Extracto
Aplicaciones
miRNAs pueden regular los procesos biológicos, incluyendo la diferenciación, proliferación y apoptosis. Dicer y Drosha son dos miembros de la familia RNasa III, que juegan un papel fundamental en la vía de la biogénesis de miRNAs. En este estudio, la hipótesis de que las variaciones genéticas de los genes de Dicer y de Drosha se asociaron con el riesgo de cáncer de vejiga.
Diseño Experimental
Se realizó un estudio de casos y controles de 685 casos de cáncer de vejiga y 730 controles para investigar la asociación entre los siete SNPs funcionales de
Dicer Opiniones y
Drosha
genes y el riesgo de cáncer de vejiga. A continuación, evaluó la funcionalidad de los SNPs importantes
Resultados
Se encontró que rs10719T & gt;. C polimorfismo localizado en la región 3 'no traducida (UTR) de
Drosha
gen se asoció con el aumento del riesgo de cáncer de vejiga. El análisis estratificado sugirió que rs10719TC genotipo /CC puede aumentar el riesgo de cáncer de vejiga entre los pacientes del sexo masculino (OR ajustada = 1,34; IC del 95% = 1,05 a 1,70,
P = 0,018
), y nunca fumadores (1.56, 1.14- 2.14, 0.006), en comparación con el genotipo TT. Por otra parte,
Drosha
rs10719T & gt; C polimorfismo se predijo para regular la actividad de unión de HSA-miR-27a /b. Luciferasa informó ensayo de gen confirmó que rs10719 T a G sustitución interrumpió el sitio de unión para hsa-miR-27b, dando como resultado el aumento de los niveles de proteína Drosha.
Conclusiones
En conjunto, estos hallazgos sugieren que
Drosha
rs10719T & gt;. C polimorfismo puede estar asociada con el riesgo de cáncer de vejiga en una población china, y hsa-miR-27b puede influir en la expresión de la proteína Drosha mediante la unión con 3'UTR
Visto : Yuan L, Chu H, Wang M, Gu X, Shi D, Ma L, et al. (2013) la variación genética en
Drosha
3'UTR Regulado por hsa-miR-27b está asociada con el riesgo de cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (11): e81524. doi: 10.1371 /journal.pone.0081524
Editor: Brock C. Christensen, Escuela Geisel de Medicina de Dartmouth, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Junio, 2013; Aceptado: 14 Octubre 2013; Publicado: 28 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81230068, 30901166, 81202268 y 81102089), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (BK2011773 y BK2011775), el Programa clave de Investigación básica de Jiangsu Provincial del Departamento de Educación (11KJB330002, y 12KJA330002) , provincia de Jiangsu seis picos Talent Project (2012-SWYY-028), el Fondo de Investigación Especializada para el Programa de Doctorado de Educación Superior (20123234110001), provincia de Jiangsu Graduados Proyecto innovador (CXZZ12_0594), el Proyecto de Qing-Lan de Jiangsu Provincial del Departamento de Educación, y la prioridad Académico Programa de Desarrollo de las instituciones de educación superior de Jiangsu (Salud Pública y Medicina Preventiva). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 2% de todos los tumores malignos humanos con un estimado de 72,570 nuevos casos y 15.210 muertes en los EE.UU., en 2013, por sí solas [1]. En China, la incidencia global del cáncer de vejiga registrada fue 7,49 /100.000 en 2008, y la incidencia de cáncer de vejiga fue en aumento durante 1998-2008 (tasa de crecimiento promedio por año, 4,60%) [2]. Más de 90% del cáncer de vejiga es el carcinoma de células de transición. La incidencia de cáncer de vejiga es generalmente alta en los EE.UU. y Europa, pero baja en Asia. Al igual que otros tipos comunes de cáncer, cáncer de vejiga es una enfermedad compleja causada tanto por factores de riesgo genéticos y ambientales. Fumar cigarrillos, ocupacional y exposiciones ambientales están bien establecidos los factores de riesgo conocidos para el cáncer de vejiga [3]. Se ha informado de que FGFR3 mutación se asocia con el bajo grado de vejiga y estadio del tumor, y las mutaciones de TP53 y FGFR3 mostraron una relación inversa [4-6]. Recientemente, varios estudios de asociación de genoma completo (GWAS) con repeticiones han identificado que las variaciones genéticas comunes están asociadas con la susceptibilidad al cáncer de vejiga [7-11]. Tang et al. También identificó que una variante poco común de codificación de
UGT1A
locus (relacionado GWAS) puede afectar a
UGT1A
la expresión de ARNm y disminuir el riesgo de cáncer de vejiga [12], sin embargo, los mecanismos exactos de la vejiga el cáncer no se hace necesario aclarar
.
los microARN (miRNA) son una clase de pequeñas moléculas de ARN no codificantes de ~ 22 nucleótidos, que regulan la expresión génica a nivel post-transcripcional de unión a través de la región no traducida 3 '(UTR ) de los genes diana de ARNm [13]. miRNAs se generan en una vía de procesamiento de dos etapas mediada por dos enzimas importantes (de Dicer y de Drosha): En el núcleo, los precursores más largos son procesados en ARN primaria (pri-miRNAs) por la RNasa II y luego pri-miRNAs son procesados por el enzima RNasa (Drosha) en precursores (pre-miRNAs) con una estructura de tallo-bucle [14,15]. Los pre-miRNAs se exportan desde el núcleo hasta el citoplasma por la proteína exportin-5. En el citoplasma, pre-miRNAs se procesan en miRNAs maduros por otra enzima RNasa (Dicer). El miRNAs maduros juegan un papel mediante la incorporación en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) [16]. Se ha sugerido que miRNAs se predicen para regular 30% de los genes humanos [17]. Recientemente, varios estudios mostraron que los miRNAs pueden actuar como oncogenes y supresores tumorales mediante la orientación 3'UTR de los genes importantes [18,19] y las variantes genéticas en el 3'UTR de los genes miARN objetivo afectarían la regulación de genes miARN mediada, lo que implicaría el aumento del riesgo de cáncer [19,20]. Vale la pena señalar que Dicer y Drosha juegan el papel crucial en la carcinogénesis. evidencias acumuladas han demostrado que el desequilibrio
Dicer
y
Drosha
niveles de expresión están asociados con el riesgo de cáncer de vejiga [21-23]. Recientemente, Han y sus colegas también encontraron que
Dicer
y
Drosha
niveles de expresión eran regulados hasta en tejidos de cáncer de vejiga en comparación con los tejidos normales de la vejiga emparejados, y silenciando Dicer o Drosha puede inhibir células la proliferación e inducir la apoptosis de las células [24]. Aquí, proponemos que se justifica para investigar los papeles de la
Dicer
y
Drosha
en la susceptibilidad al cáncer de vejiga.
Hasta ahora, varios estudios han investigado la asociación entre las variantes genéticas de la
Dicer
y
Drosha
genes y el riesgo de enfermedades. Lin et al. informado de que el
Dicer
y
Drosha
haplotipos se asociaron con la supervivencia alterada y la recurrencia de carcinoma de células renales de pacientes en los caucásicos [25]. Sin embargo, las variantes genéticas de
Dicer
y
Drosha
no se asociaron con el desarrollo de carcinoma de células renales [26]. Además, Yang et al. También se observa el resultado similar del cáncer de vejiga en los caucásicos [27]. Recientemente, Qin et al. mostró que el
Dicer
y
Drosha
polimorfismos podrían modificar el riesgo de los parámetros seminales anormales y estar asociada con la infertilidad masculina china [28]. En su conjunto, la hipótesis de que las variantes genéticas de
Dicer
y
Drosha
también se puede asociar con la susceptibilidad al cáncer de vejiga en una población china.
Sobre la base de este postulado, se seleccionaron siete polimorfismos de
Dicer gratis (rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, y rs3742330AG) y
Drosha gratis (rs2291109AT, rs10719TC, y rs642321CT) para evaluar la asociación entre las variantes genéticas de
Dicer Opiniones y
Drosha
genes y el riesgo de cáncer de vejiga. En este estudio, se encontró que los
Drosha
3'UTR polimorfismo rs10719TC puede aumentar el riesgo de cáncer de vejiga en una población china, que se encuentra cerca de un sitio de unión miARN. Además, llevamos a cabo una serie de ensayos funcionales en
Drosha
3'UTR polimorfismos para revelar su mecanismo molecular.
Materiales y Métodos
Los sujetos del estudio
En el presente estudio, se incluyeron 685 histopatológico confirmó carcinoma transicional de vejiga y 730 controles sin cáncer. incluidos los sujetos de estudio fueron reclutados en el Primer Hospital Afiliado y Huai An-Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing, provincia de Jiangsu y el Hospital de Medicina Tradicional China (MTC) entre enero de 2003 y enero de 2010. El método detallado de los sujetos del estudio de reclutamiento para el estudio tenía han descrito anteriormente [29]. diagnóstico patológico de la etapa del tumor vesical fue de acuerdo a la 2002 Internacional Union Against Cancer-nodos del tumor metastásico clasi fi cación y la clasificación de la Organización Mundial de la Salud 1973 del papiloma urotelial se utilizó para definir el grado de cáncer de vejiga: bien diferenciado (grado 1, G1), moderadamente diferenciado (grado 2, G2) o pobremente diferenciado (grado 3, G3). pacientes con cáncer de vejiga fueron excluidos, si que tenía cáncer previo, metástasis del cáncer de otro origen, la radioterapia o la quimioterapia previa. Los sujetos sin cáncer fueron reclutados de los que estaban buscando la atención de salud en los departamentos de pacientes ambulatorios en el hospital. Los controles sin cáncer fueron emparejados por edad (± 5 años) y el sexo de los casos, que eran genéticamente no relacionadas con los casos y que no tenían antecedentes personales de cáncer, incluyendo el cáncer de piel no melanoma. Los sujetos sin cáncer que tenían síntomas sugestivos de cáncer de la vejiga, tales como hematuria, fueron excluidos. Se utilizó un cuestionario corto para obtener la información demográfica y los factores de riesgo de los sujetos incluidos. En este estudio, se definió alguna vez los fumadores (antiguas y actuales fumadores), según el estado de fumar. Los sujetos que fumaban al día durante & gt; 1 año, fueron definidos como fumadores cada vez. Nunca fumadores que habían dejado de fumar durante & gt; 1 año se definieron como ex fumadores y los otros como fumadores actuales. Este estudio de casos y controles fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad de Medicina de Nanjing. Todas las personas que firmaron consentimientos informados, y cada sujeto donaron 5 ml de muestra de sangre para la extracción de ADN genómico.
SNP selección y genotipado
En este estudio, se estudiaron las variantes genéticas de
Dicer
y
Drosha
genes, que desempeñan los papeles importantes en la biogénesis de miRNA. Aquí, nos centramos en el estudio de los polimorfismos de nucleótido único (SNP) que abarcan estos dos genes (HapMap datos de liberación de 27), incluyendo 2 kb aguas arriba y aguas abajo de 2 kb utilizando el software de Haploview [30]. Los siguientes criterios deben ser incluidos: (i) SNPs deben estar situados en la región flanqueante, 5 'UTR 5, 3'UTR, y la región con cambios de aminoácidos de codificación, (ii) menor frecuencia alelo (MAF) & gt; 5% de los chinos Han en Beijing (CHB). De acuerdo con los criterios, cuatro SNPs se identificaron en
Dicer gratis (rs12323635, rs13078, rs1057035, rs3742330 y) y tres SNPs en
Drosha gratis (rs2291109, rs10719, y rs642321).
ADN genómico fue extraído a partir de linfocitos de sangre periférica del sujeto. Las incluidos siete SNPs se genotipo en todos los 1415 sujetos utilizando el TaqMan MGB sonda de ensayo (7900HT real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Aproximadamente el 10% de las muestras fueron seleccionados al azar para el genotipado repetido para la validación, y los resultados fueron 100% concordantes. Genotipo análisis fue realizado por dos personas independientemente de una manera ciega y se incluyeron los controles en cada placa para asegurar la exactitud de la determinación del genotipo. Sin embargo, varias muestras fallaron en el genotipado se debieron a la calidad del ADN, y que excluirían a ellos en los análisis posteriores. La Tabla 1 proporciona la información primaria de los siete SNPs seleccionados.
Gen (no la adhesión.) Y el locus
rs NCBI no.
Posición
a
Ubicación y cambio de base
MAF
P Opiniones de HWE
c
tasa de Genotipado (%) guía empresas
HapMap
b
caso
Controles
Dicer gratis (NM_030621) 14q31rs1232363595625711promoterC>T0.3330.3760.3780.06798.2rs13078955567473’UTRT>A0.0560.0570.0610.13199.1rs1057035955541423’UTRT>C0.1110.1120.1100.741100.0rs3742330955533623’UTRA>G0.2670.3310.3320.25799.6
DROSHA
(NM_013235) 5p14-p13rs229110931532301promoterA>T0.2110.2190.2340.062100.0rs10719314014473’UTRT>C0.2330.2820.2430.43799.7rs642321314010033’UTRC>T0.4670.4740.5050.655100.0Table 1. La información primaria de SNPs genotipo.
Posición aSNP en NCBI dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).bMAF de las bases de datos de HapMap (http://www.hapmap.org) .cHWE
P valor
en el grupo control. Descargar CSV CSV
Bioinformática análisis de
Drosha
3'UTR
Con base en el análisis de la bioinformática, predijimos que hsa-miR-27a /b se puede unir con la región 3'UTR de
Drosha fotos: por medio de cuatro sitios web comunes (ciclo de destino: http://www.targetscan.org/~~number=plural, Miranda: http://www.microrna.org/~~number=plural, Microcosmos: http://www.ebi.ac objetivos .uk /Enright-srv /microcosmos /cgi-bin //v5 /genome.pl, y PITA: http://genie.weizmann.ac.il/~~number=plural) (Figura 1A). Se consideró que la combinación de estos enfoques reduciría en gran medida la posibilidad de falsos positivos.
(A) Drosha 3'UTR se predijo un sitio de unión para hsa-miR-27a /b. La secuencia de HSA-miR-27a y hsa-miR-27b sólo tenía una diferencia de base (subrayado). Escaneo de aproximadamente ± 100 pb regiones del sitio de unión, sólo se encontró que rs10719T & gt; C se encuentran en esta región. Predecir el efecto de la variación alélica en rs10719 sobre el reconocimiento b HSA-miR-27a /y el constructo de pGL3-Drosha 3'UTR-T /C que contiene Renilla gen de la luciferasa y de larga duración 3'UTR del gen Drosha con diferentes alelos de rs10719 ( flecha: T & gt; C sustitución). (B, C) los ensayos de reportero de luciferasa para medir rs10719T o C alelo diferencia con la presencia o la interferencia de hsa-miR-27a /b. En (B), las células T24 sembradas en placas de 24 pocillos fueron transitoriamente co-transfectadas con constructos y hsa-miR-27a /b imita o control negativo estable (Carolina del Norte). En (C), las células J82 sembradas en placas de 24 pocillos fueron transitoriamente co-transfectadas con constructos y hsa-miR-27a /b inhibidores o el inhibidor de Carolina del Norte. Los resultados se muestran como la actividad de luciferasa relativa frente NC. Los datos fueron de tres experimentos de transfección independientes.
**,
P Hotel & lt; 0.05.
cuantitativa en tiempo real PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
Con el fin de evaluar el nivel de expresión endógena de hsa-miR-27a /b, cuatro de vejiga líneas celulares de cáncer (EJ, T24, J82 y 5637) sembradas en 20 cm
2 placas se sometieron a la extracción del ARN total aislado de células usando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.). Tabla S1 S1 en el archivo de la información mostró cebadores de hsa-miR-27a /b y U6. Las reacciones de la transcriptasa inversa (10 l) contenía 2 l total de ARN (500 ng /l), 1 l de tampón 10 × AMV RT, 10 pmol de cada uno de los dNTP (Toyobo, Tsuruga, Japón), 0,75 l antisentido bucle mezcla de cebadores, 0,25 U /l RNasa inhibidor (Toyobo, Tsuruga, Japón), 1 U /l de la transcriptasa inversa de AMV. La mezcla se incubó a 16 ° C durante 15 min, 42 ° C durante 60 min, y 85 ° C durante 5 min. A continuación, Applied Biosystems 7900HT real PCR System Time se utilizó para realizar la cuantificación en tiempo real PCR (ABI, CA, EE.UU.), basado en el método SYBR-Green (Toyobo, Tsuruga, Japón). Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. Pliegan los cambios se normalizaron a los niveles de expresión de U6
Para la detección de la correlación entre los niveles
Drosha
ARNm y rs10719 T & gt;. C polimorfismo
in vivo
, un total de 61 tejidos tumorales de vejiga con diferentes genotipos (32 de TT, 24 para TC y 5 para los genotipos CC) se sometieron a la extracción del ARN total usando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.). tejidos tumorales de vejiga se conservaron en nitrógeno líquido después de haber sido retirado del cuerpo. El RNA total se evaluó tanto por reacción de la transcriptasa inversa y PCR en tiempo real cuantitativo basado en el método SYBR-Green (Toyobo, Tsuruga, Japón). El cDNA se utilizó para la amplificación de
Drosha
gen y un gen endógeno de control
GAPDH
. La información cebadores de
Drosha
y
GAPDH
genes fueron incluidos en la Tabla 1. Los cambios veces se normalizaron los niveles de expresión de
GAPDH
y cada ensayo se realizó por triplicado .
Drosha
3'UTR contiene rs10719TC construcciones del gen indicador y los ensayos de luciferasa
Para la construcción de los plásmidos informadores de luciferasa de
Drosha
3'UTR,
Drosha
fragmentos 3'UTR (937bp) que lleva el alelo mayor rs10719T se amplificaron por PCR. Los cebadores fueron 5'-ACCTTGGTACCCCAGATGAGACTGAAGACATC-3 '(hacia delante) y 5'-ACCTTCTCGAGGCACTCACTATATATTTGCTG-3' (hacia atrás). Los productos de PCR se extrajeron y se separaron por gel de agarosa, que se clonaron con TA Kit de clonación (Invitrogen, CA, EE.UU.). Además, el fragmento que contiene el alelo menor rs10719C se llevó a cabo usando los siguientes cebadores: 5'-TAGTTTTCCTGCAGACAATGAACGAAGTGTGC-3 '(hacia delante) y 5'-TTTATTTCAATGAGCACACTTCGTTCATTGTC-3' (inverso). Finalmente, se insertó el fragmento amplificado llevar a T o C alelo aguas abajo del gen de la luciferasa en un plásmido pGL3-promotor y luego se llevó a cabo el plásmido que contiene T o C alelo, que se confirmaron por secuenciación.
Para indicador de luciferasa ensayo, se colocaron las células T24 y J82 en placas de 24 pocillos (1 x 10
5 células por pocillo) y después se cotransfectaron con pGL3-
Drosha
3'UTR-T o pGL3-
Drosha
3'UTR-C y pRL-SV40 (50: 1). Los imitadores e inhibidores de hsa-miR-27a /b y sus controles negativos (GenePharma, Shanghai, China) se cotransfectaron con los plásmidos reportero en una concentración final de 20nmol /l. Cuarenta y ocho horas después de la transfección en células T24 y J82, la actividad de luciferasa en los lisados se midió con un sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega, WI, EE.UU.) y se normalizó contra la actividad de la PRL-SV40. Los ensayos se siguieron por las sugerencias del fabricante. tres experimentos independientes se realizaron para cada construcción de plásmido.
El análisis estadístico
El equilibrio de Hardy-Weinberg, de la distribución de los genotipos entre los controles se aplicó mediante el uso de una bondad de -FIT χ
2 prueba. La distribución de frecuencias de las variables demográficas seleccionadas entre los casos y controles se sometieron a pruebas de χ
2 test. odds ratios específicos de genotipo (OR) y sus intervalos de confianza del 95% (IC) se calcularon mediante análisis de regresión logística univariante y multivariante incondicional. El ajuste multivariado incluyó el estado de la edad, el sexo y el tabaquismo (nunca y haber fumado alguna vez). Además, Kruskal-Wallis ANOVA de una sola vía se utilizaron para el análisis de los resultados de
Drosha
la expresión de ARNm
in vivo
. En este estudio, la expresión del gen informador de luciferasa relativa de T o C alelo se calculó por separado. Se utilizó
t
de Student para evaluar las diferencias en los niveles de expresión de gen indicador de luciferasa entre los subgrupos. Todas las pruebas fueron de dos caras utilizando el software SAS (versión 9.1; SAS Institute, Inc, Cary, NC, EE.UU.) y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Estudio de asociación entre los polimorfismos de
Dicer
y
cáncer de vejiga Drosha
y el riesgo
las características de los pacientes 685 transicional de vejiga carcinoma de células y 730 controles se resumen en la Tabla 2. en este documento, no se observó diferencia estadística en la distribución de la edad (
P = 0,144
) y el sexo (
P
= 0,825) entre los pacientes y controles. Sin embargo, había más nunca fumadores (55,6%) entre los pacientes más que entre los controles (38,4%), y esta diferencia fue estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,001). Estas variables se ajustaron para el análisis de regresión logística multivariante posterior. De los 685 casos, había 315 grado del tumor 1 (46,0%), 261 el grado del tumor 2 (38,1%) y 109 el grado del tumor 3 (15,9%) pacientes. Además, 435 (63,5%) tenían tumores superficiales y restantes 250 (36,5%) tenían tumores invasivos.
Variables
casos (n = 685)
Controles (n = 730)
P
a
N
%
N
%
Edad ≤ 6532948.037951.90.144 & gt; 6535652.035148.1Sex Male55480.958780.40.825 Female13119.114319.6Smoking estado Never30444.445061.6 & lt; 0,001 etapa Ever38155.628038.4 Former17225.1729.9 Current20930.520828.5Tumor grado G131546.0 G226138.1 G310915.9Tumor superficial (pT
a-PT
1) 43.563,5 invasiva (pT
2-PT
4 ) 25036.5Table 2. distribución de frecuencias de las variables seleccionadas entre los casos de cáncer de vejiga y los controles sin cáncer.
ATwo unilateral χ
2-test para la distribución de frecuencias de las variables seleccionadas entre los casos de cáncer de vejiga y los controles sin cáncer Descargar CSV CSV
los siete frecuencias de genotipo SNP entre el control estaban de acuerdo con los equilibrios de Hardy-Weinberg (
P Hotel & gt; 0,05; Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 3, se observó que los sujetos con (genotipos CT y CC)
Drosha
3'UTR rs10719C alelo tenían un CI 1,24 veces más riesgo de cáncer de vejiga (OR ajustada = 1,25, 95% = 1,01 a 1,55,
P = 0,041
) en comparación con el genotipo rs10719TT. Mientras tanto, se observa que la distribución de los genotipos rs10719TC entre los casos y controles mostró diferencias significativas (
P = 0,017
). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en la distribución de genotipos de la
Dicer
rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, rs3742330AG y
Drosha
rs2291109AT, polimorfismos rs642321CT entre los casos y controles (todos los
P Hotel & gt; 0,05, Tabla 3). Además, evaluó el efecto de los incluidos siete polimorfismos en el riesgo de cáncer de vejiga mediante la estratificación por sexo y condición de fumador. Como se muestra en la Tabla S2 S1 en el archivo, se encontró que el polimorfismo rs10719TC puede aumentar el riesgo de cáncer de vejiga entre los pacientes del sexo masculino (OR ajustada = 1,34; IC del 95% = 1,05 a 1,70,
P = 0,018
), y para siempre los fumadores (OR ajustada = 1,56; IC del 95% = 1.14 a 2.14,
P
= 0,006).
genotipos
Casos Controles
crudo o (IC del 95% ): perfil OR ajustada (95% CI)
a
P
a
P
b
N
%
N
%
DICER
rs12323635CT680710CC26639.128640.31.00 (Referencia) 1,00 (referencia) 0.887CT32147.231143.81.11 (0.88-1.40) 1,09 (0.86-1.37) 0.485TT9313.711315.90.89 (0.64-1.22) 0,88 (0.63-1.22) 0.441CT /TT41460.942459.71.05 ( 0.85-1.20) 1,03 (0.83-1.28) 0.793rs13078TA679723TT60388.864088.31.00 (referencia) 1,00 (referencia) 0.640AT7511.17810.81.02 (0.73-1.43) 0,99 (0.70-1.39) 0.937AA10.250.70.21 (0,03-1,82 ) 0,30 (0,03-2,57) 0.271AT /AA7611.28311.50.97 (0.70-1.35) 0,95 (0.68-1.33) 0.768rs1057035TC685730TT54880.057779.01.00 (referencia) 1,00 (referencia) 0.857TC12017.514519.90.87 (0,67-1,14) 0,88 (0,67-1,16) 0.371CC172.581.102.34 (0.96-5.23) 2,36 (1.00-5.59) 0.051TC /CC13720.015321.00.94 (0.73-1.22) 0,96 (0.74-1.25) 0.753rs3742330AG683727AA30244.233145.51.00 (referencia ) 1,00 (referencia) 0.942AG31045.430942.51.10 (0.88-1.37) 1,09 (0.87-1.37) 0.437GG7110.48712.00.90 (0.63-1.27) 0,88 (0.61-1.25) 0.464AG /GG38155.839654.51.06 (0.86- 1,30) 1,05 (0.84-1.30) 0,686
Drosha
rs2291109AT685730AA42161.541957.41.00 (referencia) 1,00 (referencia) 0.332AT22833.328038.40.81 (0.65-1.01) 0,79 (0.63-0.99) 0.044TT365.3314.31. 16 (0.70-1.90) 1,20 (0.72-2.00) 0.482AT /TT26438.531142.60.85 (0.68-1.05) 0,83 (0.67-1.03) 0.098rs10719TC684727TT35251.541356.81.00 (referencia) 1,00 (referencia) 0.017TC27840.627537.81.19 (0,95-1,48) 1,20 (0,96-1,50) 0.116CC547.9395.41.63 (1,05-2,51) 1,61 (1,03-2,50) 0.036TC /CC33248.531443.21.24 (1,01-1,53) 1,25 (1,01-1,55) 0.041rs642321CT685730CC19728. 817624.11.00 (referencia) 1,00 (referencia) 0.107CT32647.637150.80.79 (0.61-1.01) 0,79 (0.61-1.02) 0.075TT16223.718325.10.79 (0.59-1.06) 0,78 (0.58-1.06) 0.112CT /TT48871.255475.90 0,79 (0,62-1,00) 0,79 (0.62-1.01) 0.056Table 3. las frecuencias genotípicas de los
Dicer
y
Drosha
SNPs entre los casos de cáncer de vejiga y de los controles y su asociación con el riesgo de cáncer de vejiga .
aAdjusted por edad, sexo y tabaquismo (nunca jamás) en la regresión logística prueba de chi-cuadrado model.bTwo unilateral para la distribución de frecuencia de los alelos (alelo menor frente al alelo principal). Descargar CSV CSV
Drosha
3'UTR rs10719TC afecta
Drosha
mediante la regulación de la expresión de unión
Con el fin de explorar el posible mecanismo de la HSA-miR-27b
Drosha
3'UTR en el riesgo de cáncer de vejiga, hemos realizado los ensayos funcionales. Con base en el análisis de la bioinformática, la
Drosha
3'UTR se predijo un sitio de unión para hsa-miR-27a /b (Figura 1A). Aquí, hemos demostrado que rs10719TC se encuentra aguas abajo de la 46bp hsa-miR-27a /b sitio de unión en el
Drosha
3'UTR.
Como se muestra en la Figura S1 S1 en el archivo, bienes -tiempo cuantitativa RT-PCR ensayo sugiere que los niveles de expresión endógena de hsa-miR-27a /b en la línea celular J82 fueron más significativamente mayor que otras células (T24, EJ, y 5637) (
P Hotel & lt; 0,001 ). A continuación, se optó por líneas de células J82 y T24 en el ensayo de luciferasa más. A continuación, se utilizaron los plásmidos para la cotransfección transitoria de las células T24 [estable de control negativo (CN) miARN: estable NC o hsa-miR-27a /b imita] y células J82 (inhibidor de NC o HSA-miR-27a /b inhibidor). Como se muestra en la Figura 1B (células T24), hsa-miR-27a /b suprimió la expresión de luciferasa en presencia de rs10719T alelo, en comparación con NC (
P
& lt; 0,05), pero no el alelo rs10719C (
P Hotel & gt; 0,05). Además, también se encontró que la inhibición de hsa-miR-27a /b expresión puede aumentar la expresión de luciferasa de manera eficiente para el plásmido que contiene rs10719T-lugar del plásmido que contiene rs10719C en células J82 (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 1C). Sin embargo, también se encontró que una disminución significativa en la expresión de la luciferasa, cuando añadimos inhibidor de hsa-miR-27a al alelo C en células J82. El resultado similar no se observa en la adición de inhibidor de hsa-miR-27b al alelo C en células J82. Tal vez, hsa-miR-27a no afectó directamente la expresión de luciferasa Drosha. Nuestros datos sugieren que rs10719 T para la sustitución de actos C como una mutación de pérdida de función y afectaría a la expresión de luciferasa Drosha por objetivo hsa-miR-27b.
En el presente estudio, también se realizó el ensayo de RT-PCR explorar si hsa-miR-27b afectó la expresión Drosha mediante la degradación de ARNm o la supresión de la traducción del mRNA después de la traducción (Figura S1 en el archivo S1). Un total de 61 tejidos tumorales de vejiga con diferentes genotipos de la
Drosha
polimorfismo rs10719TC se utilizaron para evaluar la expresión de
Drosha
mRNA. No se observaron niveles de diferencia significativa de
Drosha
ARNm entre los individuos con el TT, TC y genotipos CC (
P Hotel & gt; 0,05). Tomados en conjunto, hsa-miR-27b puede afectar a la expresión Drosha mediante la regulación de la traducción de proteínas.
Discusión
En el presente estudio, se investigó la asociación entre polimorfismos de siete
Dicer
y
Drosha
riesgo genes y el cáncer de vejiga en una población china, y se identificó que el polimorfismo rs10719TC adyacente al sitio de unión de HSA-miR-27b
Drosha
3'UTR se asoció con un aumento significativo de la riesgo de cáncer de vejiga. Los ensayos funcionales indicaron que
rs10719 Drosha
sustitución de T por C puede disminuir la actividad de unión de HSA-miR-27b con
Drosha
3'UTR.
Drosha es un miembro de superfamilia RNasa III y es una nucleasa importante que ejecuta el paso inicial en el procesamiento de miRNA cortando pri-miARN pre-miARN [31]. RNA de interferencia de Drosha dio lugar a la acumulación de pri-miARN y la reducción de la pre-miARN y ARN maduro [31]. Hasta ahora, varios grupos han estudiado el papel de
Drosha
en el cáncer [32,33]. Se ha informado de que
Drosha
genotipo TT rs644236 y rs7737174 genotipo AA se asocia con el riesgo de cáncer de mama en mujeres postmenopáusicas [32].
Drosha
rs10719 3'UTR está en fuerte desequilibrio de ligamiento con rs644236 en base a los datos de un millar de genomas (r
2 = 0,88) [33]. En el presente estudio de asociación, se encontró que los
Drosha
polimorfismo 3'UTR rs10719TC se asoció con el riesgo de cáncer de vejiga. El análisis estratificado demostró que rs10719TC genotipos /CC pueden aumentar significativamente el riesgo de cáncer de vejiga, especialmente entre los hombres y los fumadores. Una posible explicación es que el fumar cigarrillos se ha establecido como el factor de riesgo más importante en el desarrollo de cáncer de vejiga, que contiene cientos de productos químicos, tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos [34,35]. Por lo tanto, fumadores nunca pueden ser propensos a tener cáncer. Otra razón podría ser que, en comparación con la hembra, las personas de sexo masculino tienen más probabilidades de quedar expuesto a factores de riesgo ambientales acumulados implicados en la etiología del cáncer de vejiga, tales como el tabaquismo, la exposición ocupacional (es decir, la fabricación de colorantes, trabajos en cuero). Además, tenemos el tamaño de la muestra relativamente pequeña de las personas de sexo femenino. Por lo tanto, no podemos detectar la asociación significativa en las personas de sexo femenino. Weng et al. También propuso que rs10719TC polimorfismo se relaciona con el riesgo de tumor maligno de la vaina nerviosa periférica, que apoya nuestros resultados [33]. Más de expresión de Drosha se muestra para efectuar la proliferación celular y pronosticado mal pronóstico en cáncer de esófago [36], cáncer de ovario [37], cáncer de mama [38], y el cáncer cervical [39]. Anterior estudio también reveló que más de expresión de Drosha puede promover la proliferación de las células e inhibir la apoptosis de las células en el cáncer de vejiga [24]. Por lo tanto, la hipótesis de que
Drosha
rs10719C alelo 3'UTR puede aumentar el riesgo de cáncer de vejiga, principalmente a través de la regulación de la expresión de Drosha.
Se ha propuesto que parte de la 3'UTR polimorfismos pueden estar en el sitio de unión de los genes miARN o en las proximidades del sitio de unión y pueden interferir con la función de los genes miARN que conduce a la expresión diferencial de genes que afectan el desarrollo del cáncer [19,20]. Nuestros luciferasa reportado ensayos de gen indicaron que
rs10719 Drosha
T a C sustitución frustrado un sitio de unión para hsa-miR-27b, dando como resultado el aumento de los niveles de
Drosha
expresión de luciferasa 3'UTR. Por lo tanto, el alelo C está asociado con un mayor riesgo de cáncer de vejiga, potencialmente a través de aumento de la expresión Drosha, que era consistente con el hallazgo anterior [24]. Por otra parte, no hubo diferencias significativas de la
se observó Drosha
nivel de expresión de ARNm entre los diferentes genotipos rs10719TC en los tejidos tumorales de vejiga utilizando el ensayo de RT-PCR. Estos resultados sugieren que el SNP no afecta a la expresión de ARNm, sin embargo, dado que los genes miARN unión a mRNAs no siempre conduce a la escisión transcripción, y algunas veces conduce a la represión de traducción, es posible que el SNP conduce a un cambio en la proteína Drosha. Sin embargo, no hemos probado esto en nuestro estudio, y por lo tanto sigue siendo una posibilidad, pero no está probado. Estos datos sugirieron que hsa-miR-27b puede afectar a la expresión Drosha mediante la regulación de la traducción de proteínas. Que valía la pena hacer notar que nuestros resultados funcionales estaban de acuerdo con los resultados de un estudio de casos y controles
.
En el presente estudio, hsa-miR-27b se informó en primer lugar, para regular la expresión de
Drosha Hoteles en el cáncer de vejiga. Hsa-miR-27b se ha estudiado ampliamente, que había sido identificado como correlación con muchos tipos de cánceres, como el cáncer de colon [40], neuroblastoma [41]. Lee et al.