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PLOS ONE: línea celular de cáncer NCI60 datos de panel y Ayuda Análisis RNAi Identificar EAF2 como modulador de la simvastatina y lovastatina respuesta en células HCT-116


Extracto

La simvastatina y lovastatina son las estatinas utilizadas tradicionalmente para bajar los niveles de colesterol sérico. Sin embargo, existe evidencia que indica sus características potenciales de quimioterapia en el cáncer. En este estudio, hemos utilizado el análisis bioinformático de los datos a disposición del público con el fin de identificar sistemáticamente los genes implicados en la resistencia a los efectos citotóxicos de estos dos fármacos en el panel de línea celular NCI60. Se utilizaron los datos farmacológicos disponibles para todas las líneas celulares NCI60 para clasificar las líneas celulares resistentes y sensibles simvastatina o lovastatina, respectivamente. A continuación, hemos realizado pruebas de asociación de casos y controles marcador individuales de todo el genoma para la lovastatina y células resistentes y sensibles simvastatina utilizando sus datos genómicos Affymetrix 125K SNP disponibles públicamente. Los resultados se evaluaron a continuación, utilizando la metodología de RNAi. Después de la corrección de la
p-
valores para múltiples pruebas utilizando False Discovery Rate, nuestros resultados identificaron tres genes (
NRP1
,
COL13A1
,
MRPS31
) y seis genes (
EAF2
,
ANK2
,
AKAP7
,
STEAP2
,
LPIN2
,

) asociada con la resistencia a la simvastatina y lovastatina, respectivamente. validación funcional utilizando RNAi confirmó que el silenciamiento de
EAF2
expresión modulada la respuesta de las células HCT-116 de cáncer de colon a ambos estatinas. En resumen, hemos utilizado con éxito los datos disponibles al público sobre las líneas celulares NCI60 para realizar estudios de asociación de todo el genoma de simvastatina y lovastatina. Nuestros resultados indican genes implicados en la respuesta celular a estas estatinas y siRNA estudios confirman el papel de la
EAF2
en respuesta a estos fármacos en células HCT-116 de cáncer de colon

Visto:. Savas S , Azorsa DO, Jarjanazi H, Ibrahim-Zada I, Gonzales IM, Arora S, et al. (2011) línea celular de cáncer NCI60 panel de datos y Ayuda Análisis RNAi Identificar EAF2 como modulador de la simvastatina y lovastatina respuesta en células HCT-116. PLoS ONE 6 (4): e18306. doi: 10.1371 /journal.pone.0018306

Editor: Eric Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América

Recibido: 27 de julio 2010; Aceptó 3 de marzo de 2011; Publicado: 4 Abril 2011

Derechos de Autor © 2011 Savas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de los fondos de investigación institucional TGen y una beca de la fundación contra el cáncer de próstata (H. Ozcelik). Y.H. Choi es apoyado por una beca de la Fundación de Cáncer de Mama de Canadá - Ontario capítulo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

La simvastatina y lovastatina son dos estatinas utilizadas tradicionalmente para bajar los niveles de colesterol sérico. Las estatinas son inhibidores reversibles de la enzima microsomal HMG-CoA reductasa, que convierte la HMG-CoA a mevalonato. Este es un paso limitante de la biosíntesis del colesterol. En los seres humanos, la inhibición de la HMG-CoA reductasa por las estatinas disminuye la biosíntesis de colesterol intracelular, que a su vez conduce a la producción transcriptionally upregulated de reductasa y de la superficie celular receptores de LDL microsomal HMG-CoA reductasa. Sin embargo, la simvastatina y lovastatina difieren en algunos aspectos importantes en relación con el grado de metabolismo y el número de los metabolitos activos e inactivos [1]. Más recientemente, las estatinas han ganado aviso significativa como agentes anticancerosos basados ​​en evidencia preclínica de su antiproliferativo, propiedades proapoptóticos, anti-invasivos y radiosensibilizadores [2], [3], [4], [5], [6]. El papel de las estatinas en el metabolismo del colesterol puede explicar sus características potenciales citotóxicos.

El colesterol es un lípido clave que se acumula en la membrana micro-dominios llamados balsas lipídicas. Las balsas de lípidos desempeñan un papel importante en la transducción de señal que activa el crecimiento celular, la supervivencia y muchos otros procesos que están correlacionados con el cáncer. la acumulación de colesterol en los tumores se ha demostrado por una serie de estudios en el pasado [7], [8], [9], [10]. La acumulación de colesterol dentro de la balsa de lípidos micro-dominios de la membrana plasmática puede jugar un papel en la estimulación de las vías de transducción de señales. Freeman y Solomon (2004) han propuesto que el aumento de colesterol en la membrana de las células tumorales de próstata, que puede resultar de un aumento en los niveles circulantes o de la desregulación de la síntesis endógena, dar lugar a la fusión de los dominios balsa [7]. Esto a su vez podría tener un efecto sobre la segregación de los reguladores positivos de la señalización oncogénica en balsas, manteniendo reguladores negativos en la fracción de membrana mosaico fluido [7]. Se propuso además que el estudio de la función de las balsas de lípidos en las células de cáncer de próstata podría proporcionar información sobre el papel de colesterol circulante en el crecimiento maligno y en la posible relación entre la dieta y la enfermedad agresiva. Por lo tanto, la caracterización de las proteínas dentro de los dominios micro ricas en colesterol puede servir para aclarar mejor las vías de señalización, lo que conducirá a la identificación de nuevos biomarcadores para la progresión de la enfermedad y nuevos objetivos para la terapia del cáncer.

Variable respuesta al tratamiento farmacológico , tales como la resistencia, es un problema de salud grave. Varios factores, como la edad y la dieta, están implicados en la resistencia quimioterapéutico al influir en la adsorción de drogas, transporte, metabolismo, y sus acciones fisiológicas. Los factores genéticos también están implicados en la resistencia a fármacos. Por ejemplo, las variaciones genéticas que causan alteraciones en la función del gen y la expresión están implicados en la resistencia a fármacos [11], [12]. Por lo tanto, para una óptima eficacia del tratamiento, es necesario conocer los genes asociados con la resistencia a los medicamentos, así como sus perfiles en cada uno (medicina personalizada) del paciente. En este sentido, el panel de línea celular NCI60 forma una prometedora herramienta para descubrir nuevos fármacos contra el cáncer. El panel de la línea celular NCI60 se establece a partir de una variedad de tumores con el fin de identificar los compuestos que pueden matar las células del cáncer [13]. Hasta el momento, este panel línea celular ha sido expuesto a más de 100.000 compuestos diferentes y las respuestas celulares en forma de tasas de crecimiento se han medido. El uso de líneas celulares NCI60, L-asparaginasa fue identificado como eficaz en matar a un subconjunto de carcinomas de ovario [14]. Este panel también fue utilizado en el desarrollo de bortezomib para el tratamiento de mieloma [13].

Los resultados experimentales obtenidos en las líneas celulares NCI60 se compilan en el Developmental Therapeutics Program (DTP) página web [13]. Además de los datos farmacológicos mencionados anteriormente, otros datos para NCI60 líneas celulares está disponible en el sitio web de DTP, tal como los genotipos de los polimorfismos de nucleótido único chip de Affymetrix 125K (SNP). plataforma de chip Affymetrix 125K SNP tiene un conjunto denso de SNPs (~124,000) y se utiliza para identificar las regiones genómicas que están asociados con predisposición a la enfermedad y la respuesta al tratamiento variable. Anteriormente, hemos utilizado los datos de la línea celular NCI60 para investigar los genes de resistencia a fármacos en el genoma humano [15], [16], [17]. En este estudio, nos aprovechamos de tanto los datos farmacológicos y genómicos disponibles en las líneas celulares NCI60 para identificar los genes asociados con la resistencia citotóxico para simvastatina y lovastatina y realizamos estudios funcionales utilizando siRNA para validar
EAF2
como un modulador de la actividad de estatinas.

Materiales y Métodos

lovastatina y simvastatina NCI60 líneas celulares resistentes y sensibles

Nos han seguido un modelo desarrollado previamente para realizar el de casos y controles de todo el genoma estudio de asociación [15], [16], [17]. En resumen, hemos utilizado los datos disponibles al público en el panel de línea celular NCI60 publicado en el sitio web del Programa de Desarrollo Terapéutica (DTP) del NCI /NIH (http://dtp.nci.nih.gov/index.html). En primer lugar, hemos descargado el IG
50 datos (la cantidad de los medicamentos necesarios para inhibir el crecimiento en un 50%) a la dosis de 10
-4.5 M para las líneas celulares. A continuación, se categorizaron las células como relativamente resistente o sensible después de la normalización en el registro
10 de GI
50 para obtener una media de cero y una desviación estándar de uno como se describe anteriormente [15], [16], [17] . El GI estandarizado
50 valores a continuación, se analizaron por el SAS 9.1 (PROC UNIVARIADO) con una prueba de distribución no paramétrica (estimación kernel densidad) con anchos de banda estimado de 0.2476 y 0.2896, así como la media asintótica integrados errores cuadráticos (AMISE) de 0,0224 y 0,0172, para simvastatina y lovastatina, respectivamente. Los Antimodes visuales se utilizaron como punto de corte en el -0,2 y -0,3 para la simvastatina para la lovastatina para definir sensibles (controles) y (casos) NCI60 células resistentes (Figura 1). En el caso de la simvastatina, había 19 sensible y 32 líneas celulares resistentes en el panel (Tabla S1). Hubo 16 sensible y 41 líneas celulares resistentes en el panel NCI60 de lovastatina (Tabla S2).

La función de densidad mostró dos modos principales de cada medicamento. Los Antimodes visuales se utilizaron como punto de corte en el -0,2 y -0,3 para la simvastatina para la lovastatina para definir líneas celulares NCI60 sensibles y resistentes.

Whole Genome-Estudio de casos y controles Asociación

descargado los datos de Affymetrix SNP 125K (que tenía aproximadamente 124.000 SNPs espaciados con una distancia media de 8,5 kilobases intermarker) desde el sitio web de DTP (http://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html) [ ,,,0],18]. Todo el genoma asociación pruebas de casos y controles individuales para el marcador de lovastatina y simvastatina células resistentes y sensibles se realizó mediante el software PLINK [19] mediante la prueba de chi-cuadrado estándar. Sólo los SNPs que se han genotipo en al menos 75% de las células y tenía un alelo menor frecuencia mínima de 2% (n = 79 622) se incluyeron en este estudio y se utilizaron para la prueba de asociación. Con el fin de disminuir la posibilidad de que las asociaciones de falsos positivos, una corrección de múltiples ensayos,
es decir
. la tasa de falso descubrimiento (FDR), propuesto por Benjamini y Hochberg (FDR_BH) [20] También se realizó mediante el software PLINK. Los resultados con p

valores. & Lt; 0,05 se consideró significativo

relacionado con lugares del genoma (génica
frente
intergénica) Información de SNPs fueron recuperados ya sea desde la base de datos dbSNP [21 ] o por la voladura de las secuencias que flanquean-SNP en contra del genoma humano y mediante la visualización utilizando la opción NCBI Visor de mapas [22].

Epistasis (Interacción SNP-SNP) Análisis

modelos de regresión logística para el análisis de dos vías interacciones entre los SNPs asociados individualmente con simvastatina o lovastatina resistencia, asumiendo un modelo aditivo para cada SNP. Para las pruebas de interacciones SNP-SNP, se utilizó el enfoque de la prueba de razón de verosimilitud comparando el ajuste de dos modelos, uno con sólo los efectos principales de SNP y el otro con los efectos principales y efecto de la interacción de dos vías. Los correspondientes valores de p fueron ajustados para múltiples pruebas por el método FDR_BH [20].

Cell Cultura y
Las líneas celulares de cáncer de colon humano HCT-116 y HT-29 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). HCT-116 es una línea celular de carcinoma colorrectal tumorigénico establecida a partir de un tumor primario [23]. HT-29 es una línea celular de adenocarcinoma de colon de grado II establecida a partir de células de tumor primario [24]. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 IU /ml de penicilina G, y 100 mg /ml de estreptomicina. Todos los reactivos de los medios se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las líneas celulares se mantuvieron rutinariamente a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera.

Validación funcional de lovastatina y simvastatina sensibilización

Para siRNA y los estudios de drogas, se transfectaron células con siRNA por transfección inversa en placas de 384 pocillos tal como se describe anteriormente [25]. En pocas palabras, siRNA se imprime sobre placas de 384 pocillos en un volumen de 2 l. Se añadió reactivo diluido siLentFect (BioRad, Hercules, CA) en OptiMEM (Invitrogen) a los pocillos y se dejó en complejo con siRNA de 30 min a temperatura ambiente. HCT-116 o células HT-29 se resuspendieron en medio de crecimiento sin antibióticos y se añadieron a las placas a una concentración final de 1000 células /pocillo. Las placas se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2. Después de 24 horas, variando concentraciones que varían de 12 nM a 667 mu M de cualquiera de lovastatina o simvastatina se añadieron a las placas de ensayo y se incubaron durante 72 horas adicionales. Número total de células viables se determinó mediante la adición de Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI) y las unidades relativas de luminiscencia (RLU) se midieron usando un lector de placas Envision (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). efecto del fármaco se calculó dividiendo la media de los valores de RLU para los pocillos tratados con el fármaco por el promedio de los valores de RLU para pozos tratados con vehículo. El IG
50 valores se determinaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) y los valores se muestran como GI calculado intervalo de confianza
50 +/- 95%. El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando dos colas pareada
t de Student
.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo

Validación de silenciamiento génico por cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR)

El ARN total de las líneas celulares fue aislado utilizando RNEasy de Qiagen Kit de Qiagen Inc. (Valencia, CA). La concentración de ARN se determinó usando NanoDrop-1000 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. iScript cDNA Synthesis Kit de Bio-Rad Inc. (Hercules, CA) se utilizó para preparar cDNA a partir de 500 ng de cada muestra. la expresión de ARNm relativa se mide usando ensayos de expresión TaqMan Gene de ABI Inc. (Foster City, CA) en condiciones recomendadas por el fabricante en el sistema 2 Opticon PCR (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Cuantificación relativa de la expresión génica se llevó a cabo por triplicado. qPCR reacciones se prepararon en placas de 96 pocillos qPCR formato de Bio-Rad (Hercules, CA). Las reacciones se prepararon en singleplexes, triplicados de cada muestra con triplicados de controles endógenos, y controles sin plantilla (NTC). La normalización se realiza en la presencia de un gen de referencia, GAPDH, y la cuantificación relativa de los cambios de expresión génica se analizaron usando el método de ΔΔCt [26], [27].

Resultados

Genome estudios de asociaciones de ancho del panel NCI60 de lovastatina y simvastatina respuesta

el uso de los datos de detección del cáncer NCI60 de simvastatina y lovastatina, las líneas celulares fueron clasificados como relativamente sensible o resistente (Figura 1). Los resultados obtenidos de los estudios de asociación de casos y controles de todo el genoma de simvastatina y lovastatina se resumen en las Tablas 1 y 2, respectivamente. Ocho SNP estaban asociados con la resistencia a la simvastatina. Estos SNP estaban localizados en los cromosomas 8q, 9p (dos SNPs), 10p, 10q, 13q (dos SNPs) y 14p. Cinco de los SNPs se localizaron en regiones intergénicas, mientras que los tres SNP restantes se encuentran en los intrones de genes conocidos (Tabla 3), es decir, el intrón 6 de
NRP1
(neurofilina), el intrón 37 de
COL13A1
(tipo XIII colágeno, alfa 1), y el intrón 6 de
MRPS31 gratis (proteína ribosomal mitocondrial S31). Dos SNP rs4129864 intergénicas, y rs1343844 estaban situados muy cerca (7387 pares de bases de distancia el uno del otro), lo que sugiere que eran susceptibles de ser vinculados entre sí.

En el caso de lovastatina, un total de 25 SNPs se asociaron con su resistencia. Seis de estos SNP estaban localizados en los genes conocidos o previstos (Tablas 2 y 3): en el intrón 5 de
EAF2 gratis (ELL asociado factor 2), en el intrón 2 de
ANK2 gratis (anquirina neuronal 2), en el intrón 1 de
AKAP7 gratis (proteína quinasa a proteína de anclaje 7), en el intrón 4 de
LPIN2 gratis (Lipin 2), en el intrón 2 de
STEAP2
(antígeno epitelial de seis transmembrana de la próstata 2), y en el intrón 11 del
PARVB gratis (parvin beta).

a continuación, estudiamos una posible interacción SNP-SNP para la simvastatina y lovastatina resistencia SNP conjuntos utilizando el análisis de regresión logística y no ha detectado ninguna interacción genética estadísticamente significativa suponiendo modelo genético aditivo después de los ajustes FDR_BH. Sin embargo, teniendo en cuenta el pequeño tamaño de la muestra, sino que también debe tenerse en cuenta que nuestro estudio no tenía potencia suficiente, por lo tanto, estos resultados deben ser interpretados con cautela. Pathway análisis no identificó la interacción directa entre los productos proteicos de los genes en las listas de simvastatina o lovastatina.

Los estudios funcionales identifica EAF2 como un modulador de lovastatina y simvastatina

Con el fin de probar la validez de los resultados positivos GWAS, hemos realizado estudios funcionales. Nos centramos en los SNPs situados en regiones intrónicas (de) los genes implicados en la simvastatina (3 SNP) y lovastatina (6 SNPs) de resistencia (Tablas 1 y 2). Una extensa búsqueda en la literatura no reveló consecuencias funcionales conocidas de estos SNPs en la expresión génica o la función de las proteínas. Por lo tanto, las relaciones biológicas directas entre estos SNPs y resistencia a la simvastatina y lovastatina seguían siendo desconocidos. Sin embargo, ya que nuestros resultados GWAS han indicado una asociación de estos genes con resistencia a la simvastatina o lovastatina, la hipótesis de que las funciones de estos genes fueron de alguna manera relacionado con la resistencia a fármacos. Bajo esta hipótesis, en la regulación de la expresión de genes invierte la resistencia observada y hace que estas células sensibles a estos fármacos de nuevo, lo que resulta en un aumento de la toxicidad celular y la muerte (Figura 2). Por lo tanto, hemos realizado la respuesta al fármaco y el silenciamiento de genes utilizando estudios de metodología de ARNi en líneas celulares de cáncer de dos de colon HCT-116 y HT-29, los cuales fueron seleccionados ya que se incluyeron en el NCI60 ajustado, así como por su buena eficacia de la transfección y su respuesta a los dos estatinas. Sobre la base de los datos de respuesta de drogas DTP, nuestro análisis clasificado HCT-116 como relativamente resistentes a la simvastatina (Tabla S1); Sin embargo, los datos de la lovastatina no estaba disponible para esta línea celular. Por otro lado, HT-29 se encontró que era relativamente resistente a ambos simvastatina y lovastatina (Tablas S1 y S2). Inicialmente, las dos líneas celulares fueron tratados con siRNA dirigidos a genes identificados en nuestro análisis seguido de tratamiento con dos dosis bajas de simvastatina o lovastatina, lo que indica cuatro de los genes,
MRPS31
,
COL13A
,
EAF2
,
AKAP7
como posibles moduladores de la respuesta a los fármacos (datos no mostrados).

no hay relación biológica entre la resistencia a los medicamentos y los genes /SNPs identificados en el GWAS estudio fue previamente identificado. Por lo tanto, en el presente documento la hipótesis de que si se requieren las funciones de estos genes para la resistencia a estos fármacos, a continuación, tirando hacia abajo su expresión génica utilizando siRNAs interrumpirá la función de los genes, que revertir la resistencia y hacer que las células sensibles a estas drogas de nuevo. (A) La línea celular de tumor es resistente a la exposición a la droga. (B) Tras el tratamiento con siRNA a los objetivos de genes candidatos, además de la droga, que predice que la línea celular tumoral podría sensibilizarse a la droga que lleva a un aumento de muerte celular. Este modelo se basa en la hipótesis de que se requiere la función de genes específicos para la resistencia a los medicamentos.

Nuevos estudios de respuesta a la dosis del fármaco se realizaron utilizando dúplex de siRNA dirigidos
MRPS31
y
COL13A
, que se asocia con la resistencia a la simvastatina, y
EAF2
y
AKAP7
, que se asocia con la resistencia a la lovastatina. Estos genes fueron silenciados por siRNA y tratados con diferentes dosis de simvastatina o lovastatina que van desde 12 nM a 667 mM. El silenciamiento de
MRPS31
,
AKAP7
y
COL13A
no afectó a la respuesta a cualquiera de los fármacos en las condiciones experimentales aplicadas (datos no mostrados), mientras que el silenciamiento de
EAF2
redujo significativamente el GI
50 de simvastatina y células HCT-116 tratados con lovastatina, y por lo tanto reduce la resistencia de esta línea celular a estos fármacos (Figura 3). Para las células HCT-116 tratados con simvastatina y siRNA, el GI
50 (con 95% límites de confianza) pasaron de 8,6 +/- 0,3 M durante no silenciar siRNA (control negativo) a 2,5 +/- 0,2 M y 3,3 +/- 0,3 M durante EAF2_1 y EAF2_4 siRNA, respectivamente. Del mismo modo, para las células HCT-116 tratadas con lovastatina la GI
50 pasaron del 20,1 +/- 0,9 M para no silenciar siRNA a 4,3 +/- 0,5 M y 6,5 +/- 0,5 M durante EAF2_1 y EAF2_4 siRNA, respectivamente . Además, eficiente transfección siRNA se demostró en ambas líneas celulares desde el control letal siRNA reducción de la viabilidad en más de un 98% en todos los ensayos (Figura S1). Sin embargo, el silenciamiento de
EAF2
¿No sensibilizar a las células HT-29 a simvastatina o lovastatina (Figura 1). Estos resultados sugieren que la baja regulación de
EAF2
expresión puede modular la respuesta celular a ambos fármacos para reducir el colesterol en las células HCT-116 de cáncer de colon

células HCT-116 (A & amp;. C ) y células HT-29 (B & amp; D) fueron transfectadas con siRNA dirigidos a
EAF2 fotos: por transfección inversa. A las 24 horas, las células fueron tratadas con dosis variables de simvastatina (A & amp; B) o lovastatina (C & amp; D) que van desde 12 nM a 667 mM. Se determinó el número de células a las 72 horas de exposición al fármaco utilizando celular Titulación Glo. El silenciamiento de
EAF2
con siRNA específico afectado significativamente la respuesta de las células HCT-116 en comparación con el control no silenciar siRNA (
p & lt; 0,0002
tanto para EAF2_1 y EAF2_4 siRNAs demostrado por *) a dosis 2,7 mM y 8,2 mM.

La eficacia del silenciamiento génico por siRNAs EAF2_1 y EAF2_4 se confirmó usando los experimentos de qPCR y se muestra en la Figura 4A. A pesar de HCT-116 células mostraron sensibilización a la combinación de
EAF2
silenciamiento y estatina tratamiento, mientras que las células HT-29 no lo hicieron, ambas líneas celulares mostraron niveles similares de expresión de
EAF2
demostrando que la diferencia en la respuesta no era debido a la diferencia en el nivel basal de
EAF2
expresión (Figura 4B). Por otra parte, siRNA silenciamiento de
EAF2
en ambas líneas de células tuvo un efecto mínimo sobre la viabilidad celular en comparación con los controles no tratados y la no silenciar ARNsi de control (Figura 5). Tomados en conjunto, estos datos y el cambio en las curvas de respuesta de dosis producidas por
EAF2
silenciamiento en las células HCT-116 indican que el silenciamiento
EAF2
potencia el efecto de las estatinas inducida por citotoxicidad.

(a) ARN total fue aislado de las células HCT-116 transfectadas durante 48 horas con siRNA dirigidos a
EAF2 gratis (EAF2_1 y EAF2_4), no silenciar siRNA o las células no tratadas. se muestran veces las diferencias relativas en
EAF2
niveles de mRNA en comparación con las células tratadas siRNA no tratados y no silenciar. (B) qPCR análisis de la expresión relativa de EAF2 en HCT-116 y las células HT-29 muestra una expresión similar.

HCT 116 células y células HT-29 (1000 células /pocillo) fueron transfectadas con el reverso siRNA control y
EAF2
siRNA dirigidos. La viabilidad celular se determinó a las 96 horas usando celular Titulación Glo y leído por luminiscencia. Los datos se representan como porcentaje de viabilidad en comparación con las células no tratadas ARNsi.

Discusión

Nuestro estudio representa el primer estudio de asociación con base sistemática y de todo el genoma de simvastatina y lovastatina, dos estatinas son candidatos prometedores como fármacos citotóxicos en el cáncer. En este estudio, nos aprovechamos de los datos farmacológicos y genéticos de libre acceso y completas sobre el panel de línea celular NCI60 para identificar genes candidatos que están asociados con la resistencia a la simvastatina y lovastatina en el genoma humano. Nuestros resultados demuestran la asociación de distintos conjuntos de genes con resistencia a estos dos fármacos. Hemos validado funcionalmente más de un gen diana,
EAF2
, el uso de siRNAs para demostrar que su expresión puede modular la respuesta celular a estos dos fármacos en la línea celular HCT-116.

A todo el genoma SNP estudio de asociación basada identificó tres genes asociados con la resistencia simvastatina (Tabla 3). Uno de estos genes,
NRP1
codifica para un receptor unido a membrana que tiene papeles en la angiogénesis, la guía de axones, la supervivencia celular, la migración, la invasión y la respuesta inmune. NRP1 también se une a SEMA3, cuya actividad está modulada por las balsas de lípidos [28]. Otro gen asociado con la resistencia simvastatina fue
COL13A1
, que codifica para la cadena alfa del colágeno no fibrilar un situado en la membrana plasmática. Aunque su papel biológico exacto no se ha caracterizado, sin embargo, la proteína COL13A1 se encuentra en las estructuras adhesivas de tejidos y se cree que participan en la adhesión celular, la migración y el desarrollo óseo [29]. Por último,
MRPS31
codifica para una proteína ribosomal mitocondrial que interviene en la síntesis de proteínas en la mitocondria y se asocia con la diabetes de tipo I [30].

En el caso de la resistencia a la lovastatina, nuestro análisis indica la asociación de seis genes (Tabla 3). Uno de estos genes era
EAF2
, que es un gen andrógeno-respuesta asociada con los hombres del factor de elongación de la transcripción /ELL y se requiere para una variedad de funciones celulares, tales como el desarrollo de los ojos y la supresión del crecimiento y la inducción de la apoptosis [31], [32]. Recientemente,
Eaf2
knockout en un modelo de ratón se asoció con neoplasia de pulmón, hígado y próstata, así como linfoma de células B [33]. Curiosamente, nuestros resultados muestran claramente que el silenciamiento de
EAF2
disminuye la GI valores
50 de HCT-116 células de cáncer de colon, no sólo para la lovastatina, simvastatina, sino también. Este efecto no se observó en la otra línea celular de cáncer de colon HT-29 y esto podría ser debido a la heterogeneidad genética entre las dos líneas celulares. Otro gen asociado con la resistencia a la lovastatina fue
ANK2, España que codifica para una de las tres ankyrins que están implicados en la localización de las proteínas en la membrana.
ANK2
es fundamental para la función normal del corazón y sus mutaciones son una de las causas de la arritmia congénita [34].
AKAP7
codifica para un miembro de la A-quinasa familia de proteínas de anclaje (AKAP) que ancla el AMPc dependiente de la proteína quinasa A a compartimentos subcelulares específicos [35]. Por otro lado,
LPIN2
es uno de los tres genes lipin. LPIN 1 está implicado en el desarrollo del tejido adiposo [36]. Aunque el papel biológico exacto de este gen no se conoce, cuando muta, este gen causa el síndrome de Majeed, un trastorno autoinflamatoria [37]. Además,
STEAP2
, que codifica una proteína de membrana de múltiples pasadas que se localiza en el complejo de Golgi, la membrana plasmática, y las estructuras tubulares vesiculares en el citosol, también se asoció con resistencia a la lovastatina en nuestro estudio. Recientemente se informó de una reductasa cúprico y el papel de la proteína ferrireductase STEAP2 [38]. Este gen está también implicado en el cáncer de próstata [39]. Por último,
PARVB
, un miembro de una familia de proteína de adhesión focal [40] que se une a la integrina-quinasa vinculadas [41], fue también encontrado asociada con la resistencia a la lovastatina. Es interesante observar que las dos listas de genes eran muy diferentes entre los dos estatinas, que son ambos inhibidores de la HMG-CoA reductasa. Sin embargo, los dos medicamentos no son idénticos y difieren en sus metabolitos [42] y sus efectos citotóxicos [43], [44], lo que puede explicar estos resultados. El efecto citotóxico mediado por las estatinas podría implicar objetivos distintos de HMG-CoA reductasa, como la vía de la proteína morfogénica ósea (BMP) tal como se describe por Kodach y colegas [43].

Se realizó experimentos de respuesta de silenciamiento de genes y medicamentos para poner a prueba la validez de nuestros resultados GWAS. En el caso de los tres genes,
MRPS31
,
COL13A
, y
AKAP7,
nuestros resultados no confirman que sus funciones biológicas están directamente relacionados con la resistencia a la simvastatina y lovastatina bajo nuestra hipótesis y las condiciones experimentales aplicadas. Esta discrepancia entre la GWAS y estudios funcionales se explica por la posibilidad de que estos genes pueden representar los resultados positivos falsos del análisis GWAS, o de las condiciones y la hipótesis aplicado no eran óptimas para detectar los efectos esperados. Alternativamente, estos SNPs pueden estar situados en una región genómica que afecta a la función de los genes distantes, que no se pueden probar usando nuestro enfoque. Por otro lado, nuestra amplia asociación del genoma indica la asociación de
EAF2
marcador 1.840.275 (rs2332056, rs4339143) con resistencia a la lovastatina únicamente después de la corrección con el FDR. En el caso de la simvastatina, este marcador se asoció con su resistencia (no ajustado
p Hotel & lt; 0,01), sin embargo, después de la corrección de múltiples ensayos, este significado se perdió. Sin embargo, nuestra evaluación funcional utilizando ARNsi mostró que el silenciamiento de
EAF2
no sólo era capaz de modular la respuesta a la lovastatina, sino también a la simvastatina en HCT-116 línea celular de cáncer de colon en las condiciones experimentales aplicadas (Figura 3). Esta discrepancia entre los resultados de estudio de asociación amplia del genoma y los experimentos de evaluación funcional puede explicarse ya sea por una asociación de falsos negativos del
EAF2
marcador en conjunto simvastatina, o mediante la utilización de diferentes condiciones experimentales (por ejemplo, dosis de drogas) en nuestros experimentos siRNA. Además, nuestros resultados también mostraron que
EAF2
silenciamiento no sensibilizar a otra línea celular de cáncer de colon, HT-29 (que se considera relativamente resistente a la simvastatina y lovastatina), lo que sugiere la presencia de una posible heterogeneidad en genética y mecanismos moleculares implicados en la resistencia a las estatinas. Curiosamente, HCT-116 es conocido por llevar un
K-RAS
mutación mientras HT-29 no [45]. Dado que las estatinas son inhibidores de la HMG-CoA reductasa que pueden conducir al bloqueo farneslyation de K-RAS y por lo tanto la activación de K-RAS, es posible que la realización de un mutante
K-RAS
puede contribuir a hacer HCT-116 las células más susceptibles a la combinación de
EAF2
silenciamiento y el tratamiento con estatinas. Se necesitan estudios adicionales para hacer frente a esta posibilidad.

Nuestra clasificación tanto para el HT-29 y HCT-116 es relativamente resistente se basa en la comparación de todas las líneas celulares en el panel NCI60. Se han reportado estudios anteriores sobre la respuesta a la simvastatina y lovastatina de varias de las líneas celulares NCI60. La línea celular de leucemia HL-60 se ha encontrado previamente a ser relativamente resistentes al tratamiento simvastatina (de una manera dependiente de la dosis) que su línea de células de todo-trans del ácido retinoico resistente derivado, HL-60-R2 [46]. Además, Martirosyan
et. al.
mostró que la línea de ovario cáncer de células, SKOV-3, cuando se trata con Lovastatin mostró una respuesta, pero no tanto como otras líneas de células incluyen en sus estudios, lo que sugiere que esta línea celular no es muy sensible al tratamiento lovastatina en las condiciones aplicadas [47], que está de acuerdo con nuestros resultados. Por último, Kodach
et.

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