Extracto
El cáncer de células madre (CSC) modelo postula la presencia de un pequeño número de células madre cancerosas en la población de células cancerosas heterogéneo que son en última instancia, responsable de la iniciación del tumor , así como la recurrencia del cáncer y la metástasis. CSC han sido aisladas de una variedad de cánceres humanos y son capaces de generar una población de células de cáncer jerárquica y heterogénea. CSC también son resistentes a la quimioterapia convencional y radio-terapias. Aquí mostramos que la radiación ionizante puede inducir propiedades de células madre similares a las células cancerosas en heterogéneas. La exposición de las células de cáncer no-madre a radiaciones ionizantes spherogenesis mejorado, y esto fue acompañado por la regulación positiva de los genes pluripotencia Sox2 y Oct3 /4. Desmontables de Sox2 o Oct3 /4 inhibido spherogenesis inducida por la radiación y el aumento de la sensibilidad celular a la radiación. Estos datos demuestran que la radiación ionizante puede activar las vías stemness en células de cáncer heterogéneos, lo que resulta en el enriquecimiento de una subpoblación CSC con mayor resistencia a la radioterapia
Visto:. Ghisolfi L, Keates AC, Hu X, Lee Dk, Li CJ (2012) la radiación ionizante induce la troncalidad en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (8): e43628. doi: 10.1371 /journal.pone.0043628
Editor: Taro Yamashita, Universidad de Kanazawa, Japón
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: July 24, 2012; Publicado: August 21 de, 2012
Copyright: © Ghisolfi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Skip Ackerman Centro para el Fondo Terapéutica Molecular y Premio Global Research Laboratory (Ministerio de Ciencia y Tecnología, Corea Educación). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células madre del cáncer (CSC), una subpoblación de células malignas en la población de células cancerosas heterogénea, se considera que son responsables de la recurrencia del cáncer, metástasis y la resistencia a los medicamentos. CSC han sido aisladas de una variedad de tumores malignos humanos incluyendo leucemia [1], [2], cáncer de mama [3], [4], tumor cerebral [5], carcinoma hepatocelular [6], cáncer de páncreas [7] y el cáncer colorrectal [8], [9]. Los CSC tiene la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse en la multitud de células que componen la mayor parte de la masa del tumor [10], [11]. Los CCC también expresan altos niveles de proteínas transportadoras de resistencia a fármacos (por ejemplo, ABC) [12], [13], [14], las enzimas de reparación del ADN [15], [16] y anti-apoptóticos proteínas [17], [18], [ ,,,0],19], que los hace altamente resistente a las terapias convencionales contra el cáncer, incluyendo la quimioterapia y la radiación. Por ejemplo, los estudios publicados por Bao et al [20] han demostrado que la radiación ionizante puede enriquecer las células madre del cáncer de glioma CD133 +
in vitro
y
in vivo
. Además, estos autores mostraron que este efecto de enriquecimiento estaba mediada por la activación preferencial del puesto de control de daño del ADN en las células madre de cáncer glioma CD133 + en comparación con células de glioma CD133- no madre. El modelo de CSC, por lo tanto, exige el diseño de terapias que se dirigen a las CSC para mejorar el tratamiento del cáncer [21], [22].
A pesar de que cada vez hay más evidencia para apoyar la hipótesis de CSC, el origen exacto de estas células sigue siendo controvertido. Una posibilidad es que los CAC resultan de la transformación oncogénica de las células madre de tejido normales [23]. En este escenario, se cree que las mutaciones en los mecanismos reguladores que controlan de células madre de auto-renovación para promover la formación CSC [24], [25], que a continuación, generar una jerárquicas y heterogéneos células cancerosas, lo que sugiere que la célula de cáncer de origen tiene la capacidad de generar múltiples tipos de células (es decir, la plasticidad multidifferentiative), una característica de las células madre similares a [26], [27], [28]. Alternativamente, células madre cancerosas se pueden derivar de células de cáncer no madre que han adquirido propiedades stemness [22], [29]. De acuerdo con esto, los estudios publicados por Quintana et al, y Roesch et al [30], [31] han demostrado que un fenotipo CSC puede ser adquirido por las células tumorales previamente negativo para marcadores específicos de CSC.
En este estudio, nuestros datos sugieren la irradiación de las células cancerosas como un origen potencial novela de stemness cáncer. La exposición de células de cáncer heterogéneos a la radiación ionizante gamma spherogenesis mejorada en condiciones de cultivo de células madre. Sorprendentemente, la irradiación de las poblaciones celulares de cáncer heterogéneos-agotado CSC indujo la aparición de células de formación de esferas. A nivel molecular, el análisis de la expresión de genes pluripotencia después de la irradiación gamma mostró regulación de Sox2 y Oct3 /4 mRNA y proteína. Por el contrario, desmontables de Sox2 o Oct3 /4 redujo notablemente colonias supervivientes después del tratamiento de radiación, y también inhibió significativamente spherogenesis inducida por radiación. Estos datos demuestran que la radiación puede activar las vías stemness en células de cáncer heterogéneos, lo que sugiere un nuevo mecanismo de resistencia de las células cancerosas a la radioterapia. También implican que la orientación de las CSC puede mejorar la eficacia de la radioterapia.
Resultados
Aumenta la radiación gamma por las células cancerosas Spherogenesis
Primero examinamos el efecto de las radiaciones ionizantes sobre la capacidad de las células de carcinoma hepatocelular, para el que un componente CSC se ha descrito previamente [6], [32], a crecer como esferas en virtud de medios de células madre (SCM) las condiciones de cultivo. suspensiones de células individuales de células HepG2 y células Huh7 fueron expuestos a 0-10 Gy de radiación gamma (por LD
50 ver Figura S1) y después se sembraron a una densidad clonal en placas ultra bajas de fijación en SCM libre de suero. formación de esferas se evaluó después de 7 días y 14 días de cultivo. Ambas líneas celulares fueron capaces de formar esferas (figuras 1c, 1d). Como se muestra en las figuras 1a y 1b, se observó un aumento del 40-50% en el número de esferas para las células HepG2 en el día 7 y día 14, y para las células Huh7 en día 14 después del tratamiento con 2 Gy o 4 Gy de radiación gamma. Estos hallazgos muestran que la radiación ionizante gamma puede aumentar significativamente el
in vitro
spherogenesis de las células HepG2 y Huh7.
A y B células HepG2 (a) y las células Huh7 (b), fueron expuestos a aumento de las dosis de radiación gamma, y luego se sembraron en medios de células madre en placas de 96 pocillos de unión ultrabaja a 500 células /pocillo. Los números de la esfera se contaron después de 7 días (arriba) y 14 días (abajo) de la cultura, y los números relativos se informaron en los gráficos. las dosis de radiación más bajas de 2 y 4 Gy indujeron un aumento significativo en la formación de esfera en ambas líneas celulares en comparación con las muestras no tratadas. Los resultados se presentan como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente a las células control sin tratar. imágenes C y D representativos de HepG2 (c) y (d) las esferas Huh7 formaron después de 14 días de cultivo en medios de células madre. Las imágenes fueron capturadas usando una cámara digital (AmScope, iScope Corp., Chino, CA), montada en un microscopio invertido Zeiss Axiovert 25. Ampliación:. 100x
radiación gamma induce Spherogenesis en HepG2 y Huh7 no laterales Las células Población
Población citometría de flujo lateral (definida por la capacidad de excluir el colorante de unión a ADN Hoechst 33342 ) [33], [34] se ha utilizado para enriquecer CSC y no CSC de varias líneas celulares de cáncer, así como cultivos derivados de tumores primarios [26], [35], [36]. Este enfoque ha demostrado que HepG2 y Huh7 células madre cancerosas representan ~1-2% de las células tumorales a granel [6], [32]. Dado que la capacidad de formar esferas
in vitro
bajo condiciones de cultivo no adherentes se considera una propiedad de CSC [32], [37] nuestros datos indican fuertemente que la irradiación gamma de las células HepG2 y Huh7 aumentó significativamente en el número de células madre cancerosas en ambas líneas celulares.
para investigar si el aumento de spherogenesis observó después de la exposición a la radiación gamma podrían originarse dentro de la población de células de cáncer no vástago heterogénea, se utilizó fluya población lado citometría para identificar y aislar no CSC a partir de células HepG2 y Huh7. Un experimento de población no lado de clasificación típico se ilustra en la Figura 2a. Las células sensibles a la verapamilo inhibidor de la bomba de salida (puerta R3) muestran la intensidad de tinción Hoechst baja y fueron identificados como el componente de población lateral (SP) del tumor (es decir CSC-enriquecido). verapamilo células insensibles con alta intensidad de la tinción de Hoechst (R4 puerta) se aislaron como las células de la población no-lado (no-SP). Para excluir la posibilidad de efectos no específicos sobre la formación de esferas resultantes de los procedimientos de clasificación FACS, las células HepG2 y Huh7 fueron también ordenados de forma simulada basada en la tinción de yoduro de propidio (PI). Tras la clasificación celular en SMC, no SP (es decir CSC agotada) y células de control (sin clasificar mayor o PI-ordenados HepG2 y Huh7) se irradiaron con 0, 2 o 4 Gy de radiación gamma en SMC. mayor irradiado, irradiado células no-SP-PI y las células irradiadas ordenados fueron luego sembradas en placas de unión y formación de esferas de ultra baja se evaluó a los 7 y 14 días de cultivo.
Un células HepG2 (paneles de la izquierda) y Huh7 células (paneles de la derecha) fueron teñidas utilizando Hoechst 33342 con (paneles inferiores) o sin (paneles superiores) verapamilo, y luego ordenados usando un clasificador de células activado por fluorescencia MoFLO2. La puerta R3 identifica la fracción lateral Población (SP). Las células no-Side Población (Non-SP), aislado a través de la puerta R4, se recogieron, se lavaron en PBS y se resuspendieron en medio de células madre. B y C Unsorted, no SP y PI-ordenados HepG2 (b) y Huh7 (c) células fueron expuestas a 0, 2 o 4 Gy de radiación gamma y luego se sembró sobre placas de fijación ultra bajas de 96 pocillos a 500 células /pocillo . los números de la esfera se contaron después de 7 días (paneles superiores) y 14 días (paneles inferiores) de la cultura, y los números relativos se informaron en los gráficos. Las barras blancas representan las células tumorales sin clasificar, barras negras representan células de población no ordenados lado (no-SP), y barras sombreadas representan células PI-ordenados. Después de 14 días de cultivo en SMC, las dosis de radiación de 2 y 4 Gy indujeron un aumento significativo en la formación de esfera en la población tumor a granel y en la población no-SP de las dos líneas celulares en comparación con las muestras sin tratar, mientras que las células Huh7 según-PI mostraron aumentó significativamente la formación de esfera siguiente 2 Gy de tratamiento de radiación. Los resultados se presentan como media ± SEM de cinco experimentos independientes (poblaciones no clasificados como no-SP) o media ± SEM de dos experimentos independientes (población PI-ordenados). * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01 frente a las células de control no tratadas
Como se muestra en la Figura 2b y la Figura 2c, no se observó diferencia significativa en la formación de esferas después de 7 días de cultivo en SCM para clasificar , no SP, o células HepG2 o Huh7 PI-ordenados sometidos a 2 o 4 Gy de radiación gamma. En contraste, las células HepG2 sin clasificar expuestos a 2Gy de la radiación y las células Huh7 no clasificados expuestos a 2 o 4 Gy de radiación habían aumentado significativamente la formación de esfera después de 14 días de cultivo en SCM (Figura 2b, 2c). Además, las células de control PI-ordenados de ambas líneas celulares mostraron capacidad de formación de esferas similar a HepG2 mayor sin clasificar o células Huh7 después de 14 días de cultivo en SMC. Específicamente, las células Huh7 PI-ordenados sometidos a 2 Gy de radiación gamma mostraron un aumento significativamente la formación de esfera después de 14 días de cultivo en SMC (p & lt; 0,05). Las células HepG2 PI-ordenados expuestos a 2 o 4 Gy de radiación también se muestra la formación de ámbito marcadamente elevada después de 14 días de cultivo en SMC. Estas diferencias, sin embargo, no alcanzaron significación estadística. Sorprendentemente, la exposición a la radiación gamma notablemente inducida spherogenesis en las fracciones no SP a partir de células HepG2 y Huh7 después de 14 días de cultivo en SMC. Para las células HepG2, el tratamiento de la fracción no-SP con 2 Gy de radiación gamma indujo un aumento del 150% en la formación esfera en comparación con las células no tratadas SP (p & lt; 0,001). Del mismo modo, el tratamiento de células no SP Huh7 con 4 Gy de radiación gamma indujo un aumento del 80% en la formación esfera (p & lt; 0,01). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la radiación de baja dosis gamma puede promover la formación de células madre cancerosas dentro de la población de células cancerosas no tallo heterogénea.
stemness Expresión Génica se incrementa en HepG2 y Huh7 células después de la radiación gamma Tratamiento
para examinar si el aumento de spherogenesis inducida por la radiación gamma puede ser debido a la expresión de genes stemness elevada, las células HepG2 y células Huh7 fueron expuestos varias dosis de radiación gamma, y el nivel de Oct3 /4 y Sox2 ARNm se evaluó mediante real PCR en tiempo. Como se muestra en la Figura 3a y 3c, un aumento significativo de Oct3 /4 mRNA y proteína se detectó en las células HepG2 6 horas después de la exposición a 2 o 4 Gy de radiación gamma. El aumento de los niveles de proteína Oct4, también se observaron en las células Huh7 6 horas después de la exposición a 4 Gy de radiación (Figura 3d). los aumentos inducidos por la radiación en el nivel de células Huh7 Oct3 /4 mRNA, sin embargo, no alcanzaron significación estadística (Figura 3b).
A y B, E y F células HepG2 y Huh7 fueron expuestas a 0, 2 o 4 Gy de radiación gamma y el ARN total se extrajo después de 3, 6 o 24 horas. Oct3 /4 (a y b) y Sox2 (E y F) los niveles de ARNm de cada línea celular se determinó entonces por cuantitativos PCR en tiempo real y normalizado a los niveles de GAPDH ARNm en cada muestra. En las células HepG2, el tratamiento con 2 y 4 Gy de radiación gamma indujo un aumento significativo de Oct3 /4 niveles de mRNA. los niveles de mRNA Sox2 también fueron fuertemente regulados por incremento en células Huh7 siguiente dosis bajas de tratamiento de radiación gamma. Los resultados se presentan como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 frente a la muestra t0 o las muestras sin tratar. La línea discontinua representa una comparación con el control en el mismo punto de tiempo. las células C y D, G y H HepG2 y células Huh7, se expusieron a 0, 2 o 4 Gy de radiación gamma y Oct4 o proteína Sox2 expresión se determinó mediante análisis de transferencia Western después de 6 horas (por Oct4; C y D), o después de 4 horas (por Sox2; G y H). los niveles de Oct4 y Sox2 proteína aumentaron después del tratamiento de radiación coherente con los aumentos en los niveles de ARNm para cada gen.
De acuerdo con nuestros hallazgos con respecto a la expresión Oct3 4 /, encontramos que Sox2 mRNA y los niveles de proteína también fueron significativamente aumento en las células Huh7 3 y 6 horas después de la exposición a 4 Gy de radiación (Figura 3f, 3H). Sin embargo, no se detectó aumento de Sox2 ARNm y los niveles de proteína en las células HepG2 después del tratamiento de radiación (Figura 3e, 3g). Estos resultados sugieren que la radiación gamma puede inducir la reprogramación de las células cancerosas diferenciadas a un fenotipo más de tallo como mediante la inducción de la expresión de genes stemness.
Oct3 /4 y Sox2 Desmontables sensibiliza a las células HepG2 y Huh7 cáncer hepatocelular a la radiación gamma
Desde Sox2 y Oct3 /4 upregulation se correlaciona con un aumento de stemness (spherogenesis) en células HepG2 y Huh7 después de la exposición a la radiación gamma, el próximo examinó si estos factores podrían afectar a la capacidad de las células HepG2 o Huh7 de resistir el tratamiento de radiación. Para estos experimentos, Sox2 o gen Oct4 expresión fue silenciado en las células Huh7 y HepG2 utilizando ARN de interferencia asimétrica (airna). airna fueron elegidos, en lugar de siRNA, debido a su especificidad superior, [38]. eficiencia caída se evaluó mediante Western blot 48 h después de la transfección airna. airna orientación Sox2 o Oct4 reduce de manera eficiente la expresión de ambas proteínas (Figura 4a y 4b). Esto es consistente con estudios anteriores utilizando células madre embrionarias que demuestran Oct4 y Sox2 están vinculados a la misma vía de reglamentación, que incluye bucles de autorregulación y regulación recíproca de auto-transcripción [39], [40]. por lo tanto, se espera gen desmontables individual dentro del circuito de regulación Sox2-Oct4, para reducir el nivel de expresión de ambas proteínas.
A y las células B HepG2 (A) y células Huh7 (b), se transfectaron con 100 nM de airna orientación GFP, Sox2 o Oct4, y la eficiencia caída se evaluó mediante transferencia Western después de 48 horas. Sox2 y Oct4 pertenecen al mismo circuito de regulación; Por lo tanto, solo gen desmontables conduce a la reducción de los niveles de expresión de ambas proteínas. células C y D HepG2 y Huh7 transfectadas con airna orientación GFP, Sox2 o Oct4 fueron irradiados con 0, 2, 4, 6, 8 o 10 Gy de radiación gamma y el mismo número de células se sembraron en placas de 6 pocillos para el ensayo de formación de colonias . En el día 7, se contaron las colonias y se representó gráficamente la fracción de células supervivientes clonogénicas expresados como log natural. Las líneas se ajustan usando una regresión polinómica de primer orden y representan la media de cuatro experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001 frente a las células GFP transfectadas
Para evaluar el efecto de Sox2 o Oct4 caída en la viabilidad celular después del tratamiento de radiación, y Huh7 células HepG2 fueron transfectadas con la orientación airna Sox2, Oct4 o GFP. Después de 24 h, se dividieron las células y se expusieron a 0, 2, 4, 6, 8 o 10 Gy de radiación gamma. suspensiones de células individuales fueron luego sembradas en DMEM completo en placas de 6 pocillos estándar para permitir que las células se unan y forman colonias. Después de 7 días de cultivo en DMEM completo, las colonias formadas en cada tratamiento se tiñeron y se contaron. Como se muestra en la figura 4c y 4d, silenciando de Sox2 o Oct4 expresión génica en células HepG2 y Huh7 dado lugar a un aumento significativo en la sensibilidad a la radiación gamma (disminución de LD
50 valor; véase la Tabla 1) en comparación con las células transfectadas con una airna dirigido contra GFP, o de las células no transfectadas. Estos datos sugieren que la regulación a la baja de los genes stemness puede sensibilizar células de carcinoma hepatocelular de tratamiento de radiación gamma.
Oct3 /4 y Sox2 caída en HepG2 o Huh7 células Inhibe inducida por radiación Esfera Formación
Desde desmontables de Sox2 o Oct4 aumentó la sensibilidad de las células HepG2 y Huh7 a tratamiento de radiación, el próximo examinó si la capacidad spherogenesis de las células HepG2 y Huh7 después de la irradiación gamma se asoció con la expresión de estos factores. Para evaluar el efecto del tratamiento de radiación, las células Huh7 y HepG2 fueron transfectadas con airna dirigidos contra Sox2, Oct4 o GFP, se recogieron después de 24 h, y luego se divide y se expone a 0, 2 o 4 Gy de radiación gamma. Las células fueron sembradas a una densidad clonal en placas de fijación ultra-bajas en SCM libre de suero. Después de 7 días de cultivo, las células irradiadas con rayos gamma transfectadas con airna dirigidos contra GFP mostró un aumento similar en la formación de esferas para el grupo no tratado. células Huh7 y HepG2 tratadas con Sox2 o Oct4 airna y expuestos a la radiación, sin embargo, forman significativamente menos esferas que las células de control transfectadas con GFP airna (Figura 5a y 5b). Más importante aún, las células tratadas con Sox2 o Oct4 airna tenían una capacidad reducida de manera significativa a formar esferas tras la exposición a 2 o 4 Gy de radiación gamma, en comparación con las células no irradiadas. En las células HepG2, una inhibición significativa de la formación de la esfera también se observó en las células no irradiadas en silenciamiento de Sox2 o Oct4. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la expresión de Sox2 y Oct3 /4 se requiere para CSC en células HepG2 y Huh7, y que la regulación positiva de estos factores en no CSC puede ser suficiente para inducir la adquisición de un fenotipo CSC, lo que confiere un mayor resistencia a la radiación a la población de células tumorales a granel.
células a y B HepG2 y células Huh7 transfectadas con la orientación airna GFP, Sox2 o Oct4 fueron expuestos después de 24 horas a 0, 2 o 4 Gy de radiación gamma y luego sembraron en placas de 96 pocillos de fijación ultra bajo en 500 células /pocillo en medios de células madre. los números de la esfera por cada grupo de tratamiento y la radiación caída se registraron en el día 7 de cultivo en medios de células madre. El silenciamiento de Sox2 o Oct4 redujo significativamente la formación de esfera en las células HepG2 y Huh7 tratados con dosis bajas de radiación gamma en comparación con las células no irradiadas o células transfectadas con airna contra GFP. Los resultados se presentan como media ± SEM de cuatro experimentos independientes, n = 4. * p & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01, frente a las células GFP-transfectadas o células de control no irradiados (0 Gy)
Discusión
las células madre del cáncer (CSC) para representar una pequeña subpoblación de células presentes en la mayoría de los tumores que, de forma similar a las células madre de tejido normales, poseen la capacidad de auto-renovación, para dividir asimétricamente y simétricamente, y someterse a múltiples linaje diferenciación [41], [42]. Estas características de células madre cancerosas son las responsables fundamentales de su capacidad única para iniciar y sostener los tumores [10], [42], [43]. Por otra parte, también se cree que desempeñan un papel clave en la metástasis del cáncer, la recurrencia del cáncer, el cáncer y la resistencia a los medicamentos [15], [20], [44], [45].
En este estudio, hemos demostrado los CAC que las células cancerosas pueden ser inducidas, por radiación gamma, para adquirir un estado stemness caracterizado por el aumento de la expresión de genes stemness y un fenotipo de células madre similares a cáncer. población Side citometría de flujo ha demostrado que células madre cancerosas en HepG2 y Huh7 representan aproximadamente el 1-2% de las células tumorales a granel [6], [32]. Dado que la capacidad de formar esferas in vitro en condiciones de cultivo no adherentes es específico de células madre cancerosas [32], [37], nuestros datos sugieren que la irradiación gamma de las células HepG2 y Huh7 aumentó significativamente en el número de células madre cancerosas en ambas líneas celulares.
publicaciones recientes han demostrado que, a diferencia de las células tumorales a granel, células madre cancerosas poseen una resistencia intrínseca a la radioterapia
e in vitro
in vivo
[20], [45], [ ,,,0],46], y que muy probablemente esta propiedad resulta de mayor expresión de enzimas eliminación de radicales libres, aumento de la eficiencia en la reparación de daños en el ADN, y preferencial daños en el ADN puesto de control de la activación [15], [16], [20], [47] . Para explorar más a fondo el origen de los mayores números de células madre cancerosas en gamma irradiados células HepG2 y Huh7 que realizan citometría de flujo utilizando Hoechst exclusión 33342 para aislar parte de población (SP) células que están enriquecidos en CSC, y la población no-lateral (no-SP ) las células que se pierden de CSC. Sorprendentemente, se observó el aumento significativamente la formación de la esfera en células no-SP HepG2 y Huh7 tras la exposición a 2 o 4 gris de la radiación gamma (Figura 2). Por otra parte, el aumento de formación de esferas también se observó en HepG2 no tratadas y las células no SP Huh7. Estos resultados indican que las células no SP (es decir, células tumorales no CSC) pueden adquirir propiedades CSC-similares, y son consistentes con el concepto reciente de que los tumores se componen de una variedad de células en diferentes etapas de maduración [48], [49] , con la capacidad de convertir en un vástago más estado de células como [50], [51].
estudios previos han informado que el enriquecimiento de la radiación inducida de células madre cancerosas se asocia con la activación de vías de señalización auto-renovación tales Wnt /β-catenina, Notch y Hedgehog [52], [53], [54]. Además, dado que los CAC son capaces tanto de la división celular asimétrica y simétrica [55], se cree que [56] el efecto de enriquecimiento que es mediado principalmente por células madre cancerosas sometidas a la división celular simétrica. Nuestros datos, sin embargo, sugieren que un componente adicional de este efecto puede ser la adquisición de características stemness tras el tratamiento de radiación por las células cancerosas no madre. Este hallazgo se ve apoyada por nuestra observación de un aumento de Sox2 y Oct3 /4 la expresión de genes pluripotencia de las células de carcinoma hepatocelular después de la irradiación gamma (Figura 3).
Junto con c-Myc, Klf4 y NANOG, Sox2 y Oct3 /4 factores de transcripción son considerados genes clave para la producción de murino y células madre pluripotentes inducidas por el hombre [57], [58]. En concreto, Sox2 y Oct3 /4 expresión parece tener un papel fundamental para asegurar el mantenimiento de auto-renovación, la plasticidad y la capacidad de reprogramación en las células madre embrionarias y células madre cancerosas [59], [60], [61], [62] . El aumento de expresión de Sox2 y Oct3 /4 después del tratamiento de radiación gamma (Figura 3) es, por lo tanto, coherente con la inducción de un programa genético en algunas células HepG2 y Huh7 que resulta en un aumento stemness, y la adquisición de un fenotipo de células madre como [ ,,,0],63], [64], [65]. Dado que el componente CSC en ambas líneas celulares representa ≤2% de la población total de células (Figura 2) [6], [32], la sobreexpresión observada de Sox2 y Oct3 /4 en las células HepG2 y Huh7 después de la irradiación de baja dosis más probablemente representa los cambios en la población no-CSC.
en este estudio, hemos encontrado que la regulación a la baja de Sox2 y Oct3 /4 en las células HepG2 o Huh7 se asoció con una menor resistencia a la radiación gamma en un ensayo clonogénico de supervivencia que permite la supervivencia y la proliferación de las células cancerosas no madre, así como células madre cancerosas (Figura 4). Este hallazgo está de acuerdo con estudios previos que demuestran que la radioresistance de células tumorales a granel parece estar relacionada con el componente de CSC de la población del tumor [20], [45], [46]. Para examinar esta más lejos, derribado Sox2 o expresión Oct4 en células HepG2 o Huh7 usando tecnología asimétrica-RNA y examinamos su capacidad para crecer como cultivos en esfera. Se encontró que desmontables de Sox2 o expresión Oct4 se asoció con una disminución significativa en la formación de esferas después del tratamiento de radiación gamma (Figura 5). Puesto que este experimento se realizó en condiciones de cultivo de células madre, que son selectivos para CSC enriquecimiento y la supervivencia, nuestros resultados sólo deben reflejar el efecto de Sox2 y Oct3 /4 knockdown en células madre cancerosas. Curiosamente, Sox2 y Oct3 /4 downregulation redujeron significativamente la esfera capacidad en las células HepG2 y Huh7 no irradiadas de formación, lo que indica que estos factores también pueden ser necesarios para el mantenimiento de células madre cancerosas existentes. Estos hallazgos sugieren que desmontables de Sox2 y Oct3 /4 puede ser un enfoque potencial de sensibilización de los carcinomas hepatocelulares a la radioterapia ya que el bloqueo de estos factores pueden impedir la auto-renovación de la no-células madre cancerosas que han adquirido propiedades stemness, así como células madre cancerosas existentes.
a largo plazo, los efectos no son objetivo, de las radiaciones ionizantes, tales como la inestabilidad genómica, las respuestas de adaptación y el efecto espectador se considera que tienen un papel importante en la carcinogénesis inducida por la radiación [66], [67], [68] . La exposición de las células a la radiación, especialmente dosis bajas, puede mediar la inestabilidad genómica y respuestas de adaptación que tienen el potencial para inducir la expresión del gen, reordenamiento cromosómico, modificaciones post-traduccionales y cambios epigenéticos que inician la carcinogénesis. Estos cambios también pueden ser inducidas en otras células que no han sido sometidos a radiación de daño (por el efecto espectador) inicial que conduce a un fenotipo más amplificado. Además, son heredables, no clonal, y se basan en modificaciones epigenéticas tal como la desregulación de la metilación del ADN [69], [70], [71]. Nuestra conclusión de que la radiación gamma puede inducir spherogenesis en células de cáncer no-madre, y que este proceso requiere la expresión de Sox2 y Oct3 /4, son consistentes con la activación de un "programa de troncalidad" mediado por efectos no dirigidos epigenéticos en las células irradiadas donde la reprogramación de la expresión génica se asocia significativamente mayor de radio-resistencia [72].
en el siglo pasado, la radioterapia se ha utilizado ampliamente como un tratamiento contra el cáncer curativo o adyuvante, y la radiación de baja dosis como medida paliativa para el manejo de los pacientes con cáncer avanzado. Sin embargo, la mayoría de tumores malignos humanos, incluyendo hepatoma, son refractarios a esta modalidad terapéutica importante. En este estudio, mostramos que la radiación puede inducir propiedades de células madre similares a como la formación de la esfera y la expresión de genes en stemness no células madre cancerosas, lo que demuestra que las células cancerosas no pueden adquirir una madre más provienen del estado como una celda con una mayor capacidad de auto- renuevan, lo que sugiere un nuevo mecanismo para la radioresistance comúnmente observado en tumores malignos humanos.
Métodos
Cultivo celular y tratamiento de drogas
células de carcinoma hepatocelular
HepG2 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (HB-8065). carcinoma hepatocelular Huh7 células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Raymond Chung [73], [74]. células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y Huh7 se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Sigma-Aldrich), complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS; Sigma-Aldrich), glutamina 2 mM, 50 IU /ml de penicilina y 50 g /ml estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C. Para evaluar la formación de esfera (spherogenesis) células HepG2 y Huh7 se cultivaron en medios de células madre (SCM) compuesto de medio DMEM-F12, 1 × B27 suplemento, 200 ng /ml de EGF, 10 ng /FGF básico ml, 0,4% de BSA, 4 mg /ml de insulina, 50 UI /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
Gamma tratamiento de radiación
Sin clasificar HepG2 y las células Huh7 y no SP ordenados población suspendido en SMC se dividen en partes alícuotas en tubos de 1,5 ml a una concentración de 1 × 10
6 células /ml. Los tubos se colocaron en hielo y se irradiaron con 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy o 10 Gy de radiación gamma usando un
137Cs irradiador (CIS de diagnóstico). Las células tratadas se sembraron en SCM para el ensayo spherogenesis (a 0,5 × 10
3 /pocillo), o en DMEM completo para ensayo de viabilidad MTT (a 1 x 10
3 células /pocillo) de ensayo y la formación de colonias ( en 3 × 10
3 células /pocillo).
Hoechst 33342 tinción y Side Población citometría de flujo
Side Población citometría de flujo se realizó de acuerdo con el método de Goodell et al. [75], con modificaciones para mejorar la tinción de líneas celulares hepáticas. En resumen, se tripsinizaron cultivos HepG2 o Huh7, y las células desprendidas se recogieron por centrifugación a 500 r.p.m. durante 5 minutos. Las células sedimentadas se resuspendieron a una concentración de 10
6 células /ml en DMEM pre-calentado, suplementado con 2% de FBS y HEPES 10 mM, que contiene 5 mg /ml de Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) con o sin 50 mM verapamil (Sigma-Aldrich). Las células se incubaron a continuación a 37 ° C en un baño de agua durante 90 minutos con mezclado suave cada 15 minutos. Al final del periodo de incubación, las células se centrifugaron a 500 r.p.m. durante 5 minutos a 4 ° C, y se resuspendieron a una concentración final de 2 × 10
7 células /ml en solución de Hank tamponada de sal enfriada con hielo suplementado con 0,2% de FBS, HEPES 10 mM, 40 micras de malla filtrada y se tiñeron con 2 mg /ml de yoduro de propidio. Las muestras se mantuvieron en hielo hasta que se separaron utilizando una máquina de FACS de alta velocidad MoFlo (DakoCytomation) en fracciones que contienen células Side Población (SP) y células no laterales de población (no-SP) [6], [32], [ ,,,0],33], [34]. Hoechst 33342 fue excitada usando un láser UV a 350 nm y su fluorescencia se detectó usando un filtro de 450 nm Hoechst azul y un 670 nm Hoechst filtro rojo. la fluorescencia de yoduro de propidio se midió usando un filtro de 650 nm. Non-SP y células no clasificadas se transfirieron a continuación en SCM para el tratamiento y análisis de la formación esfera de radiación gamma. Para PI-clasificación de células a granel, las células HepG2 y Huh7 se resuspendieron a una concentración de 10
6 células /ml en DMEM pre-calentado, suplementado con 2% de FBS y HEPES 10 mM, luego se procesan como se describe anteriormente.