Extracto
Antecedentes
BORIS
/
CTCFL
es un paralogue de
CTCF
, el principal regulador epigenético de los vertebrados genomas. BORIS normalmente se expresa sólo en las células germinales, pero se activa de forma aberrante en numerosos tipos de cáncer. Mientras que los estudios recientes demostraron que Boris es un activador transcripcional de los genes prueba específica, poco se sabe en general de sus funciones biológicas y moleculares.
Metodología /Principales conclusiones
Aquí mostramos que
BORIS
se expresa como 23 isoformas en las células de la línea germinal y el cáncer. Las isoformas se componen de N- alternativa y C-terminales en combinación con un número variable de dedos de zinc (ZF) en el dominio de unión a ADN. Los patrones de
BORIS
isoforma expresión son distintos en las células germinales y el cáncer. isoforma expresión se activa mediante regulación a la baja de
CTCF
, upregulated de reducción en la metilación CpG causada por la inactivación de DNMT1 o DNMT3b, y reprimida por la activación de
p53
. Los estudios de isoformas expresadas ectópica mostraron que todos están traducidos y localizado en el núcleo. Utilizando el sulfotransferasa cerebroside prueba específica (
CST)
promotor y el
IGF-2 /H19
región de control de impresión (ICR), se demostró que la unión de las isoformas de ADN BORIS objetivos
en vitro
es sensible a la metilación y depende del número y la específica composición de ZF. La capacidad de unirse al ADN diana y la presencia de un terminal específico largo amino (N258) en diferentes isoformas son necesarias y suficientes para activar
CST
transcripción. Los análisis comparativo de secuencias reveló una explosión evolutiva de los mamíferos con una fuerte conservación de BORIS isoproteinas entre los primates.
Conclusiones
El extenso repertorio de corte y empalme
BORIS
variantes en los seres humanos que confieren ADN distinta propiedades de unión y de activación transcripcional, y sus patrones diferenciales de expresión entre las células germinales y las células neoplásicas sugerir que el gen está implicado en una serie de aspectos funcionalmente importantes tanto de la gametogénesis normal y el desarrollo del cáncer. Además, una explosión en la diversificación de isoforma puede ser evolutivamente ligada a aspectos únicos de la especiación primate
Visto:. Pugacheva EM, Suzuki T, Paquete de SD, Kosaka-Suzuki N, Yoon J, Vostrov AA, et al. (2010) La complejidad estructural del humano
BORIS
génica en gametogénesis y el cáncer. PLoS ONE 5 (11): e13872. doi: 10.1371 /journal.pone.0013872
Editor: Sebastian D. Fugmann, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2010; Aceptado: 11 Octubre 2010; Publicado: 8 de Noviembre, 2010
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramural del NIAID y por la subvención NIH intramural de la Oficina de investigación del SIDA y de AVS DL los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
BORIS gratis (hermano del regulador de los sitios marcados) es un paralog de la multifuncional
CTCF
gen, que está implicado en la lectura de las marcas epigenéticas, la activación transcripcional de genes y la represión, la inactivación del cromosoma X, formación de bucle a través de la cromatina en la dimerización y organización global del genoma en tres dimensiones [1], [2], [3], [4], [5]. Mientras que las dos proteínas comparten un dominio de unión de ADN central 11 con dedos de zinc (ZF), tienen distinto amino- y carboxi-terminales [2], [6]. En los tejidos normales, los dos genes parálogos muestran patrones de expresión que se excluyen mutuamente:
BORIS
ARNm es abundante en las células germinales masculinas, sobre todo en los espermatocitos primarios y espermátidas redondas, donde
CTCF
, que se expresa de forma ubicua en las células somáticas, se reprime [2]. BORIS actúa como activador transcripcional de varios genes diana testículo-específica durante la espermatogénesis, en tanto que CTCF suprime los mismos objetivos en las células somáticas [7], [8], [9]. En las células germinales, BORIS se sugiere que participen en la puesta a cero de la impronta en el
IGF-2 /H19
región de control de impresión (ICR) [10]. Por el contrario, CTCF es conocido el lector y protector de
IGF-2 /H19
marcas de impronta en las células somáticas [11], [12], [13], [14], [15]. La segregación de
BORIS
y
CTCF
expresión en diferentes tipos de células en mamíferos está estrechamente controlada. Normalmente, CTCF, p53, y suprimen la metilación CpG
BORIS
transcripción en células somáticas, impedir de forma eficaz su expresión a las células germinales testiculares [8], [16], donde la ausencia de CTCF [2] y varias oleadas de desmetilación de todo el genoma crear las condiciones para
BORIS
activación.
BORIS
se activa de forma aberrante en muchos tipos de células cancerosas, su expresión coincidiendo con la pérdida de metilación de CpG, el primer cambio epigenético identificado en células de cáncer [2], [6], [17]. la expresión aberrante de
BORIS
en células de cáncer probablemente es el resultado de una competición entre las proteínas Boris y CTCF por la unión al ADN de unión CTCF sitios diana (CTSes). BORIS puede interferir con las funciones de CTCF en células de cáncer no sólo en virtud de tener la idéntica ZF dominio de unión a ADN y la superposición de especificidad de unión, pero también debido a su amino- distinta y carboxi-terminales que probablemente confieren un conjunto discreto de funciones moleculares [2] . De hecho, tanto CTCF y BORIS se unen a la
MAGE A1
promotor, pero con resultados opuestos: mientras que CTCF actúa como un represor transcripcional, funciones BORIS como un activador [8]. Un estudio reciente demostró también que Boris y CTCF realizan funciones diferentes de la transcripción tras la unión al promotor de ratón prueba específica de
CST
variante de empalme [9]. En conclusión, aunque las funciones moleculares de BORIS en el cáncer aún no se han estudiado en profundidad, aberrante co-expresión de
CTCF
y
BORIS
es una de las firmas de expresión génica característico de muchos tipos de cáncer [6 ].
estudios anteriores demostraron que la aparición evolutiva de los
BORIS Hoteles en amniotas se produjo antes de la divergencia de los reptiles y mamíferos y podría ser atribuido a una duplicación inicial de la totalidad de
CTCF
secuencia [18]. Mientras BORIS se expresa ampliamente en los reptiles y monotremas, se demostró que la expresión-gónadas específico en los marsupiales y los euterios, lo que indica que se convirtió en BORIS funcionalmente especializada durante la evolución de los mamíferos en concierto con la evolución de la impronta genómica [18]. Mientras que
CTCF
es altamente conservadas entre Drosophila para los seres humanos [18], [19], [20],
BORIS
secuencias codificantes y no codificantes son de plástico evolutivamente [18]. De hecho, una comparación de los extremos amino y carboxi-terminales del ser humano
BORIS Chat con ortólogos en otras especies revela relativamente baja similitud, 32,3% y 23,7%, respectivamente, mientras que la similitud humana correspondiente de
CTCF
con otros ortólogos es 90,1% y 80,7%, respectivamente. Sin embargo, la región BORIS ZF tiene 80,4% de identidad con sus ortólogos, similar a la conservación 99,5% para CTCF ZF [18]. La rápida evolución de
BORIS
no se limita a las secuencias de codificación de proteínas. Sorprendentemente, la estructura del locus en su conjunto es notablemente diferente, incluso entre los ratones y los seres humanos, lo que puede sugerir un conjunto especializado de funciones y /o isoformas de empalme. El humano
BORIS
gen se extiende por más de 29 kb en 20q13 y se compone de 11 exones, 10 de las cuales son la codificación [2]. Esto puede permitir la generación de un número de diferentes isoformas de corte y empalme alternativo. Evolutivamente, splicing alternativo es el mecanismo más utilizado para el aumento de la capacidad de codificación de las transcripciones de ARNm para permitir la generación de diferentes isoformas de la proteína con actividades distintas.
La primera evidencia de la alternativa
BORIS
transcripciones vino de la reciente demostración de que la humana
BORIS
se expresa a partir de al menos tres promotores alternativos que utilizan cinco distintas 5 'UTRs [16]. En el presente estudio, hemos caracterizado 23
BORIS
variantes de empalme con distintos perfiles de expresión en células de la línea germinal y cáncer normales, mientras que también exhiben actividades de unión de ADN diferencial y variando las propiedades de la transcripción. Por lo tanto,
BORIS
se expresa como un repertorio de transcripciones y proteínas, lo que indica que splicing alternativo genera un mecanismo complejo para la función mediada por BORIS en las células de la línea germinal y el cáncer.
Resultados
múltiple
BORIS
transcripciones se expresan en el testículo humano, las células madre embrionarias y las líneas celulares de diferentes tipos de cánceres
Hemos demostrado que la expresión de
BORIS
se limita a los testículos tejidos y células cancerosas, con expresión dependientes del estado de metilación de CpG alternativa
BORIS
promotores [8], [16]. En el análisis de
CTCF
y
BORIS
expresión en testículo humano, las células madre embrionarias (ES), y varias líneas celulares de cáncer por RT-PCR, hemos sido capaces de amplificar la longitud completa ZF- regiones de codificación de ambos genes. Sólo una única banda de PCR específica para el
CTCF
dominio ZF se detectó en todos los tipos de células examinadas; Sin embargo, varias bandas de PCR fueron generados por los cebadores que amplifican el
BORIS
región correspondiente al dominio ZF (Fig. 1A). Análisis de secuencias clonadas productos
BORIS
PCR identificado una serie de transcripciones alternativas con diferentes combinaciones de exones ZF que se generaron debido a la utilización de los sitios de empalme alternativo (fig. 1A). La abundancia y distribución de
BORIS Versión taquigráfica variantes diferían entre las líneas celulares de cáncer y en los testículos, lo que sugiere diferentes mecanismos de regulación de los
BORIS
de genes en células de la línea germinal y cáncer normales.
(a) ARN total de las líneas celulares indicadas y testículos de tejido se analizaron por RT-PCR utilizando cebadores diseñados para amplificar los de larga duración
CTCF Opiniones y
Boris
dominios ZFS. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla S1. Nested PCR se realizó con 20 y 35 ciclos para las rondas primera y segunda, respectivamente. Las fuentes de ARN se muestran en la parte superior de cada gel. Las flechas apuntan a la única
CTCF Versión taquigráfica y múltiples
Boris
transcripciones alternativas. (B) Estrategia 3 'RLM-RACE para la clonación de corte y empalme alternativo
BORIS
formas. Tres
se muestran BORIS
promotores alternativos y 12 exones con secuencias no codificantes (cajas blancas) o secuencias de codificación (cajas grises). El ARN total de testículo humano adulto y la línea celular K562 se procesó con el kit GeneRacer PCR para la amplificación de ADNc de longitud completa. La primera ronda de PCR se realizó con tres genes específicos hacia adelante (SGP) de los cebadores A, B, y C que fueron diseñados para identificar ARNm expresado a partir alternativa correspondiente
BORIS
promotores A, B o C, respectivamente. El 'GeneRacer cebador 3 adjunta a la cola poli A se utilizó como cebador inverso. l l de la mezcla de PCR de primera ronda se utilizó como plantilla para realizar PCR anidada con tres genes específicos hacia adelante anidada (NGSP) cebadores A1, B1, C1 y. (C) 3 'RLM-RACE se realizó en testículo humano y la línea celular K562. Múltiple
se detectaron BORIS
transcripciones en ambas muestras. productos de PCR de la PCR anidada se muestran separados en 1% geles de agarosa. M es el marcador de tamaño.
Sabiendo que CpG hipometilación está involucrado en
BORIS
activación [2], [8], [16], se compararon
BORIS
expresión en la línea celular de cáncer de colon HCT116 a las células HCT116 tratados con 5Aza-dC, y para HCT116 que lleva una doble knockout (DKO) de
DNMT3b
y
DNMT1
[21]. Una disminución dramática en la metilación de CpG en HCT116 DKO y células HCT116 tratados con 5Aza-dC, se ha descrito previamente [21], en correlación con la aparición de múltiples
BORIS
específicos de productos de RT-PCR (Fig. 1A), que estaban ausentes en la línea celular HCT116 los padres. Curiosamente, se encontró que las células madre embrionarias humanas para expresar al menos dos alternativas
BORIS
transcripciones, lo que confirma
BORIS
expresión en líneas de células madre embrionarias como se ha demostrado previamente por inmunofluorescencia [22]. Por consiguiente, concluimos que mientras
CTCF
se expresa como un solo transcrito en testículo humano y los cánceres,
BORIS
se expresa como múltiples isoformas en el testículo, células ES y en líneas celulares de cáncer, específicamente en células con aumento de la hipometilación del ADN.
Veintitrés corte y empalme alternativo
BORIS
isoformas se expresan en los testículos y en las células cancerosas
motivada por nuestra identificación previa de cinco alternativa 5'-UTR empalme
BORIS
variantes genera a partir de tres alternativas
BORIS
promotores (a, B y C) [16], se llevó a cabo una pantalla de larga duración corte y empalme alternativo
Boris
transcripciones en el testículo humano y la línea celular K562 cáncer, las células con los más altos niveles de
BORIS
expresión. Para el aislamiento de larga duración
BORIS
transcripciones alternativa, se utilizó el enfoque 3'-RLM-RACE se muestra en la Figura 1B. Estamos amplificado múltiples
productos BORIS
RT-PCR que luego fueron clonados y secuenciados (Fig. 1C). A partir de esto, se identificaron 19
Boris
variantes de empalme hasta ahora desconocidas (Fig. 2). Las dos principales fuentes de heterogeneidad en
BORIS
ARNm fueron el uso de promotores alternativos y sitios de empalme. También se observó el uso diferencial de los distintos extremos 5 'y 3' UTRs, así como los marcos de traducción alternativos en las regiones amino- y carboxi-terminal de codificación. La alineación de la
BORIS
secuencia genómica con otras transcripciones revelado que las fronteras exón-intrón tenían secuencias del sitio de empalme clásicos (Tabla S4). La mayor parte de la alternativa
BORIS
transcripciones poseían una cola poli situado a 20-30 pb aguas abajo de la señal de poliadenilación canónica, AAUAAA (Archivo S1), lo que indica que
BORIS
isoformas alcanzaron la etapa de expresión madura mRNAs.
(a) ilustración esquemática de la
BORIS
gen con tres promotores alternativos y dieciséis exones utilizados para la generación de 23 mRNAs de isoformas. Exones tamaños se muestran en virtud del régimen, con el número mínimo y máximo de nucleótidos de los exones alternativos. Los codones de inicio y parada para los ORF se indican como ATG y de parada, respectivamente. El primer
BORIS Versión taquigráfica representa el clonado originalmente
BORIS
forma, designado aquí como
B0
; el
BORIS
transcripciones muestran a continuación son nuevas isoformas clonadas. A la izquierda están los nombres de
BORIS
isoformas, que corresponden a la representación esquemática de las transcripciones dadas. A la derecha, los seis
BORIS
subfamilias, divididos sobre la base de 3 'similares, se indican. Las líneas rojas y azules en la parte superior o inferior de la representación esquemática de las isoformas muestran las ubicaciones de sondas Taqman. las regiones no traducidas están representadas por los rectángulos abiertos. Los intrones (líneas delgadas) no se muestran a escala exacta. (B) El empalme alternativo crea una nueva ZF en el
C6
isoforma. La comparación de secuencias de aminoácidos de ZF 4 de
B0 Opiniones y nueva alternativa ZF 4/9 de
C6, España que combina la primera mitad de ZF 4 y la segunda mitad de ZF 9. (C) splicing alternativo crea un nuevo separador de codificación entre ZF 5 y 6 en
A3
isoforma.
El
BORIS
isoformas fueron categorizados de acuerdo al uso del promotor (Fig. 2A ). Isoformas expulsados de promotor incluyen un
BORIS A1
,
A2
,
A3, A4, A5
, y
A6
. En comparación con el descrito originalmente
BORIS Versión taquigráfica [2], que ahora se designa como el
BORIS B0
isoforma, isoformas
A1
y
A2 contenía
alternativa 5 'UTR, pero codifican el mismo polipéptido BORIS (Fig. 2A, el cuadro S3). Isoforma
A3
tenido varias nuevas características que lo distinguían de
B0
incluyendo un largo no codificante 5 'UTR y la exclusión del exón 6 debido a splicing alternativo. Esto dio lugar a la presencia de sólo 9 ZFS, en lugar de la 11 de
BORIS B0
, sino que también produjo un nuevo espaciador largo entre ZF5 y ZF8 (Fig. 2A, C). Para isoformas
A4
y
C2
, que tanto codifican el mismo polipéptido, ORF continuará en el intrón 4 hasta un codón de parada alternativa dio como resultado el truncamiento del dominio ZF, mientras que la producción de un extremo COOH alternativa . Isoformas
A5
y
A6
tanto codificados 10 ZF completo y la mitad de ZF11, que se empalmados alternativamente desde el exón 8 a nuevos exones 9a o 9a (1), respectivamente, lo que resulta en dos carboxi alternativa -termini. La isoforma
B1
tiene los mismos 10 exones de codificación como el
BORIS B0
prototipo, pero poseía un exón adicional 11, que codifica una alternativa carboxi-terminal. Además, algunas isoformas tenían amino-terminales alternativa debido a la utilización de diferentes codones de inicio, que resultan del corte y empalme alternativo del exón Eb al exón 2 (en
B3
y
B4
) o para exón 3 (en
B2, B5, B6, B7
).
Lo más sorprendentemente, sólo 7 de 23
BORIS
isoformas codificadas de longitud completa de ADN 11 ZF vinculante dominio, con el número de ZF en las otras isoformas que van de 1 a 10 (S1 archivo, Tabla S3). Como se muestra por los siguientes ejemplos, las reducciones en el número de ZF como resultado de la utilización de los sitios de empalme alternativos y codones de parada. La isoforma
C5
sólo tenía una ZF y un carboxi-terminal alternativa resultante del corte y empalme de la mitad del exón 3 al exón 10b. Mientras isoforma
C8
contenían los 11 exones, la presencia de un exón 6a adicional con un codón de parada en marco resultó en sólo seis ZFS. Sorprendentemente, corte y empalme del exón 4 al exón 8 en isoforma
C6
creado un nuevo ZF híbrido compuesto por medio de ZF 4 y un medio de ZF 9. Esto plantea la posibilidad de que el nuevo ZF podía conferir nuevo ADN propiedades de unión a esta isoforma (Fig. 2B). Por último, algunos exones alternativos, como 5a en
B6, B7, C7
, y
C9
, retienen secuencias intrónicas que incorporaron codones de terminación prematuros, y por lo tanto no pueden producir la proteína estable debido a la mRNA decadencia (NMD) y la vía mediada por el antisentido, una posibilidad que debe ser verificado experimentalmente.
rasgos característicos de
BORIS
variantes alternativas y su conservación evolutiva en los seres humanos y los primates no humanos
el 23
BORIS
variantes de corte y empalme de ARNm tienen el potencial para codificar 17 polipéptidos diferentes que designamos como proteínas isoforma BORIS 1 a 17. para categorizar las isoformas, los extremos amino alternativo y carboxi fueron nombrados de acuerdo con el número de residuos de aminoácidos aguas arriba y aguas abajo del dominio ZF, respectivamente (Tabla S3). Por ejemplo, N258 denota un amino-terminal con residuos de ácido 258 aminoácidos aguas arriba del dominio ZF que está codificado en muchos
BORIS
isoformas incluyendo
B0, B1, A3, A4, A5, A6, C3, C4, C5, C6, C7 /C9
y
C8
. En particular, N24 y N53, versiones truncadas de N258, no tienen diferencias de aminoácidos con N258 dentro de los 24 y 53 aminoácidos en el sentido de ZF1. Once alternativa carboxi-terminales que se encuentra en isoformas distintas se designan como "C", con sus números correspondientes al número de los codones corriente abajo de la última ZF. Por ejemplo,
B1
tiene C132,
C3
tiene C97,
C5
tiene C53, etc. (Archivo S1, Tabla S3).
Para búsqueda de homología con las proteínas o dominios conocidos, los once alternativa única C-terminales se compararon mediante BLAST de las secuencias de aminoácidos de GenBank. Sólo una alternativa carboxi-terminal, C97, mostró un grado significativo de similitud con varias proteínas no BORIS, incluyendo varios implicados en los procesos de transcripción o traducción (Fig. S2). Este dominio putativo recientemente reconocido es un componente previamente no de un dominio helicasa-como conocido (COG0553). Más análisis de 3'UTRs alternativas de algunas isoformas revelaron la presencia de elementos de ADN repetitivos específicos. Por ejemplo, una parte de la 3'UTR de la
B6
y
C7
isoformas pertenece a un consenso Alu-J. El 3'UTR de la isoforma
B1
también es altamente repetitivo en los genomas de humanos y primates. Isoformas
C3, B2, B3, C4, C5
, y
C8
tiene el elemento de primates específicos de ADN repetitivo, MER1 [23] en sus 3'UTRs.
el hecho de que
BORIS
isoformas se conservan en otras especies sugiere su importancia biológica. Por ejemplo, todas las características del ser humano
BORIS
isoformas están muy conservadas en los monos
Pan troglodytes
y
Macaca mullata, España con sitios de empalme conservadas y los correspondientes identidades de proteínas que van desde 96 % a 100% y de 53% a 97%, respectivamente (Fig. 3). Entre los C-terminales más conservada son: C95 (con identidades de 99% y 89% en chimpancés y macacos, respectivamente), C97 (97% y 91%), C68 (98% y 96%), C35 (100% y 97%) y C24 (96% y 96%). C132 está altamente conservada en el chimpancé (96%), pero menos que en macacos (53%). Aunque la adaptación de
Boris
isoformas humanas con el locus genómico de ratón descubierto varios ratón putativa BORIS carboxi (C95, C90, C35, C34 y), los niveles de homología fueron bastante bajas, que van del 9% al 42% . Esto sugiere que el ritmo de
BORIS
la evolución de los mamíferos ha sido bastante rápida y la complejidad de
BORIS
locus probable que coincidió con la aparición de los primates. El hecho de que el ratón
Boris
locus no tiene el mismo rango de isoformas como seres humanos u otros primates pueden estar relacionados con la evolución de primates específicos de secuencias de intrones de
BORIS
loci [18]. Queda por determinar si los ratones tienen
Boris
especies de isoformas alternativas. Si existen, se debe anticipar que serían distintos de los de los seres humanos a pesar de la conservación de los sitios de empalme. La aparición de isoformas en primates tanto, se puede atribuir a los potenciadores intronic empalme putativo.
(A) El porcentaje de identidad de ser humano (
H.sapiens
) BORIS isoformas C-terminales de aminoácido alternativo putativa secuencias de los chimpancés (
P.troglod.
), macaco (
M.mulatta
), y de ratón (
M.mus
.). Once alternativa C-terminales que se encuentra en isoformas distintas se definen por el número de codones corriente abajo de la última ZF. La tabla muestra los nombres de BORIS isoformas con los correspondientes extremos C y su identidad en tanto por ciento. (B) Alineación de BORIS alternativa C-terminales en humanos, chimpancés, macacos y el ratón. Las secuencias de aminoácidos alternativas de humanos, chimpancés, macacos y el ratón están alineados por ClustalW (Vector NTI). variantes de empalme BORIS humana son altamente conservados en los primates, pero no en ratones. Las secuencias de aminoácidos de algunos de BORIS alternativa C-terminales (C132, C97, C68, C53, C36, C30, C24) están completamente ausentes en los ratones. Yellow destacó secuencias son 100% idénticas a la secuencia de aminoácidos humana; el punto culminante azul indica las sustituciones conservadoras respecto a las secuencias homólogas BORIS humanos. Los puntos indican inserciones o deleciones.
Alternativa
BORIS
transcripciones se expresan en las gónadas femeninas y masculinas normal y
Hemos informado anteriormente de que la expresión de
BORIS B0
en tejidos humanos normales se limita a los testículos [2]. Para analizar los patrones de
BORIS
isoforma expresión en testículos, hemos diseñado una serie de cebadores y sondas Taqman para amplificar los transcritos alternativos por QRT-PCR. Sólo 8 de 23
BORIS
isoformas se podían diferenciar específicamente por QRT-PCR porque la mayoría de las isoformas comparten secuencias, por lo que es imposible diseñar cebadores y sondas que detectan las
BORIS
isoforma como una especie separada . En consecuencia, hemos dividido operativamente las 23 isoformas en seis subfamilias (SF1 a SF6) en base a sus únicas secuencias 3 'terminales, que se utilizaron para diseñar sondas Taqman 6 de QRT-PCR (Fig. 2A, Materiales y Métodos). Entre 13 adultos y 13 tejidos fetales probado, se detectó la expresión de los seis
BORIS
subfamilias sólo en testículos adultos y en el ovario embrionario, pero los niveles relativos de expresión isoforma era reproducible diferente en los dos tejidos (Fig. 4A ,SEGUNDO). En testículos adultos, los seis subfamilias se expresaron en niveles comparables, con sf1 siendo el grupo más prevalente, expresados en aproximadamente 1,3 a 3 veces los niveles más altos que los otros cinco subfamilias (Fig. 4A). Por el contrario, SF3 era la forma más prevalente en los ovarios de embriones (Fig. 4B), que se expresa a niveles aproximadamente 4 veces mayor que SF1 y SF4, y de 11 a 127 veces mayor que los grupos de SF6, SF2 y SF5 ( la Fig. 4B). Mientras que entre los tejidos adultos solamente testículo fue fuertemente positiva para
BORIS
isoformas, que se expresaron a muy baja aunque a niveles reproducibles en varios tejidos en el panel fetal, incluyendo testículos, piel, y el bazo (Fig. 4B). Esto sugiere que
BORIS
isoformas pueden ser funcionalmente activo fuera de la línea germinal durante el desarrollo fetal.
QRT-PCR análisis de
BORIS
isoforma expresión en el adulto humano normal (A) y (B) tejidos fetales, respectivamente, se cuantificó por el enfoque de cuantificación absoluta. El 23
BORIS
isoformas fueron divididos en 6 subfamilias basándose en sus secuencias del extremo 3 'únicos para permitir el diseño de sondas Taqman (Material y Métodos). (C)
BORIS
isoforma expresión en el testículo adulto normal humano analizada por
In situ
hibridación, ARN FISH. Para los ensayos de FISH, las sondas para seis
BORIS
subfamilias (SF1-SF6) fueron marcadas con digoxigenina-11-dUTP por PCR y se hibridó de forma individual para testículo humano adulto formaldehído-fijo. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos anti-DIG durante la noche y luego visualizados con el anticuerpo secundario conjugado con rodamina. Para identificar las espermatogonias y espermatocitos, se realizó la inmunotinción con anticuerpos contra SCP3 (rojo) y E-cadherina (verde claro), respectivamente. las imágenes fusionadas de núcleos teñidos con DAPI (azul) y
BORIS
ARN isoforma (rojo) tomada con 20 aumentos; imágenes de mayor aumento son 63X. Las flechas indican con las letras: Mx-espermatogonias, espermatocitos, Sc - St - espermátidas (células pequeñas, alargadas con núcleos alargados, respectivamente). El control (CTR) es la tinción con anticuerpo secundario conjugado con rodamina solo.
Para identificar los tipos específicos de células que expresan
BORIS
isoformas en testículos adultos, se realizó un ARN
In situ
hibridación utilizando preparaciones fijas de testículo humano normal. La inmunotinción de testículo con anticuerpos frente a SCP3 y E-cadherina se utiliza para distinguir espermatogonias y espermatocitos, respectivamente, mientras que las espermátidas se identificaron morfológicamente como pequeñas y alargadas células con núcleos alargados (Fig. 4C, E-cad, SCP3). Después de la hibridación a seis sondas de PCR marcados diseñados para detectar específicamente cada uno de los seis
BORIS
subfamilias, las transcripciones de isoformas se detectaron en casi todas las etapas de la espermatogénesis (Fig. 4C). Los seis
BORIS
subfamilias de transcripción eran menos abundantes en el citoplasma de las espermatogonias de espermatocitos, espermátidas, mientras que fueron altamente positivos para
BORIS
SF2 y marginalmente positivo para SF5 y SF6. Por lo tanto, SF2, SF5 y SF6 parecen caracterizar las últimas etapas de la espermatogénesis de espermatocitos de espermátidas. Un estudio anterior [2] a base de pollo anticuerpo anti-Boris y un extremo 5 'marcado con
BORIS
sonda, tanto específica para el terminal N258, mostraron que la expresión de la
BORIS B0
isoforma era restringido principalmente a los espermatocitos. El presente trabajo complementa nuestra evaluación previa de
BORIS Versión taquigráfica de localización, proporcionando evidencia de la expresión de los seis
Boris
subfamilias en testículo humano adulto. La expresión diferencial aparente de subfamilias individuales durante la progresión desde temprano para etapas posteriores de la espermatogénesis indica que la expresión de
BORIS
isoformas está regulado por el desarrollo.
BORIS
isoformas codifican putativo del cáncer -testis antígenos
estudios anteriores demostraron que la
BORIS B0
isoforma se expresa de forma anormal en muchos tipos de cánceres humanos, incluyendo tanto los cánceres primarios y líneas celulares de cáncer, calificándolo como codifica una putativa cáncer- antígeno de testículo (CTA) [6], [8], [24], [25], [26]. Para comprender la relevancia de la múltiple recién descubierto
BORIS
isoformas para el desarrollo y progresión del cáncer, hemos probado el cáncer panel de línea celular NCI-60 por RT-PCR y se encontró que alrededor del 70% de esas líneas celulares expresó transcripciones de algunas isoformas (Fig. 5A). La mayoría de las líneas positivas, sin embargo, expresaron niveles de
BORIS
transcripciones que eran bastante baja a menos de 500-1.500 por transcripciones de 50 ng de ARN total. Sin embargo, los niveles fueron suficientes para detectar dos patrones distintos de
BORIS
isoforma expresión. El primer patrón, ejemplificado en la figura 5B para la línea celular K562, se asoció con más de 20.000
Boris
transcripciones (agregado para todas las seis
BORIS
subfamilias) por 50 ng de ARN total. En este subgrupo de líneas celulares (8 de 60, 13% del panel NCI-60), las transcripciones SF1 estaban presentes en los niveles más altos, con un promedio de 3 veces mayor que los niveles de SF2, 10 veces mayor que para SF3 y SF4, 50 veces mayor que para el SF6, y más de 100 veces mayor que para SF5 (Fig. 5B). Las líneas de células que muestran este patrón de expresión se originaron a partir de diferentes tejidos, incluyendo ovario, de pulmón, de mama, sangre, y la piel, lo que indica que la expresión de
BORIS
isoformas no está asociada específicamente con el cáncer de orígenes particulares.
(a) La
BORIS
subfamilias son upregulated significativamente en células de cáncer en comparación con las células normales. Para las células normales (N) - la expresión de
BORIS
isoformas se analizó en 13 tejidos y 4 líneas de células primarias. Para las células de tumor (T) - se analizaron las líneas celulares de cáncer NCI-60. 59 de las líneas celulares de cáncer del NCI-60, 13 tejidos normales, y 4 líneas de células primarias normales se analizaron por el método de cuantificación absoluta con la normalización de los niveles de GAPDH, y se representa mediante una escala logarítmica. Los niveles de
BORIS
isoforma expresión varían en gran medida (de 0 a 60000 transcripciones por 50 ng de ARN total). Las líneas rojas indican los valores medios para cada
BORIS
subfamilia. (B) El primer patrón de
BORIS
isoforma expresión en células de cáncer del NCI-60, como se representa por la línea celular de cáncer K562. (C) El segundo patrón de
BORIS
isoformas de expresión en el panel NCI-60 se ejemplifica por la línea celular de cáncer OVCAR3. (D-J)
BORIS
isoformas expresión analizada por el EPR. Las alícuotas de ARN total obtenido de riñón, testículo y la línea celular K562 se hibridaron con sondas de ARN antisentido
32 P-etiquetados. Se detectaron los fragmentos protegidos de RNasa (puntas de flecha) sólo en testículos y K562, pero no en el riñón. El primer carril de cada gel es un control, una sonda no digerida se incubaron con ARN de levadura. (D) RPA con ribosonda SF1 /SF5 produce 154 pb y 40 pb fragmentos, correspondientes a SF1 y SF5, respectivamente. (UN).