son superiores o inferiores a cero indican un aumento o disminución, respectivamente, en el 80
TH valor de percentil de los parámetros ensayados. (Para más detalles, véase la Tabla S6).
Para determinar las interrelaciones entre los distintos parámetros migratorias, se aplicó el test de correlación de Pearson para todos los PKT producida por las células no perturbadas (Figura S2). Este análisis reveló, por ejemplo, que la longitud de la pista (eje axial y gran relación) se correlaciona negativamente con la pista solidez, lo que indica que la producción de pistas alargadas por las células de control está altamente correlacionado con la actividad de protrusión lateral. Este análisis se aplicó también a las células que expresan los diferentes genes pro-migratorios, con el fin de determinar su capacidad para interrumpir la interdependencia aparente entre los diversos parámetros migratorias. Estos análisis demuestran que, la sobreexpresión de PKCζ, HOXB7, y ERBB3 disminuyó la relación recíproca entre la longitud de la pista y solidez.
En cuanto a las relaciones entre la relación axial y las dimensiones de los ejes grande y pequeño, las células de control muestran la contribución predominante del eje largo al valor de la relación axial, con el eje menor ejerciendo un efecto limitado. En las células que expresan FGF7 y PKCζ la relación axial se correlacionó principalmente al eje principal, mientras que ERBB3 y HOXB7 afectados la relación axial cambiando el ancho de vía. Por tanto, parece que el aumento de la migración de células en general por diferentes genes pro-migratorias pueden ser alcanzados por la modulación selectiva de una variedad de funciones celulares dinámicos tales como la polarización celular y la actividad de la membrana protrusión.
Discusión
el objetivo principal de este estudio fue el desarrollo de un ensayo cuantitativo para la migración celular, que podría medir características múltiples migratorias, y sería compatible con cribado de alto rendimiento. El principal desafío experimental que participan en el diseño de un ensayo de este tipo es el aparente conflicto entre la adquisición rápida de gran cantidad de datos de la migración, y la necesidad de obtener "alto contenido" información sobre el comportamiento migratorio de muchas células, incluyendo las características dinámicas tales como la velocidad de migración y la actividad lamellipodial. Desde colección de información dinámica directa sobre la migración celular es incompatible con un alto rendimiento, por lo que optó por explorar indirecta, sin embargo, reproducible y robusta, enfoques para la obtención de dicha información. Proponemos en este documento que el análisis morfométrico detallado de PKT generada por células que migran individuales puede proporcionar estos datos cuantitativos, morfológicas y dinámicas aparentemente
Los aspectos novedosos de este estudio que merecen discusión específica son:. (I) la elección de los granos ; (Ii) la pista segmentación y morfometría; y (iii) el análisis estadístico de los datos. La selección de los granos para el ensayo de PKT se basó en tres propiedades del "campo de la migración": la visibilidad de la pista (afectados principalmente por el tamaño del grano, con un diámetro de perla óptimo de 300-400 nm); su capacidad para formar una capa homogénea (óptimo con aldehído o superficies carboxilados; pobre con perlas de sulfato-modificado), y la capacidad de ser eliminados por la migración de células (óptimo con carboxylated- y pobres con los granos modificada con aldehído). En particular, la susceptibilidad de perlas carboxiladas a la eliminación por células que migran se correlaciona inversamente con la densidad superficial de los grupos carboxilato, lo que permite "ajuste fino" de la capa del grano para el tipo de célula particular a ensayar
.
segmentación PKT y morfometría proporcionan importantes conocimientos sobre las características básicas del proceso migratorio. Estos incluyen la actividad migratoria global de la célula, que corresponde a la superficie neta PKT; polaridad migración, correspondiente a la longitud del eje mayor de la migración (o la relación axial); y la actividad lamelar "lateral", medida por la solidez de la pista, entre otros valores. Sobre la base de estas mediciones, se calcularon varios parámetros dinámicos, incluyendo las tasas de migración promedio y eficaces, y la actividad lamelar. Naturalmente, la información dinámica, deducida de la morfología PKT estática, es más bien indirecta, sin embargo, los datos de alta resolución [en especial la rugosidad de las fronteras de la pista, medido por análisis de segmentación multiescala [26]; (Figura 1h)], que podría ser correlacionada con información dinámica, basada en la microscopía de vídeo de lapso de tiempo (Figura 3). Una vez calculada para cada pista, los múltiples parámetros podrían estar correlacionadas entre sí, ya sea en las células de control, o después de la perturbación química o genética.
Para nuestros propósitos, el ensayo de PKT se utilizó para descubrir nuevos genes pro-migratorias en una biblioteca de genes relacionados con el carcinoma de mama. El fundamento de este enfoque es que a pesar de la complejidad molecular evidente del proceso de migración celular, puede haber "genes maestros" que podrían inducir características migratorias en una célula estacionaria. La capacidad única del ensayo PKT hemos desarrollado para destacar y cuantificar las características individuales del fenotipo migratorio, a continuación, podría vincular un gen pro-migratoria dada a los mecanismos migratorios específicos. Los nuevos genes pro-migratorias identificadas aquí incluyen: HOXB7, ERBB3, PKCζ y FGF7. Mientras que todos estos genes son conocidos por ser "relacionados con el cáncer", los actuales estudio apunta a la posibilidad de que su contribución al proceso maligno podría estar relacionado con su actividad pro-migratoria.
Materiales y Métodos
Preparación de cordón recubierto de placas de 96 pocillos
fondo de cristal placas de 96 pocillos (Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA, Cat.#7706 a 2.370) se incubaron durante 2 horas a la temperatura ambiente, con 50 l de solución de fibronectina 10 mg /ml disueltos en PBS (fibronectina, F-1141; Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EE.UU.). Los pocillos se lavaron dos veces con PBS y se recubrieron con 340 perlas nm blancos de látex de poliestireno (interfaciales Dynamics Corporation-Molecular Probes Microesferas Technologies, Estados Unidos; Nº de artículo 2-300;. de lote 1344.). La suspensión de microesferas (3,2 ml) se centrifugó durante 5 minutos a 20.800 x g, y el sedimento se resuspendió en 4 ml de PBS, hasta que se dispersaron todos los grupos de talón visibles. A continuación, el procedimiento de sedimentación se repitió una vez más, después de lo cual las perlas se volvieron a suspender en 7 ml de PBS, a una concentración final de 0,9
12 partículas /ml. Las alícuotas de 70 l de la suspensión de perlas se añadieron a cada pocillo, que había sido pre-recubiertas con fibronectina, y se incubaron a 37 ° C durante 2 horas, seguido de un lavado suave con PBS (x 5) usando un lavador de placas (Colombus Plus , Tecan, Suiza). Antes de chapado célula, el PBS se reemplazó con 50 l de medio de cultivo adecuado para el tipo particular de célula utilizado en el ensayo (véase la figura S3).
Preparación de las células para el ensayo de PKT
MCF7 (ATCC -HTB-22), MDA-MB-231 (ATCC-HBT-26), y B16-F10 (ATCC-CRL-6475), las células se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM); células H1299 (ATCC-CRL-5803) se cultivaron en medio RPMI-1640. Tanto los medios de cultivo se complementaron con 10% de FCS, glutamina 2 mM, 100 unidades internacionales /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), y mantenido en un 5% de CO
2 incubadora humidificada a 37 ° C. Para el ensayo de PKT, 200-400 células (en 50 l de medio) se cultivaron en cada pocillo. Dependiendo de las dimensiones típicas de la pista, tal como se determina en experimentos preliminares, el número de células cultivadas en placas, y el tiempo de incubación se calibraron para maximizar el número de pistas de células individuales, que no se cruzan. Típicamente, se encontraron 200-400 células /pocillo y 7 horas de incubación a ser parámetros óptimos para la mayoría de las células.
perturbaciones farmacológicas de formación PKT
Para determinar los efectos de varios inhibidores farmacológicos de la línea celular H1299, se sembraron y se incubaron durante una hora, después de lo cual se trataron con 4 M latrunculina a las células; 2,5 M Nocodazol; o 100 ng /ml de PMA (forbol 12-miristato 13-acetato). Las células se incubaron entonces durante 4 h adicionales, se fijaron con paraformaldehído al 3% y se lavó dos veces con PBS. Las placas se examinaron de forma inmediata por medio de un microscopio de enfoque automático de detección, o se almacenaron a 4 ° C para su posterior inspección.
La detección de los genes que inducen la migración
Para la detección de los genes que inducen la migración, nos seleccionados 55 genes candidatos de la biblioteca: BC1000 (http://www.hip.harvard.edu/research/breast_cancer/index.htm), reunidos en el Instituto de Proteómica de Harvard usando el software de la literatura minera [27]. Esta biblioteca consiste en una colección de ADNc de longitud completa se sabe están asociados con el desarrollo del cáncer de mama. Los ADNc se clonan en un vector retroviral puromycin- seleccionable (JP1520) [28] utilizando el sistema de recombinación Creator ™ (Clontech, Mountain View, CA). Los 55 genes analizados (véase el cuadro S5) fueron seleccionados al azar de esta biblioteca, y fueron generosamente proporcionadas por el Prof. Joan Brugge (Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina de Harvard, EE.UU.). Los genes se introducen en las células MCF7 por medio de la infección retroviral. Cada clon se ensayó para determinar su impacto sobre la migración celular, utilizando el ensayo de PKT. Como controles, también generamos células MCF7 expresan GFP JP1520. El ensayo PKT se llevó a cabo en placas de 96 pocillos. Cuatrocientos células por pocillo se sembraron, y 8 pozos fueron probados para cada clon. Las células se incubaron durante 7 horas, y después se fijaron con 3% PFA. Los datos se recogieron usando un microscopio de enfoque automático de detección.
Análisis estadístico
Dado que la distribución de los parámetros de pista muestra las distribuciones no normales, se utilizó la herramienta estadística percentil de los parámetros estimados de la variabilidad. Por ejemplo, el 80
percentil para la zona de las vías es el valor más abajo la cual se encuentran el 80% de la superficie de pistas.
Se evaluaron las diferencias entre el control y los cultivos tratados utilizando importancia para la de dos muestras de Kolmogorov Smirnov prueba de hipótesis de bondad de ajuste. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Se llevó a cabo la prueba de correlación de Pearson, con valores que van de 1 (una relación lineal positiva perfecta entre dos variables de la prueba) a -1 (una perfecta. relación lineal negativa). Un valor de p & lt; 0,0014 fue considerado estadísticamente significativo
Apoyo a la Información sobre Table S1..
La comparación de las propiedades de los diferentes granos utilizados para el ensayo de PKT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s001 gratis (DOC 0,03 MB)
Tabla S2. Parámetros
anotación
doi: 10.1371. /Journal.pone.0001457.s002 gratis (DOC 0,03 MB)
cuadro S3. El análisis
PKT para las diversas líneas celulares
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s003 gratis (DOC 0,03 MB) sobre Table S4. El análisis
PKT de células H1299 tratada por diversos fármacos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s004 gratis (DOC 0,03 MB) sobre Table S5. List de genes probados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s005 gratis (DOC 0,04 MB) sobre Table S6. El análisis
PKT de las células MCF7 que sobreexpresan un gen pro-migratoria dada
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s006 gratis (DOC 0,05 MB)
Figura S1.
Un esquema que describe el proceso de adquisición de imágenes y visualización. (A) Una plantilla de una placa de 96 pocillos. (B) Las posiciones de los 52 campos que se pueden adquirir dentro de un pozo, utilizando un objetivo de 10 aumentos. (C) Un montaje de 4 × 4 imágenes (1024 × 1024 píxeles), que corresponde a la zona marcada del pozo. (D) Una imagen de resolución completa de un campo (512 × 512 píxeles) dentro del montaje (marcados en c). Barra de escala:. 250 micras
doi: 10.1371 /journal.pone.0001457.s007 gratis (2.03 MB TIF)
figura S2.
auto-correlación entre los parámetros morfométricos PKT en las células de control, y en células que expresan genes pro-migratorias. Auto-correlación entre los diferentes parámetros morfométricos se calculó para el control de la biblioteca (GFP-MCF7), así como para las células que sobreexpresan los diferentes genes pro-migratorias descritos en la figura 5. Cada rectángulo está dividido por una línea blanca en dos triángulos; cada triángulo muestra la prueba de correlación de un candidato diferente. El p-valor de cada resultado de la correlación se indica debajo del número de puntuación de correlación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s008 gratis (4.16 MB TIF)
Figura S3.
Representación esquemática de la preparación placa de 96 pocillos para el ensayo de PKT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s009 gratis (0.96 MB TIF)
película S1. formación
PKT por H1299, chapada en perlas de poliestireno.