Extracto
Una característica de microambiente tumoral es la fluctuación de oxígeno, que resulta de hiper-proliferación y el metabolismo anormal de las células tumorales así como desorganizado neo-vascularización. Reoxigenación de tumores pueden inducir estrés oxidativo, que conduce a daños en el ADN y la inestabilidad genómica. Aunque las respuestas celulares a la hipoxia son bien conocidos, se sabe poco sobre la respuesta dinámica a la reoxigenación. Con el fin de investigar las respuestas transcripcionales de adaptación tumor a la reoxigenación, las células de cáncer de mama MCF-7 se cultivaron en 0,5% de oxígeno durante 24 h seguido de 24 h de la reoxigenación en normoxia. Las células se recogieron a los 0, 1, 4, 8, 12, y 24 h durante la reoxigenación. El perfil transcripcional de células MCF-7 a la reoxigenación se examinó utilizando Illumina Humanos-6 v3 BeadChips. Se identificaron 127 genes expresados diferencialmente, de los cuales el 53,1% fueron reguladas y el 46,9% se redujeron regulado en la reoxigenación. Pathway análisis reveló que la red de factor de transcripción HIF-1-alfa y objetivos validados de activación de la transcripción de c-myc fueron significativamente enriquecido en estos genes expresados diferencialmente. Entre estos genes, un subconjunto de los genes de interés fue validado por cuantitativos PCR de transcripción inversa. En particular, humano N-myc gen 1 reducido regulado (
NDRG1
) fue altamente suprimida tras la reoxigenación. NDRG1 se asocia con una variedad de condiciones reguladoras del crecimiento de estrés y de células. Para determinar si
NDRG1
juega un papel en la reoxigenación, la proteína NDRG1 se sobreexpresa en células MCF-7. Tras la reoxigenación, la sobreexpresión de
NDRG1
migración celular significativamente inhibido. Nuestros resultados revelaron la naturaleza dinámica de la expresión génica en células MCF-7 sobre la reoxigenación y demostraron que
NDRG1
está implicado en la adaptación del tumor a la reoxigenación
Visto:. Lai LC, Su YY, Chen KC , Tsai MH, Sher YP, Lu TP, et al. (2011) baja regulación de
NDRG1
promueve la migración de células de cáncer durante la reoxigenación. PLoS ONE 6 (8): e24375. doi: 10.1371 /journal.pone.0024375
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Julio, 2011; Aceptado: 5 Agosto 2011; Publicado: 30 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Lai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado en parte por subvenciones de la Universidad de Medicina china, Taiwán (concesión no 97F008-119;. 99F008-308; http://english.cmu.edu.tw/) y el Centro de Medicina Genómica de la Universidad Nacional de Taiwán (concesión no . 99R81400; http://www.cgm.ntu.edu.tw/chinese2007/eng_index.asp), y el Consejo Nacional de Ciencia (Grant No. 98-2320-B-002-044-MY3, http: //web1. nsc.gov.tw/mp.aspx?mp=7). Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
poblaciones de tumores necesitan para superar las barreras microambientales distintas antes de la metástasis a otros órganos. cánceres invasivos, por lo tanto, podría ser visto como una serie de adaptaciones en el fenotipo a sus microambientes. Todos los microambientes tumorales se caracterizan por la privación de nutrientes, pH bajo, y la hipoxia [1]. Estos cambios estaban relacionados con la perfusión déficits en tumores sólidos, que vinieron de rápido crecimiento tumoral y la vasculatura profundamente desorganizado [2]. Se ha sugerido que el microambiente tumoral es un entorno único para la progresión del tumor, lo que requiere adaptaciones genéticas en las células cancerosas para su posterior supervivencia y la proliferación. tensiones celular inducida por el microambiente, especialmente hipoxia [3], [4] y la reoxigenación [5], [6], puede provocar estos cambios genéticos.
Regiones de hipoxia son una característica común en los tumores sólidos. El oxígeno es un factor limitante debido al desequilibrio entre O
2 de suministro y el consumo [7]. El O
2 deficiencia se atribuye a vasculatures insuficientes y el agotamiento del oxígeno en las capas de células sucesivas distal a la luz del vaso; simultáneamente, hay un aumento en O
2 consumo debido a la elevada tasa metabólica de las células tumorales. Muchos estudios han informado de que los tumores hipóxicos eran más maligno y resistentes a la terapia, y por lo tanto tenía un peor pronóstico [8]. Este fenómeno se ha demostrado en muchos tipos de tumores [9], [10].
Por otra parte, la concentración de oxígeno dentro de una región hipóxica es muy variable. Desde vasculaturas de tumores son altamente ineficiente e inestable, las células rojas de la sangre fundente para las regiones hipóxicas, que resulta en la reperfusión o reoxigenación [11]. Reoxigenación no sólo aumenta el suministro de oxígeno sino que también induce el estrés oxidativo en las células. Este estrés oxidativo puede causar daño a macromoléculas celulares y conducir a una mayor inestabilidad genómica [12]. Si las células tumorales sobreviven después de la exposición a los insultos hipoxia /reoxigenación, pueden demostrar los aumentos de malignidad [13], el ADN exceso de amplificación [14], la resistencia a fármacos [15], y el potencial metastásico [16].
celular la adaptación a la hipoxia está bien documentada, pero se sabe poco acerca de los mecanismos de adaptación a la reoxigenación. Por lo tanto, hemos utilizado todo el genoma de microarrays de expresión para investigar la dinámica de perfiles de transcripción durante la reoxigenación en células MCF-7 de cáncer de mama. Nuestros resultados mostraron que los microarrays N-myc gen 1 reducido regulado (
NDRG1
) tenía la respuesta máxima después de la reoxigenación. Por lo tanto, nos hemos centrado en la investigación de su papel funcional en la reoxigenación. Los ensayos funcionales revelaron que la migración celular de las células de cáncer de mama durante la reoxigenación fue impulsado por la baja regulación de
NDRG1
. Por último, se propuso el modelo de regulación de
NDRG1
utilizando
in silico
análisis para una mayor investigación.
Resultados
Identificación de genes de respuesta a la reoxigenación
MCF-7 células de cáncer de mama humano se incubaron en condiciones de hipoxia (0,5% de O
2 concentración) para 24 h y luego se cambiaron a normoxia. Las células se recogieron, respectivamente, a 0 (control hipoxia), 1, 4, 8, 12 y 24 h después de la reoxigenación. Cada serie temporal se llevó a cabo de forma independiente por triplicado. Después de la extracción de ARN total, Illumina Humanos-6 v3 BeadChips se utilizaron para examinar la dinámica del perfil transcripcional sobre la reoxigenación. las señales de fondo ajustados se normalizaron mediante un algoritmo de normalización cuantil. Con el fin de identificar los genes expresados diferencialmente, se utilizó la prueba t de Student para examinar los niveles de expresión de cada punto de tiempo después de la reoxigenación frente a la de tiempo cero. Los genes de respuesta a la reoxigenación fueron seleccionados por la elección de los genes cuya media
P
-valor en un momento dado era & lt; 10
-4. En total, se identificaron 127 genes cuya transcripción niveles desviado significativamente desde el tiempo cero. Entre ellos, el 53,1% eran hasta reguladas y el 46,9% era el regulado en la reoxigenación. La mayoría de estos genes (n = 112) fueron identificados en un solo punto de tiempo, pero 13 fueron identificados en dos puntos de tiempo, y dos genes fueron identificados en más de dos puntos de tiempo.
A continuación, el análisis de componentes principales ( PCA) se aplicó a examinar la reproducibilidad entre los diferentes réplicas y los momentos en los que se activaron genes específicos. Como se muestra en la Figura 1a, las réplicas de un mismo punto de tiempo que suman ambos, lo que indica alta reproducibilidad de nuestros datos. Además, los diferentes puntos de tiempo distribuidos secuencialmente de acuerdo con la cantidad de tiempo bajo la reoxigenación. Los puntos de tiempo de 8 h, 12 h, 24 h y se agruparon juntos, lo que indica los patrones de expresión de genes similares en puntos de tiempo posteriores.
(a) análisis de componentes principales (PCA) de O
2-sensible genes en las células MCF7 durante 24 h de reoxigenación después de la hipoxia. Los ejes son los dos primeros componentes principales (CP), lo que puede explicar la mayor parte del perfil de expresión génica. Tres experimentos independientes se realizaron en cada punto de tiempo. Diferentes formas representan diferentes repeticiones; diferentes colores representan diferentes puntos de tiempo. (B) Número de O
2 genes que responden en cada punto de tiempo durante la reoxigenación. Tanto hasta regulada y reguladas por los genes se representan como una función del tiempo. Las barras negras indican el número de genes que se identificaron por primera vez, mientras que las barras grises indican el número de genes que se identificaron en puntos de tiempo anteriores. (C) los perfiles de expresión relativa de la O
2 genes que responden después de cambiar a la reoxigenación. Los valores de expresión de cada punto de tiempo se normalizaron a la de tiempo cero. La barra de escala a la izquierda denota 20 genes, y la barra de color en la parte inferior indica el grado de cambio de la expresión génica en relación con el tiempo cero. (D) la validación de RT-PCR cuantitativa de los diez primeros O
2 genes que responden a sus respectivos tiempos de respuesta máxima.
respuestas dinámicas de los perfiles de expresión génica en reoxigenación
para caracterizar cuantitativamente las O
2 genes que responden en cada momento durante la aclimatación a la reoxigenación, el análisis estadístico (
t de Student
) de cada punto en función del tiempo: 0 vez se aplicó para cada gen. El número de genes que fueron significativamente diferentes (
P
& lt; 0,0001) desde el control de la hipoxia se representan en la Figura 1b. Los números de O
2-genes de respuesta, incluidos los genes, tanto arriba y hacia abajo regulada, fueron de 0 a 1 h, 17 a las 4 h, 44 a las 8 h, 49 a las 12 h, y de 35 a 24 h. A las 8 h, sólo el 7% de los genes (3/44) se había identificado a las 4 horas, mientras que el 22% de los genes (11/49) a las 12 h se había identificado a los 4 u 8 horas. Por lo tanto, este resultado mostró que las respuestas transcripcionales se activaron entre 8 y 12 horas después de la reoxigenación, y luego disminuyó a las 24 h después de la reoxigenación.
Con el fin de comprender los perfiles de expresión de estos O
2 genes que responden , sus valores de expresión en cada punto de tiempo se normalizaron a la del tiempo 0 (Figura 1c). El mapa de calor mostró que, en general, la intensidad de los genes arriba-abajo o regulado aumentó a medida que las células permanecieron más tiempo en virtud de la reoxigenación. A continuación, se seleccionaron los 10 genes con los mayores cambios en la expresión sobre la reoxigenación para validar los resultados de microarrays utilizando RT-PCR cuantitativa. Como se muestra en la Figura 1d, los valores de expresión de estos genes, excepto uno, en los puntos de tiempo con la respuesta máxima fueron muy consistentes con los resultados de microarrays.
Pathway análisis de genes de respuesta a la reoxigenación
con el fin de entender las vías que estaban involucrados en la adaptación a la reoxigenación, la vía de análisis se ha realizado mediante la interacción de base de datos del NCI-Naturaleza Camino [17]. Entre los 127 genes identificados, vía de análisis reveló que, como se esperaba, el más significativamente (
P
& lt; 0,01) vía enriquecido era la red de factor de transcripción HIF-1-alfa, y la segunda vía más significativo fue validado objetivos de activación de la transcripción de c-myc (Tabla 1). Además, para investigar qué vía se activa en cada momento, vía análisis se realizaron por separado utilizando O
2 genes sensibles identificados en cada momento. Los resultados mostraron que los genes activados a las 8 h estaban involucrados en objetivos validados de activación de la transcripción de c-myc (Tabla 1). Los genes activados a las 12 h fueron principalmente involucrados en la red de factor de transcripción HIF-1 alfa, vía de señalización de la ceramida y la corregulación de la actividad del receptor de andrógenos.
El descenso de regulación de NDRG1 promueve la migración celular bajo la reoxigenación
Desde
NDRG1
, que está regulada por la vía de señalización MYC, tuvieron el mayor cambio en la expresión siguiente reoxigenación, y que estos genes fueron enriquecidos en reoxigenación objetivos validados de activación de la transcripción de c-myc, nos querido investigar más a fondo la respuesta de
NDRG1
de reoxigenación. No estaba claro si los
NDRG1
podría afectar a la capacidad metastásica de las células tumorales. Por lo tanto, se llevaron a cabo transwell ensayos para examinar la capacidad de migración de células MCF-7 en diferentes O
2 concentraciones. Como se muestra en la Figura 2, los niveles de transcripción de
NDRG1
se redujo significativamente en la reoxigenación (figura 2a), mientras que la capacidad de migración de las células MCF-7 aumentó significativamente (Figura 2b). Una transferencia de Western confirmó que C-MYC y N-MYC aumentaron, y NDRG1 disminuyó, en condiciones reoxigenación (figura 2c). Estos resultados indican que
NDRG1
puede afectar la migración de las células transformadas a través de la vía de señalización MYC.
(a) los niveles de expresión relativa de
NDRG1
bajo diferentes O
2 condiciones. Los niveles de mRNA de
NDRG1
medida por RT-PCR se normalizaron primero por 18S rRNA, y luego en comparación con aquellos en normoxia (*
P
& lt; 0,01). (B) la capacidad de migración relativa de las células MCF-7, bajo diferentes O
2 condiciones. Un ensayo transwell se utilizó para medir la migración de las células MCF-7. capacidad de migración se expresó como veces los cambios relativos a normoxia. (C) transferencias Western de HIF1α, C-MYC, N-MYC, y NDRG1 en hipoxia y reoxigenación. GAPDH fue el control de carga.
A continuación, desde el
NDRG1
se había reducido regulado en la reoxigenación, overexpressed
NDRG1 Hoteles en células MCF-7 para investigar su fisiológica función. Para confirmar la sobreexpresión, los niveles de ARNm y de proteína de NDRG1 fueron examinados por RT-PCR cuantitativa (Figura 3a) y transferencia Western (Figura 3b). Los niveles de transcripción y proteínas de NDRG1 en las células transfectadas con NDGR1 fueron significativamente mayores que los de las células transfectadas con el control de vector vacío. Las células MCF-7 transfectadas con
NDRG1
o vector vacío se inocularon en cultivos polarizados para una segunda ronda de ensayos de migración celular en la reoxigenación. Los resultados mostraron que la sobreexpresión de NDRG1 significativamente (
P
& lt; 0,001). Inhibió la migración de células en virtud de la reoxigenación (figura 3c)
(a) El análisis cuantitativo de RT-PCR de
NDRG1
sobreexpresión en células MCF-7. Los niveles de mRNA de
NDRG1
se normalizaron por 18s rRNA. EV: vector vacío. (B) la transferencia Western de NDRG1 sobreexpresado. La proteína de los lisados de células enteras se borró con anticuerpos específicos NDRG1, y ß-actina fue el control de carga. (C) la capacidad de migración relativa de células MCF-7 después de que sobreexpresan NDRG1. capacidad de migración se expresó como pliegue cambia en relación con las células MCF-7, bajo la reoxigenación.
Predicción de factores de transcripción Myc asociado y microRNAs relacionadas con la hipoxia-en la regulación de
NDRG1
con el fin de comprender los mecanismos que regulan
NDRG1
expresión, hemos utilizado herramientas bioinformáticas y un estudio de la literatura para predecir los motivos de unión de factores de transcripción Myc asociado en el promotor de
NDRG1
y la unión sitios de micro ARN relacionadas con la hipoxia-(miRNAs) en el 3'UTR. Usando MatInspector y los criterios establecidos en los Materiales y Métodos, se identificaron 170 motivos de unión de factores de transcripción en el promotor de
NDRG1
. Entre estos factores de transcripción, se seleccionaron los factores de transcripción Myc asociada que se había informado anteriormente. Estos factores de transcripción E2F incluyen activador-MYC, dedos de zinc MYC asociados, y los factores de unión E-box. Su vinculante motivo, la ubicación y la secuencia logotipo se enumeran en la Tabla S1. Estos resultados acusadas
NDRG1
podrían ser reguladas por estos factores de transcripción, aunque se justifican más experimentos.
Por último, se sabe que los niveles de expresión de miRNAs para cambiar en condiciones de hipoxia. Para investigar la posibilidad de
NDRG1 sobre ser sujetos a la regulación de los genes miARN bajo diferentes O
2 condiciones, los sitios de unión de miRNAs relacionadas con la hipoxia-Se realizaron búsquedas en el 3'UTR de
NDRG1
. Los criterios de búsqueda permite un desajuste, bamboleo, eliminación o brecha entre la segunda y séptima nucleótidos de los miRNAs. Como se muestra en la Tabla S2, seis sitios de unión para las regiones de semillas de cuatro miRNAs-miR-25, miR-93, miR-106a, y relacionadas con la hipoxia-miR-210-se identificaron en el 3 'UTR de
NDRG1
, lo que sugiere que
NDRG1
podría ser regulada por estos cuatro miRNAs. Este resultado podría utilizarse para diseñar experimentos que investigan la regulación post-transcripcional de
NDRG1 fotos: por miRNAs.
Discusión
Varios estudios han informado de que las células tumorales se incrementaron mostrar resistencia a los medicamentos y potencial metastático después de la exposición a los insultos hipoxia /reoxigenación [13], [15]. A pesar de las adaptaciones celulares a la hipoxia están bien documentados, se sabe poco sobre los mecanismos de adaptación a la reoxigenación. A continuación, se analizó la dinámica de la expresión de genes en todo el genoma durante la reoxigenación, y se encontró que los genes expresados diferencialmente estaban involucrados en la transcripción de la red factor de HIF-1 alfa y la activación transcripcional de c-myc.
En este estudio , análisis de componentes principales de los genes sensibles al oxígeno mostró una alta reproducibilidad a lo largo del tiempo. Basado en el número de O
2 genes que responden a diferentes puntos de tiempo, el periodo activo de la transcripción en respuesta a la reoxigenación parece ser entre 8 y 12 horas. Por otra parte, la vía de análisis reveló que los O
2 genes que responden a las 12 horas estaban involucrados en la red de factor de transcripción HIF-1 alfa, la vía de señalización de la ceramida y la corregulación de la actividad del receptor de andrógenos. No es de extrañar que la red de factor de transcripción HIF-1-alfa estaba involucrado en la reoxigenación, ya que se ha informado en una situación similar, es decir, la irradiación. Después de la radioterapia, la reoxigenación tumor conduce a la acumulación nuclear de HIF-1 en respuesta a especies reactivas de oxígeno [18]. Uno de los genes, es decir,
NDRG1
, en la red de factor de transcripción HIF-1 alfa llamar nuestra atención porque tenía el mayor cambio en la expresión siguiente reoxigenación.
NDRG1
se expresa de forma ubicua en los tejidos estimulados bajo una amplia variedad de tensiones y condiciones reguladoras del crecimiento de células, tales como la hipoxia [19], [20], el daño del ADN [21], la diferenciación celular [22], [23], [24], la proliferación y el crecimiento de detención [23]. Se ha informado de que
NDRG1
es fuertemente regulados hasta en condiciones de hipoxia. Un oncogénica y el papel de
promotor de tumores NDRG1
También se ha informado, ya que se sobreexpresa en diversos cánceres humanos, incluyendo los pulmones, el cerebro, la piel, los riñones y los cánceres de mama [25], [26]. Sin embargo,
NDRG1
funcionó como un supresor de metástasis en el cáncer de próstata y de colon [24], [27]. Los papeles contradictorios de
NDRG1
en el cáncer que queda por aclararse, aunque podrían ser explicadas por sus múltiples localizaciones celulares y la regulación compleja por diversos factores fisiológicos y patológicos. Recientemente, Toffoli et al. indicado que
NDRG1
puede ser inducido en condiciones de hipoxia intermitente para promover la migración celular [28]. Varios estudios también sugieren que
NDRG1
es inducida por la hipoxia y derivados de las metástasis, pero el mecanismo de regulación de
NDRG1
sigue siendo difícil de alcanzar y su función en la reoxigenación todavía no está claro.
NDRG1
tenía la respuesta transcripcional máxima a la reoxigenación en este estudio, lo que nos pareció ampliarse la investigación. Hemos observado que la expresión de
NDRG1
tenía una relación inversa con la migración celular tras la reoxigenación. Estos resultados implican NDRG1 como un supresor de la metástasis, en consonancia con las conclusiones de Maruyama et al. [8]. La discrepancia entre nuestros resultados y los de Toffoli et al. [28] puede ser debido a diferentes tipos de células y los parámetros experimentales.
Con el fin de comprender mejor los posibles mecanismos de regulación de
NDRG1
bajo la reoxigenación,
in silico
análisis de la secuencia se realizó para predecir ADN motivos de unión a factores de transcripción en el promotor de
NDRG1
. Entre los motivos de unión MYC-asociado identificadas, las proteínas dedo de zinc, E2F-MYC activador /reguladores del ciclo celular, y factores podrían afectar a la expresión de genes [29] vinculante E-box, [30], [31], [32]. Estos factores de transcripción candidato se pueden validar aún más mediante la construcción de diversos promotores utilizando ensayos de luciferasa. Además, los niveles de expresión de varios miRNAs han demostrado cambiar en la hipoxia [33], [34], [35]. En particular, miR-210 se induce durante la hipoxia a través de un mecanismo de HIF1-dependiente, y la expresión de miR-210 tenía una fuerte correlación con la expresión de
NDRG1
[34]. Por lo tanto, la hipótesis de que la expresión de
NDRG1
también estaba regulado por miRNAs. De hecho, se identificaron los puntos de unión de las regiones de semillas de cuatro miRNAs relacionadas con la hipoxia-(miR-106a, miR-93, miR-25 y miR-210) en el 3'UTR de
NDRG1
. Por lo tanto, hemos propuesto un modelo de trabajo basado en la predicción bioinformáticas y estudio de la bibliografía (Figura 4). Este modelo proporciona un marco para futuros experimentos biológicos
TSS:. La transcripción de inicio del sitio. caja blanca: sitio en cadena + de unión al factor de transcripción; cuadro negro: sitio en la unión del factor de transcripción - cadena; caja gris: miARN sitio de unión
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
línea celular de cáncer de mama humano se obtuvo MCF-7 de bio-Recogida y Centro de Investigación (. Hsiuchu, Taiwán). Células MCF-7 se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) que contiene bicarbonato de sodio 1,5 g /L suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (Hyclone, Gibco) y con 1% solución de antibiótico (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Para los cultivos de hipoxia, las células se incubaron en una cámara de hipoxia (in vivo
2-200, Ruskinn Technology, Leeds, Reino Unido) durante 24 h con una mezcla de gas que contiene 5% de CO
2, 95% N
2 a 37 ° C. La concentración de oxígeno en la cámara de hipoxia se mantuvo a 0,5%. Después de 24 h de crecimiento hipóxica, las células se incubaron en un incubador humidificado bien con 5% de CO
2 y 95% de aire ambiente a 37 ° C. Seis muestras se recogieron, respectivamente, a 0, 1, 4, 8, 12 y 24 h después de la reoxigenación. Las células se lavaron con PBS frío, flash-congelado en N líquido
2, y se almacenaron a -80 ° C para su posterior aislamiento de ARN. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado.
ARN extracción
El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se purificó mediante el kit de limpieza RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. concentración de ARN y la calidad se determinaron usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), que calcula un número de integridad del ARN (RIN). El ARN total (500 ng) con A
260 /A
280 = 1,7-2,1 y Rin & gt;. 7.0 se utilizaron para sintetizar la primera cadena de ADNc mediante transcripción inversa
expresión de todo el genoma humano Illumina BeadChips
el ARN total fue preparado con el cebador T7 Oligo (dT) y se amplificó por Illumina TotalPre de amplificación del ARN Kit (Ambion Inc., Austin, TX) para sintetizar el ADNc que contiene una secuencia de promotor T7. Después de la primera síntesis de ADNc, segunda cadena de ADNc se sintetizó mediante la conversión del cDNA de cadena sencilla en una plantilla de ADN de doble cadena (dsDNA) para la transcripción. La reacción empleada DNA polimerasa y RNasa H a degradan simultáneamente el ARN y sintetizar cDNA de la segunda cadena. El cDNA de doble cadena a continuación, se sometió a un proceso de limpieza para eliminar el exceso de RNA, cebadores, enzimas, y sales que inhibir la transcripción in vitro. A partir de entonces, la transcripción in vitro se llevó a cabo usando el ADNc de doble cadena como plantilla y T7 RNA polimerasa para sintetizar múltiples copias de cRNA biotinilado. Después de la amplificación, el cRNA se mezcló con un volumen igual de tampón de hibridación y se hibridó a Illumina Human-6 v3 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) a 58 ° C durante 16 h. Después de la hibridación, BeadChip se lavó y se tiñó con tinte de estreptavidina-Cy3. La intensidad de la fluorescencia de la perla fue detectado por el lector de BeadArray Illumina, y los resultados se analizaron usando software v3.1 BeadStudio. Todos los datos son MIAME compatible y que los datos en bruto ha sido depositado en una base de datos compatible con MIAME. microarrays de datos de este estudio han sido presentados a la GEO (Expresión Génica Omnibus) de base de datos (número de acceso GSE30019).
La minería de datos y el análisis estadístico
Después de la exploración, los datos de intensidad de iluminación Human- 6 v3 BeadChips se analizaron mediante el software comercial Partek® (Partek, St. Charles, MO) para el análisis de la expresión de ARNm. señales de fondo ajustada se normalizaron mediante un algoritmo de cuantil normalización, que normaliza las intensidades de la sonda sobre la base de la distribución de intensidad entre todas las diapositivas. Después de la normalización, análisis de componentes principales (PCA), que reduce los datos dimensionales de alta en un gráfico 2D, se utilizó para evaluar la similitud de los perfiles de expresión génica. Con el fin de identificar los genes expresados diferencialmente, pruebas t examinaron los niveles de expresión de todos los puntos de tiempo después de la reoxigenación en comparación con la del tiempo se utilizaron cero. Los genes cuya
P-valor
de tres repeticiones en uno o más puntos de tiempo fue & lt; 10
-4 fueron identificados y se define como O genes
2-sensibles. Se utilizó el programa Génesis [36] para generar una representación visual de los perfiles de expresión. Por otra parte, el NCI-Naturaleza Camino de base de datos de interacción [17] se aplicó para identificar las funciones biológicas de los genes expresados diferencialmente.
La sobreexpresión de
NDRG1
en las células MCF-7
La humana
se insertó NDRG1
gen entre el
EcoR I
y
BamH I
sitios de las pcDNA3.1 vector de expresión eucariota + (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 células /NDRG1 fueron creados mediante transfección de células MCF-7 con pcDNA3.1 + codifica el
NDRG1
gen usando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). células /NDRG1 MCF-7 a continuación, fueron seleccionados por 200 g /ml de zeocina durante dos semanas. La expresión de mRNA
NDRG1
fue examinado por cuantitativa en tiempo real PCR, y expresión de proteínas NDRG1 fue examinado por Western Blot.
Quantitative PCR de transcripción inversa
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa del ARN total se realizó con una alta capacidad de cDNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando cebadores aleatorios y 1 g ARN total como plantilla. La mezcla de reacción se incubó a 25 ° C durante 10 min, 37 ° C durante 2 h y 85 ° C durante 5 s. PCR en tiempo real se detectó mediante Verde SYBR (Sigma) y se realizó usando el ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones se realizaron con el siguiente programa: 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 seg y 1 min de hibridando y alargando a 60 ° C. Para cada muestra de ADNc, un control interno, 18S rRNA, también fue medida por la sonda SYBR Green para asegurar cantidades comparables de cDNA en todos los pocillos. expresión relativa de NDRG1 comparación con 18S rRNA de cada muestra se calculó (△ Ct) y la expresión relativa de NDRG1 entre las muestras se determinó mediante el cálculo de la diferencia de △ Ct entre las muestras (△△ Ct). Todas las mediciones se realizaron por triplicado (5 ng de ARN total por pocillo).
blotting
Extractos de células enteras Western se prepararon usando tampón de lisis RIPA suplementado con 1% Nonidet P-40 (NP 40) y Mini inhibidor de la proteasa cóctel comprimidos (Roche, Mannheim, Alemania). Los restos celulares se recogieron por centrifugación a 8000 x g a 4 ° C durante 20 minutos. La concentración de proteína se midió por el método del ácido bicinconínico (ensayo BCA), y 20 a 50 g de proteína se cargaron en un gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida desnaturalizante 10%. Después de la electroforesis, la proteína se transfirió electroforéticamente a membranas de PVDF durante la noche a 55 mA. Las membranas se bloquearon con Tris-solución salina tamponada con Tween-20 (TBST) con 5% de leche en polvo no grasa a temperatura ambiente durante una hora. La detección de proteínas específicas se llevó a cabo mediante el sondeo membranas con anticuerpos primarios en TBS con 0,1% de Tween-20 durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Estos anticuerpos incluido NDRG1 (AbCam, 1:500), HIF1α (Millipore, 1:1000), C-MYC (Millipore, 1:1000), N-MYC (Millipore, 1:250), y GAPDH de control de carga (GeneTex, 1:10000) o β-actina (1:5000). Después de la incubación con los anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante de IgG secundarios (1:5000), la inmunorreactividad se visualizó mediante quimioluminiscencia potenciada con luminol Reactivo (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EE.UU.).
ensayo de migración celular
migración ensayos se llevaron a cabo utilizando 24 pocillos transwell cámaras de migración (Corning, Corning, Nueva York, EE.UU.) con membranas de polietileno de 8 micras de tamaño de poro. Las células se mueren de inanición primera 24 h y se recogieron por Accutase (PAA Laboratories, Linz, Austria). Las cámaras superiores se inocularon con 5 × 10
4 células bien en 0,1 ml de solución de células DMEM /libre de suero, y las cámaras inferiores se llenaron con 0,6 ml de DMEM que contiene 10% de FBS como quimioatrayente. Las células fueron autorizados a emigrar durante 24 horas a 37 ° C. Para la medición de las células migradas, 2 mg /ml calceína-AM (Trevigen, Gaithersburg, MD, EE.UU.) /Se añadió solución de disociación celular (Trevigen) en la cámara inferior. Después de incubación a 37 ° C durante 60 min, se eliminaron los insertos y placas se leyeron a 485 nm para la excitación y 520 nm para la emisión. El número de células se calcularon mediante la comparación de la absorbancia a la curva estándar. Las células MCF-7 transfectadas con el vector vacío se utilizaron como control para cada experimento.
in silico
análisis de
NDRG1
Para identificar el potencial de unión motivos de factores de transcripción Myc asociado en el promotor de
NDRG1
, se utilizó el programa MatInspector [37]. Dos grupos predefinidos de factores de transcripción, incluyendo los elementos básicos promotor general y de vertebrados, se analizaron en la versión de biblioteca matriz 8.3 usando los siguientes parámetros: (1) las familias de la matriz fueron agrupados en lugar de secuencias individuales; (2) Núcleo de similitud fue de al menos 0,75; (3) matriz de similitud se optimizó. La región central se define como cuatro nucleótidos consecutivos con los puntajes más altos de conservación [38]. La similitud de núcleo y la matriz se calcula comparando la secuencia de consulta con el nucleótido más conservada en la matriz. Después de identificar los potenciales candidatos de factor de transcripción, los factores de transcripción Myc asociado se seleccionaron adicionalmente en base a un estudio de la literatura.
Para la identificación de los puntos de unión de los miRNAs relacionadas con la hipoxia-, el
NDRG1 página 3 ' UTR secuencia se descargó desde el navegador del UCSC Genoma (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway; GRCh37 montaje /hg19), y se alinea con los miRNAs relacionadas con la hipoxia. Los criterios para la búsqueda de sitios de unión de la región de semillas estaban permitiendo un desajuste, bamboleo, eliminación o brecha entre la segunda y séptima nucleótidos de miRNAs relacionadas con la hipoxia.
Apoyo a la Información sobre Table S1.