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PLOS ONE: leche fermentada por Propionibacterium freudenreichii induce la apoptosis de HGT-1 células de cáncer gástrico humano

2015/6/18


Extracto

Antecedentes

El cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes en el mundo. El estilo de vida "países económicamente desarrollados", incluyendo la dieta, constituye un factor de riesgo a favor de este tipo de cáncer. modulación de la dieta puede reducir la incidencia de cáncer digestivo. Entre los componentes alimenticios prometedores, se muestran propionibacterias lácteos para activar la apoptosis de células de cáncer de colon humano, a través de la liberación de cadena corta de ácidos grasos de etilo y propionato.

Metodología /Principales conclusiones

A la leche fermentada , fermentado exclusivamente por
P. freudenreichii
, fue diseñado recientemente. En este trabajo, el potencial pro-apoptótica de esta nueva leche fermentada se demostró en las células de cáncer gástrico humano HGT-1. Fermentada sobrenadante leche indujo características típicas de la apoptosis, incluyendo condensación de la cromatina, formación de cuerpos apoptóticos, escalera de ADN, la detención del ciclo celular y la aparición de una población subG1, la exposición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática, la acumulación de especies reactivas del oxígeno, el potencial transmembrana interrupción mitocondrial, caspasa activación y la liberación del citocromo c. Sorprendentemente, esta nueva leche fermentada que contiene
P. freudenreichii
mejorado la citotoxicidad de camptotecina, un fármaco utilizado en la quimioterapia del cáncer gástrico.

Conclusiones /Importancia

Esta nueva leche fermentada probiótica por lo tanto puede ser útil como parte de una dieta preventiva para prevenir el cáncer gástrico y /o como un complemento alimenticio para potenciar los tratamientos terapéuticos del cáncer

Visto:. primo FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) leche fermentada por
Propionibacterium freudenreichii
induce la apoptosis de HGT-1 células de cáncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 15 Noviembre 2011; Aceptado: January 19, 2012; Publicado: 19 Marzo 2012

Derechos de Autor © 2012 Cousin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Consejo Regional de Bretaña a través de la llamada développement CBB para proyectos y por el Centro Nacional Interprofesional de la Economía Lechera (CNIEL) a través del Comité Científico de Syndifrais convocatoria de proyectos. La investigación en el grupo IRSET fue apoyado por becas de la Liga Nacional Contra el Cáncer (Côte d'Armor, Ille y Vilaine, Morbihan, Vendée y Comités Sarthe), INSERM, Universidad de Rennes 1 y la Región de Bretagne. FJC recibió una subvención del CNIEL (beca de doctorado). SJL fue apoyada por la Asociación para la Investigación sobre el Cáncer (beca de doctorado). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

dieta modula el riesgo de desarrollar cáncer gástrico

el cáncer es la principal causa de muerte en los países económicamente desarrollados como resultado de estilos de vida asociados con el cáncer como el tabaquismo, la inactividad física, y "occidentalizada" dieta [ ,,,0],1]. De hecho, el papel de la dieta en el desarrollo del cáncer está fuertemente apoyado por estudios epidemiológicos, en particular con respecto a los cánceres del tracto digestivo. El cáncer gástrico (CG) representa el tercer tipo de cánceres letales para los hombres en el mundo. En 2008, se estimó que 640.600 casos de CG, causando 464.400 muertes en todo el mundo [1]. Esta enfermedad es particularmente frecuente en el este de Asia y en Europa central y oriental. Los factores etiológicos más importantes que intervienen en la carcinogénesis gástrica son la dieta y
Helicobacter pylori
infección. Pruebas sustanciales, principalmente de estudios de casos y controles, sugiere que el riesgo de contraer GC se incrementa en un alto consumo de alimentos salados, en salmuera o ahumados, tradicionalmente, así como pescado y carne seca. Por el contrario, las fibras, verduras frescas y fruta, tal vez debido a su contenido de vitamina C, se encontró que se asocia inversamente con el riesgo de CG [2], [3]. El impacto de los componentes naturales /comida en la carcinogénesis del estómago por lo tanto se ha investigado durante las últimas décadas [4] - [6]. Entre estos, los probióticos y su capacidad para inhibir el desarrollo de cáncer atraído el interés científico [7], [8]. Un probiótico se define generalmente como "un microorganismo vivo que, cuando se administra en cantidades adecuadas, confieren un beneficio de salud al host" [9]. Mientras que algunos microorganismos como
H. pylori
pueden favorecer GC, otros pueden tener un efecto beneficioso en la prevención de cánceres digestivos. En particular, las cepas seleccionadas de bacterias probióticas pueden limitar el desarrollo del cáncer en modelos animales de carcinogénesis [10]. Esto se evidenció en particular para el cáncer de colon mientras que se sabe menos sobre los posibles efectos de los probióticos en GC. Una posible explicación mecanicista de tal efecto de protección es la
in situ
liberación de metabolitos anti-cancerígenos tales como ácidos grasos de cadena corta (AGCC).

ácidos grasos de cadena corta inducir la apoptosis de las células cancerosas

SCFA, incluyendo acetato, propionato y butirato, son aniones importantes del contenido intestinal y su concentración pueden ser moduladas por la dieta. Se les enseñó a jugar un papel clave en importantes funciones fisiológicas incluyendo la modulación de la proliferación de células epiteliales equilibrio /apoptosis digestivo. Esto implica la detención mediada por SCFA del ciclo celular, la inhibición de la histona desacetilasa y la estimulación de la apoptosis en células transformadas, pero también la estimulación de la diferenciación en las células sanas [11], [12]. También se ha informado de que el butirato y propionato AGCC tanto inducir la apoptosis en líneas celulares de carcinoma gástrico humano [13] - [15]. La apoptosis es una regulación del número de células proceso fisiológico natural, lo que permite y constituye un objetivo para la quimioterapia anti-cáncer [16]. La apoptosis permite el agotamiento de las células cancerosas de una manera "limpia". Las células cancerosas se fragmentan en una reacción en cadena coordinada y los residuos son absorbidos por los tejidos adyacentes y el sistema inmunológico [17], [18]. Dos principales vías de apoptosis se han descrito: la vía extrínseca, que está mediada por la activación de receptores de muerte y la caspasa 8, y la vía intrínseca, en el que las mitocondrias y caspasa 9 están involucrados [16]. En general, en las células cancerosas, la función apoptótica es deficiente, lo que puede explicar su proliferación sostenida y en consecuencia la formación de tumores. La capacidad de inducir la apoptosis de las células cancerosas es así reconocida por su potencial terapéutico [16]. Desde propionibacterias lácteos son capaces de producir AGCC pro-apoptóticos beneficiosos, pueden ser útiles en la prevención o el tratamiento del cáncer.


Propionibacterium freudenreichii
puede favorecer el agotamiento de apoptosis de las células cancerosas digestivos

Esta propionibacterium lácteos probióticos ha demostrado inducir la muerte celular de las diferentes líneas celulares de cáncer de colon humano a través de la inducción de la apoptosis, en co-cultivos [19]. Los compuestos activos, secretada en el medio, activan la vía apoptótica mitocondrial intrínseca en células de cáncer colorrectal humano cultivadas. En particular, los AGCC acetato y propionato liberados por
P. freudenreichii
inducir apoptosis actuando sobre el translocador de nucleótidos de adenina mitocondrial, causando mitocondrias despolarización y permeabilización, las fugas del citocromo c y la activación de caspasa [19], [20]. Sin embargo, los sobrenadantes propionibacterianos son todavía más pro-apoptóticos que el acetato y el propionato de AGCC, usado a las concentraciones medidas en los sobrenadantes, lo que sugiere que otros compuestos pueden estar implicados en este efecto. cepas de
P seleccionado. freudenreichii
permanezca vivo y metabólicamente activa en el intestino de los seres humanos y de ratas microbiota asociada humanos donde producen AGCC [21], [22]. En consecuencia, se demostró que aumenta la apoptosis en las células epiteliales del colon transformadas de tales ratas alimentadas con el carcinógeno 1,2-dimetilhidrazina (DMH), pero no en el control de los sanos [23]. Propionibacterias podría constituir probióticos favorecen la profilaxis del cáncer de colon, siempre que lleguen a su destino vivo y metabólicamente activa. En este contexto, el vector, o vehículo de suministro probiótico, se demostró que para determinar la supervivencia propionibacterias y la actividad [21], [24], [25]. productos lácteos complejas como el yogur y el queso, en particular, protegen propiónicas de la tensión, pero contienen una mezcla compleja de bacterias. Por lo tanto, no es posible atribuir el efecto beneficioso de una cepa particular.

Una leche fermentada se evaluó como vehículo de entrega propiónicas en este contexto

En este estudio, hemos utilizado un nuevo grado alimenticio leche fermentada que contiene sólo
P. freudenreichii
como único microflora. Como este producto contiene tanto propionibacterias vivos y sus metabolitos activos, debe llevarlos en contacto con la mucosa gástrica cuando se ingiere. Esta leche fermentada se investigó con respecto a HGT-1 gástrica células de cáncer de la inducción de apoptosis humano. De hecho, se sabe que bacterias propiónicas para matar células cancerosas de colon humano pero su efecto en células de cáncer gástrico es desconocida. La leche fermentada mató células HGT-1 de una manera tiempo y dependiente de la dosis. Se observaron las características típicas del proceso de apoptosis, incluyendo la caída de viabilidad, condensación de la cromatina, formación de cuerpos apoptóticos ', escalera de ADN, la producción de ROS, la perturbación potencial de membrana mitocondrial, activación de caspasas, la detención del ciclo celular y la aparición de una población subG1.

resultados


P. freudenreichii leche fermentada
mata gástrico humano y las células de cáncer de colon


P. freudenreichii
ITG P9 creció en 72 horas a 30 ° C en la leche suplementada y que será completada ultrafiltrado de leche para alcanzar población final de 9,43 log
10 unidades formadoras de colonias (ufc) /ml y 9,35 log
10 ufc /ml, respectivamente. Las concentraciones de SCFA eran acetato de 26,21 mM y propionato mM 54,47 (2,08 propionato /relación de etilo) en el sobrenadante de leche fermentada mientras que eran 24,00 mM y 53.32 mM (relación 2,22) en el sobrenadante ultrafiltrado de leche fermentada. Se esperaba que estas relaciones para propionibacterias, que en general producen el doble de propionato como acetato de [26]. Otros doce cepas Propionibacteria lácteos de calidad alimentaria también fueron probados (véase la Tabla S1 y Figura S1). El uso de estas cepas, se obtuvieron doce leches fermentadas. Las concentraciones de propionato variaron de 36 a 67 mm y poblaciones Propionibacteria de 9,0 a 9.7 log
10 ufc /ml, para los menos y para la cepa más eficiente, respectivamente.

El potencial citotóxico de los sobrenadantes prepara a partir de la leche o ultrafiltrado de leche, tanto fermentada por
P. freudenreichii
ITG P9, se investigó. 29 HT-células humanas del cáncer de colon y células de cáncer gástrico humano HGT-1 fueron tratados con estos sobrenadantes. Se probaron diferentes diluciones que van desde ½ a. Además, la citotoxicidad de una mezcla de 15 etilo y 30 mM propionato mM se puso a prueba, en concentraciones cercanas a sobrenadantes de estos ½ diluidas. Como controles positivos de la inducción de la apoptosis, la camptotecina medicamentos de quimioterapia (4 M) y etopósido (100 M) se utilizaron para las células HGT-1 y HT-29, respectivamente. Se compararon tres métodos distintos de monitorización muerte celular. Como se muestra en la Figura S2, azul de metileno, MTT y ensayos de exclusión de azul de tripán dieron una cinética similar de la muerte. En consecuencia, se usó un ensayo de azul de metileno en este estudio para evaluar aún más la viabilidad celular. Los productos lácteos no fermentados (leche o la leche ultrafiltrado) no tuvo ningún efecto, ni el HT-29, ni sobre HGT-1 viabilidad celular (Fig. 1 A, B). El sobrenadante de leche o leche fermentada por ultrafiltrado
P. freudenreichii
indujo una citotoxicidad similar en una manera dependiente del tiempo en células HGT-1 HT-29 y, y cerca de la citotoxicidad inducida por fármacos o por la mezcla de etilo /propionato. matanza mitad de la máxima de las células HGT-1 se produjo después de 24 h y 26 h de tratamiento con la leche fermentada y la leche fermentada sobrenadantes ultrafiltrado respectivamente, después de 17 h de tratamiento con camptotecina y después de 24 h de tratamiento con la mezcla de SCFA (Fig. S3) . Además, la citotoxicidad de los sobrenadantes de productos lácteos fermentados en células HGT-1 era dependiente de la dosis (Fig. 1C). Para cada dilución a prueba, la caída de la HGT-1 viabilidad celular inducida por la leche fermentada o el ultrafiltrado de leche fermentada era muy similar (Fig 1C & amp;.. Fig S3). Es por eso que los próximos pasos del estudio se llevaron a cabo sólo con el sobrenadante ultrafiltrado de leche fermentada. Tomados en conjunto, estos datos indican que propionibacterias matan eficiente de colon humano y células de cáncer gástrico, al menos en parte a través de la producción de propionato y acetato de (Fig. 1). Algunas otras leches fermentadas, fermentados por diferentes cepas Propionibacteria lácteos, mostraron efectos citotóxicos sobre las células cancerosas similares (Tabla S2).
P. freudenreichii
ITG P9 siendo conocida por su actividad metabólica
in vivo
[22], la correspondiente leche fermentada se estudió más.

(A) Efecto de
P. freudenreichii
leche fermentada en las células de cáncer colorrectal humano HT-29. células HT-29 se trataron con una dilución ½, en DMEMc, de los sobrenadantes obtenidos a partir de leche fermentada o fermentada ultrafiltrado de leche (cuadrados). Como controles negativos, las células se trataron con ½ diluciones de leche no fermentada o leche ultrafiltrado (diamantes). Como controles positivos (triángulos), las células se trataron con DMEMc que contiene una mezcla de acetato y propionato (C2 /C3, 15/30 mM) o etopósido (100 M). (B) Efecto de
P. freudenreichii
leche fermentada en HGT-1 en las células de cáncer gástrico humano. células TGH1 se trataron con una dilución ½, en DMEMc, de los sobrenadantes obtenidos a partir de leche fermentada o fermentada ultrafiltrado de leche (cuadrados). Como controles negativos, las células se trataron con ½ diluciones de leche no fermentada o leche ultrafiltrado (diamantes). Como controles positivos (triángulos), las células se trataron con DMEMc que contiene una mezcla de acetato y propionato (C2 /C3, 15/30 mM) o camptotecina (4 M). (C) dependencia de la dosis de efecto citotóxico de leche fermentada. células HGT-1 fueron tratados con diferentes diluciones del sobrenadante obtenido de la leche (símbolos vacíos) o la leche ultrafiltrado (símbolos lisos) tanto fermentada por
P. freudenreichii
. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de azul de metileno después de diferentes períodos de tratamiento. El porcentaje de viabilidad se calculó usando la siguiente fórmula: 100 (valores de densidad óptica de las células tratadas /valores de densidad óptica de las células no tratadas) ×. Los resultados son los valores medios de tres experimentos.


P. leche fermentada freudenreichii
induce marcas típicas de apoptosis en células de cáncer gástrico humano

morfología núcleo de las células HGT-1 se incubaron en presencia de
P. freudenreichii
ultrafiltrado de leche fermentada se analizó mediante microscopía de fluorescencia después de Hoechst 33342 tinción (Fig. 2A). La fluorescencia nuclear de las células no tratadas (control) se mantuvo sin cambios durante el curso de tiempo del experimento con núcleos normales azul (tiempo 0 h, Fig. 2Aa). Durante el tratamiento, las células HGT-1 muestran los condensados ​​características de la cromatina y los núcleos fragmentados de núcleos apoptóticos (Fig. 2Ab, c), seguido por la aparición de cuerpos apoptóticos a las 72 h (Fig. 2AD). la fragmentación del ADN inter-nucleosomal que resulta en escalera de ADN, una marca típica de la apoptosis [27], también fue monitoreado durante el tratamiento ultrafiltrado de leche fermentada. la fragmentación de ADN se observó a partir de 24 h de tratamiento con fermentada ultrafiltrado de leche (Fig. 2B), y en menor medida con camptotecina (Fig. S3). contenido de ADN también se cuantificó por citometría de flujo después del marcaje con yoduro de propidio para estudiar el impacto de fermentada ultrafiltrado de leche en HGT-1 distribución del ciclo celular (Fig. 2C). Sin tratar células HGT-1 presentan una distribución del ciclo celular (Fig. 2Ca) sin fase subG1, que se mantuvo sin cambios durante el curso de tiempo del experimento (datos no mostrados). El porcentaje de células en fase subG1, indicativo de un proceso de apoptosis, aumentó significativamente con el tiempo durante fermentado tratamiento ultrafiltrado de leche (Fig 2cb, Cc, Cd.): A las 24 h (39,24 ± 4,87%), a las 48 h (91,63 ± 0,28 %) y a las 72 h (94,79 ± 0,45%). A las 48 h y 72 h de tratamiento, todas las células estaban en la fase del ciclo celular subG1, indicando la muerte completa de las células HGT-1. Como control, la camptotecina induce apoptosis características similares en HGT-1 en las células (Fig. S4).

(A) La leche fermentada condensación nuclear ultrafiltrado inducida. Se cultivaron las células (0 h) o tratados para 24, 48 o 72 h con una dilución ½ de
P. freudenreichii
leche fermentada ultrafiltrado sobrenadante (UF). Las células fueron teñidas con Hoechst 33342 antes de la microscopía de fluorescencia. Las flechas indican condensación de la cromatina (b), la fragmentación nuclear (c) y la formación de cuerpos apoptóticos (d). (B) La leche fermentada ultrafiltrado inducida por la fragmentación del ADN en las células HGT-1. El ADN genómico se extrajo y se analizó en gel de agarosa al 1%. células HGT-1 se trataron como en (A). (C) la leche ultrafiltrado cambios inducidos por fermentados en la distribución de fase del ciclo celular. contenido de ADN de las células HGT-1 se analizó por citometría de flujo después de tinción con yoduro de propidio. Se muestran histogramas representativos correspondientes al análisis de contenido de ADN de las células HGT-1. El porcentaje de la población de células con contenido de ADN sub-G1, indicativo de apoptosis, se indica. Proporción de cada subconjuntos de células (sub-G1, G0 /G1, S, G2 /M), dentro de la población total de células, se muestra para cada momento del tratamiento. Los resultados son valores medios de tres experimentos independientes ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, las células tratadas frente al control (0 h). La distribución de las fases del ciclo celular de las células no tratadas (control) se mantuvo sin cambios durante todo el experimento.

Para confirmar la inducción de la apoptosis, la translocación phosphatdylserine desde el interior hacia el exterior prospecto de la membrana plasmática se evaluó mediante tinción HGT-1 en las células con una combinación de Anexina V-FITC (AV) y 7-AAD, seguido por citometría de flujo análisis de fluorescencia (Fig. 3). Las células no tratadas (0 h) presentan una alta proporción de células vivas (AV
- /7AAD
-; 92%) y sólo el 5% de las células fueron teñidas con anexina V (figura 3B.). Estos porcentajes determinados en las células no tratadas no cambió durante el curso de tiempo del experimento (datos no mostrados). Durante el tratamiento de células HGT 1 con ½ diluida ultrafiltrado de leche fermentada en DMEMc, el porcentaje de células teñidas únicamente por 7-AAD (necrosis indica) fue muy baja (Fig. 3B). Sin embargo, los porcentajes de células teñidas con anexina V se incrementaron significativamente de una manera dependiente del tiempo y alcanzó el 80% a las 72 h (Fig. 3B). Por lo tanto, las células HGT-1 sufrió la apoptosis después del tratamiento con
P. freudenreichii
fermentado ultrafiltrado de leche, caracterizado por primera tinción positiva AV, lo que indica la exposición de fosfatidilserina, y luego ambos AV y tinción 7-AAD positivo, lo que indica una pérdida posterior de integridad de la membrana. Como control, la camptotecina induce apoptosis características similares (Fig. S5).

Citometría de flujo análisis cinético de la muerte celular en las células HGT-1 tratados con
P. freudenreichii
fermentado ultrafiltrado de leche. se muestra (A) un experimento representativo de Anexina V /7-AAD tinción de las células HGT-1 en cada momento del tratamiento, con proporciones de Anexina V células positivas (AV +, células apoptóticas). (B) Quantitative FACS análisis de Anexina V-FITC (AV) unión a células HGT-1 se realizó después de la contratinción con 7-aminoactinomicina-D (7AAD). Los valores presentados corresponden a la proporción de cada uno subconjuntos de células, dentro de la población total de células, para cada tiempo de tratamiento. Los resultados son valores medios de tres experimentos independientes ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01, las células tratadas frente al control (0 h) guía empresas
Como AGCC actúan directamente sobre las mitocondrias, también se determinaron tres parámetros mitocondriales importantes: el potencial ΔΨm interior de la membrana, y la generación de ROS, el uso de dos sondas fluorescentes, DIOC (6) 3 (que es ΔΨm sensible) y DHE (que detecta O
2
- nivel), y la localización de citocromo c. Las células no tratadas (0 h) mostraron una alta fluorescencia (alta ΔΨm) y una fluorescencia DHE baja (baja producción de O
2
-) (Fig. 4A, B). Después del tratamiento con fermentada ultrafiltrado de leche, (3) se observó una disminución dependiente del tiempo en la incorporación de DiOC6 sonda fluorescente, revelando una pérdida de ΔΨm y despolarización de la membrana mitocondrial, por tanto, (Fig. 4A). Los porcentajes de células tratadas HGT-1 con disminución de potencial de membrana interior aumentado de una manera dependiente del tiempo para alcanzar 96% de las células en 72 h. tratamiento FCCP se utilizó como control positivo de la despolarización de la membrana mitocondrial. Esta pérdida de ΔΨm se confirmó mediante la pérdida característica de la fluorescencia roja después de JC-1 tinción (Fig. 4B). En cuanto a la producción de ROS en las células HGT-1, la acumulación inducida por el tratamiento ultrafiltrado de leche fermentada de O
2
-, de manera significativa a las 48 hy 72 h de tratamiento (Figura 4C.). Esta acumulación de ROS se puede prevenir parcialmente si las células se tratan previamente por el captador de TEMPOL ROS (Fig. S6). El citocromo c de la mitocondria liberación al citoplasma celular es un evento clave del programa de apoptosis. Immunoblotting examen de las fracciones citoplasma enriquecida por la presencia de citocromo c confirmó un cambio en su localización subcelular (Fig. 4D). El citocromo c se detectó en la fracción de citoplasma enriquecida de 24 h de tratamiento, lo que indica la reubicación de esta proteína (Fig. 4D). Esta relocalización de citocromo c en el citoplasma se confirmó mediante inmunotinción, que muestra la inmunotinción difusa en toda la célula después del tratamiento, mientras que la tinción puntuada antes del tratamiento (Fig. 4E).

El análisis cinético de los eventos mitocondriales en las células tratadas HGT-1 con
P. freudenreichii
fermentado leche ultrafiltrado (A) La citometría de flujo análisis de la cinética de la disipación de la membrana mitocondrial interna (ΔΨm) con Dioc (6) 3 tinción. se muestra una vista de superposición de un experimento representativo. El FCCP de desacoplamiento (50 M, 20 min) se utilizó como control positivo. Se muestran los análisis cuantitativos de la pérdida ΔΨm en 3 experimentos independientes. Los valores se representan como una proporción de células con bajo ΔΨm, dentro de la población total de células, para cada tratamiento. Los resultados son valores medios de tres experimentos independientes ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, tratados frente al control (0 h). (B) células HGT-1 se tiñeron con JC-1. La pérdida de potencial de membrana mitocondrial está indicada por la pérdida progresiva de la red-JC-1-agregado de fluorescencia y difusión citoplásmica de fluorescencia monómero verde (C) La citometría de flujo análisis cinético de anión superóxido (O
2
-) acumulación con la tinción de DHE. se muestra una superposición de un experimento representativo de la detección de ROS en cada momento del tratamiento. Las células se tiñeron con dihydroethidium y se analizaron por citometría de flujo. La menadiona prooxidante (Men., 100 M, 15 min) se utilizó como control positivo. Los valores se representan como una proporción de células con un aumento de ROS (aumento de la intensidad de la fluorescencia), dentro de la población total de células, para cada tratamiento. Los resultados son valores medios de tres experimentos independientes ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, tratados frente al control (0 h). (D) El citocromo c reubicación durante todo el período de tratamiento con
P. freudenreichii
fermenta la leche ultrafiltrado sobrenadante ½ fue evaluada por Western blot. Después del tratamiento de células, las fracciones citoplasma-Enrich se analizaron por transferencia de Western y revelaron usando un anticuerpo anti-citocromo c. Los anticuerpos dirigidos contra Hsc-70 se utilizaron como control de carga. (E) Localización subcelular de citocromo c. Las células fueron immunostained con anticuerpos anti-citocromo c, después de la tinción MitoTracker y antes de la tinción de ADN usando A-PRO 3. La flecha indica la difusión del citocromo c en el citoplasma.


P. freudenreichii
leche fermentada activa las caspasas

Para confirmar los mecanismos de apoptosis inducida por la fermentación de la leche ultrafiltrado en las células HGT-1, el procesamiento de las caspasas 3, 8 y 9 se analizó por Western Blot y la supervisión efectuada actividades enzimáticas en HGT extractos de células -1 (Fig. 5). El ultrafiltrado de leche no fermentada no indujo la activación de caspasa en células HGT-1: sólo las proformas de la caspasa-3 y -9 se detectaron en Western blot (Fig. 5A) y ninguna actividad caspasa se midió (Fig 5B.). El sobrenadante fermentado ultrafiltrado de leche, así como la camptotecina o la mezcla de propionato y acetato en una proporción molar [2: 1], inducida por la escisión de pro-caspasa 3 y la generación de las formas activas de la caspasa-3, las subunidades p17 y p12 (Fig. 5A). La activación de la caspasa-3, que es una caspasa efectora, confirmó la inducción de la apoptosis. Además, fermentado ultrafiltrado de leche indujo la escisión de la procaspasa 9, dando lugar a los 35 y 37 kDa formas procesadas. Caspasa-8 no se detectó en las células HGT-1 no tratados de control. Sin embargo, el tratamiento con sobrenadantes propionibacterianos o mezcla /C3 C2 condujo a una clara detección de la proforma 54 kDa, seguido por su escisión después de 48 h de tratamiento.

Procesamiento de la caspasa efectora 3 e iniciador caspasas 8 y 9 se seguido de Western Blot y monitoreo actividades enzimáticas específica en células HGT-1. (A) Las proformas y subunidades escindidas de la caspasa 3, 8, y 9 se detectaron por transferencia de Western en lisados ​​de células HGT-1 tratados con
P. freudenreichii
leche fermentada ultrafiltrado sobrenadante ½. leche no fermentada ultrafiltrado (UF ½, 48 h), una mezcla de acetato y propionato (C2 /C3, 15/30 mM, 48 h) y camptotecina (4 M, 48 h) se utilizaron como controles. Los anticuerpos dirigidos contra Hsc-70 se utilizaron como control de carga. (B) Las caspasas actividades específicas de lisados ​​de células tratadas como arriba se estudiaron usando péptidos indicados y calculado como se describe en materiales y métodos. Los resultados son valores medios de tres experimentos ± sd. *
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La cuantificación de la caspasa-3, actividades enzimáticas -8 y -9 confirmaron la activación de caspasas por ambos metabolitos propionibacterianos y por camptotecina. De hecho, se activan las caspasas-9 y -3 en las primeras etapas del tratamiento, mientras que la caspasa-8 activa parecía más tarde (Fig. 5B). La camptotecina y la mezcla SCFA activan todos los tres caspasas estudiados. Estos datos confirmaron la activación de la vía intrínseca de la apoptosis mediante el tratamiento ultrafiltrado de leche fermentada, con una activación temprana de la caspasa-9 y después de la caspasa-3 y -8.


P. leche freudenreichii
fermentada aumenta la citotoxicidad de camptotecina

camptotecina es un alcaloide citotóxico de quinolina que inhibe la enzima topoisomerasa I de ADN (topo I) y se utiliza ampliamente en el tratamiento quimioterapéutico de GC. Hemos demostrado anteriormente que los metabolitos propionibacterianos inducen apoptosis en las células HGT-1 a través de la vía de la muerte mitocondrial. A continuación estudiamos la apoptosis inducida por la combinación de ambos camptotecina y fermentada ultrafiltrado de leche en células HGT-1. Aumento de las concentraciones de camptotecina (0, 0,25, 0,5, 1, 2 M) en combinación con mayores concentraciones de fermentada ultrafiltrado de leche (0,, ⅛, ¼) se ensayaron en HGT-1 la viabilidad celular y tanto la pérdida inducida de HGT-1 viabilidad , de una manera dependiente de la dosis (Fig. 6). Por otra parte, la adición de ultrafiltrado fermentado de leche aumentó significativamente la citotoxicidad de la camptotecina en células HGT-1 (Fig. 6). Por ejemplo, 0,25 M camptotecina y fermentada ultrafiltrado de leche se diluyeron hasta ⅛ llevado a una pérdida de viabilidad de 8,6% y 18,6%, respectivamente. La combinación de estos dos compuestos dio lugar a una pérdida de la viabilidad celular de 29,8% (Fig. 6), lo que sugiere un efecto de citotoxicidad añadido cuando camptotecina se combinó con fermentada ultrafiltrado de leche en células HGT-1. En consecuencia, el índice de combinación (CI), calculado como anteriormente [28], tiene un valor de 1, lo que indica un efecto aditivo de la camptotecina y fermentada tratamientos ultrafiltrado de leche.

Viabilidad de la HGT-1 de cáncer gástrico humano tratado durante 24 h se evaluó por el ensayo de azul de metileno. células HGT-1 se trataron con diferentes concentraciones de camptotecina (0 a 2 mM) junto con diferentes diluciones de
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leche fermentada ultrafiltrado sobrenadante (UF). El porcentaje de viabilidad se calculó mediante la siguiente fórmula: 100 (valores de densidad óptica de las células tratadas valores /ópticos de densidad de las células no tratadas) x. Los resultados son valores medios de tres experimentos ± sd. *
P
& lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01, las células tratadas frente a los controles (misma concentración de camptotecina sin fermentado sobrenadante ultrafiltrado de leche y misma dilución ultrafiltrado de leche fermentada sobrenadante sin camptotecina)

Discusión

Una nueva leche fermentada, conteniendo
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como una única bacteria, fue desarrollado con el fin de investigar más a fondo el potencial probiótico de este preparado lácteo de bacterias propiónicas (revisado en [29]). En este estudio, mostramos que la fase acuosa de esta leche fermentada mata de colon humano y células de cáncer gástrico a través de metabolitos, incluyendo propionato y acetato, dadas a conocer por esta bacteria. Esta noción se basa en los efectos citotóxicos observados de
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fermenta la leche sobrenadantes de las células cancerosas HGT-1 HT-29 y se cultivaron. Este efecto se obtuvo con sobrenadantes de ultracentrifugación, es decir, la fase acuosa de la leche fermentada, desprovistos de caseínas y de las bacterias, lo que demuestra que los compuestos activos se secretan, como se describe previamente para propionibacterias [19]. Por esta razón, la mayoría de los experimentos en este trabajo se realizaron con fermentada ultrafiltrado de leche (Fig. 1). Hemos demostrado por primera vez que
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fermentado apoptosis sobrenadante leche inducida de células HGT-1 de una manera tiempo y dependiente de la dosis con la aparición de las características morfológicas y bioquímicas clásicas de la apoptosis (condensada y fragmentada cromación, escalera de ADN y la acumulación de células en el ciclo celular subG1 fase).

Nos parecía entonces, si los mecanismos celulares implicados en HGT-1 vía de la muerte celular fueron similares a la vía mitocondrial de muerte desencadenada en células Caco-2 y HT-29 células de cáncer de colon humano por
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sobrenadantes de cultivo DMEMc [19], [20]. Los eventos sub-celulares y bioquímicos observados en las células tratadas HGT 1 con fermentada ultrafiltrado de leche fueron similares y se incluyen, por lo menos, la pérdida ΔΨm mitocondrial, ROS (O
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-) la generación, el procesamiento de las caspasas y la activación, el citocromo c reubicación en el citoplasma (Fig. 3, 4, 5). Fermentada sobrenadante leche procesamiento y la activación de la caspasa-8 induce, además de las caspasas -3 y -9. MEGABYTE.

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