Extracto
Las diferentes células cancerosas presentan alteración de la sensibilidad al tratamiento con metformina. Estudios recientes sugieren que estos hallazgos pueden deberse en parte a la práctica de cultivo celular común de la utilización de glucosa alta, y cuando se baja la glucosa, la metformina se vuelve cada vez más citotóxica para las células cancerosas. En condiciones de baja glucosa que van de 0 a 5 mM, metformina fue citotóxica para las líneas celulares de cáncer de mama MCF7, MDAMB231 y SKBR3, y líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR3, y PA-1. MDAMB231 y SKBR3 fueron previamente demostrado ser resistentes a la metformina en medio normal de glucosa alta. Cuando la glucosa se incrementó a 10 mM o superior, todas estas líneas celulares se vuelven menos sensibles al tratamiento con metformina. El tratamiento con metformina redujo significativamente los niveles de ATP en las células incubadas en medios con bajo nivel de glucosa (2,5 mM), alto contenido de fructosa (25 mM) o galactosa (25 mM). Las reducciones en los niveles de ATP no se observaron con alto contenido de glucosa (25 mM). Esto fue compensado por la glucólisis mejorada a través de la activación de la AMPK fosforilación oxidativa cuando se inhibió por la metformina. Sin embargo, el aumento de la glucólisis era o disminuida o abolida mediante la sustitución de glucosa 25 mM con glucosa 2,5 mM, fructosa 25 mM o 25 mM de galactosa. Estos hallazgos sugieren que la reducción de la glucosa potencia metformina muerte celular inducida por la reducción de la metformina estimula la glucólisis. Además, en condiciones de baja glucosa metformina disminuyó significativamente la fosforilación de AKT y diversos objetivos de mTOR, mientras fosfo-AMPK no se alteró significativamente. Así, la inhibición de la señalización de mTOR parece ser independiente de la activación de AMPK. Además, en estudios in vivo utilizando el modelo de ratón de cáncer de mama 4T1 confirmó que la inhibición del crecimiento del tumor metformina fue mayor cuando los niveles de glucosa en suero se redujeron a través de dietas cetogénicas baja en carbohidratos. Los datos apoyan un modelo en el que el tratamiento con metformina de células cancerosas en medio de glucosa baja conduce a la muerte celular por la disminución de la producción y la inhibición de las vías de señalización de supervivencia ATP. Se observó el aumento de la citotoxicidad de la metformina contra las células cancerosas tanto in vitro como in vivo
Visto:. Zhuang Y, Chan DK, Haugrud AB, Miskimins WK (2014) mecanismos por los que bajo en glucosa Mejora la citotoxicidad de metformina a Las células cancerosas Tanto
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 9 (9): e108444. doi: 10.1371 /journal.pone.0108444
Editor: Viji Shridhar, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Julio, 2014; Aceptado: 29 Agosto 2014; Publicado: 25 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhuang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por KG100497 subvención (W. K. Miskimins) de Susan G. Komen for the Cure. Seahorse experimentos XF24 fueron apoyados por premio COBRE 5P20GM10358 (W.K Miskimins) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud. El proyecto también fue apoyado en parte por un premio COBRE piloto (Y. Zhuang) y la concesión de PHS 1R01CA180033-01 (W. K. Miskimins) del Instituto Nacional del Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En la transformación de cáncer, las células se someten a una reprogramación de sus funciones metabólicas normales para facilitar potencial de crecimiento rápido. Otto Warburg informó altas tasas de glucólisis en las células cancerosas, incluso en condiciones aeróbicas. Este cambio paradójico es un mecanismo por el cual las células cancerosas se han adaptado para una rápida proliferación. Como resultado de este metabolismo alterado, las células cancerosas el uso de grandes cantidades de glucosa y generan grandes cantidades de lactato. Metabolismo de la glucosa a través de la glucólisis contribuye a la síntesis de ATP y proporciona productos intermedios para otros procesos de biosíntesis. De este modo, las células cancerosas dependen de las altas tasas de captación de glucosa y el metabolismo para la supervivencia [1], [2].
Los métodos actuales de
in vitro
cultivo de células de cáncer en general, usan la glucosa alta, 25 mM (450 mg /dL), en el medio de crecimiento. Mientras que el medio de alta glucosa crea un ambiente óptimo para la proliferación de células de cáncer, estos niveles de glucosa pueden complicar la interpretación de los estudios de eficacia de drogas. Niveles elevados de glucosa por sí solo tiene la capacidad de activar las vías de proliferación de una célula de cáncer [2], y la disponibilidad constante de glucosa pone poco de la experiencia normal de las células del cáncer de estrés
in vivo
. En las células de cáncer de páncreas, Sinnett-Smith
et al
. [3] encontraron que las acciones de la metformina sobre la activación de AMPK se han mejorado a través del uso de 5 mM de glucosa media en células cultivadas.
glucosa en suero normal se mantiene normalmente entre 4 y 6 mM (aproximadamente 72 a 108 mg /dL). En los casos de baja disponibilidad de nutrientes, los niveles de glucosa en suero pueden caer a 2,5 mM (45 mg /dl), con los niveles tisulares de glucosa en común más bajas. La reducción de la disponibilidad de glucosa también se ha intentado como un tratamiento de cáncer por una variedad de métodos. La modificación de la dieta por la restricción calórica directa o ayuno se ha investigado como un método para reducir el crecimiento del cáncer con algunos resultados prometedores [4] - [6]. En general, el ayuno parece ser más eficaz que la restricción calórica constante a reducir el crecimiento del cáncer [5]. Además de modificación de la dieta, antidiabéticos son otro medio de reducción de la glucosa plasmática. En un ensayo clínico que compara la eficacia de la metformina para la diabetes de tipo II medicamentos existentes, la metformina se encontró que las concentraciones más bajas de glucosa en plasma en aproximadamente 3 mM (55 mg /dl) a los niveles previos al tratamiento [7]. Sin embargo, vale la pena señalar que la metformina no tuvo efectos significativos en la reducción de la glucosa plasmática en los no diabéticos [8].
Recientemente metformina ha renovado el interés ganado como un adyuvante del cáncer potencial terapéutico y la quimioterapia. actividad anticancerígena potencial de metformina fue implicado por la menor incidencia de cáncer en los diabéticos tipo II en comparación con otras drogas de glucosa en el control [9]. Este efecto se atribuyó inicialmente a las propiedades de glucosa y la regulación de la insulina sistémicos de metformina. También se encontró más tarde metformina para inhibir el crecimiento del cáncer a nivel celular. La acción anti-oncogénica para metformina es probable una combinación de efectos de control de la insulina sistémica y efectos celulares directos. Muchos grupos han demostrado la acción de la metformina
in vitro
en una variedad de tipos de cáncer [10] - [14]. Sin embargo, para imitar los efectos de la metformina
in vitro
que se observan
in vivo
, altas concentraciones, comúnmente 5-20 mM, de la metformina son necesarios. Estudios recientes sugieren que estos hallazgos pueden deberse en parte a la práctica de cultivo celular común de la utilización de glucosa alta, y cuando se baja la glucosa, la metformina se vuelve cada vez más citotóxica para las células del cáncer [15], [16]. Además, se encontró que la fuente de carbono para las células de cáncer de alterar significativamente los efectos contra el cáncer de la metformina al comparar la glucosa a la glutamina [17]. En este estudio las células cancerosas expuestas a alta glutamina en ausencia de glucosa fueron mucho más sensibles a la inhibición por la metformina.
Si bien el mecanismo preciso para la citotoxicidad cáncer de metformina permanece sin identificar, acciones sistémicas de metformina probable combinan con la acción celular directa para mejorar su efecto sobre la inhibición del crecimiento de células de cáncer y muerte de células cancerosas. Aquí mostramos que baja a los niveles normales de glucosa, a diferencia de condiciones de alta de glucosa, potenciar el efecto de la metformina en mama y líneas celulares de cáncer de ovario. Se exploran los mecanismos posibles para esta actividad. Estas observaciones pueden revelar tanto las técnicas de cultivo de células más relevantes para el estudio de la metformina en el cáncer, así como proporcionar información sobre el uso clínico de la metformina como terapia adyuvante del cáncer.
Métodos
productos químicos y reactivos
Los siguientes productos químicos se utilizaron en este estudio: metformina (1, 1-dimetilbiguanida,), D - (-) - fructosa, D - (+) - galactosa, 2-desoxi-D-glucosa, oligomicina (Sigma Chemical Co). Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM) con alto contenido de glucosa (Hyclone), Gibco DMEM sin glucosa (Life Technology), SYTOX Verde de ácido nucleico de la mancha (Invitrogen), y el kit de ATP Ensayo (Invitrogen).
Cultivo celular
líneas celulares de cáncer humano MCF7, MDAMB231, OVCAR3, PA-1, SKRB3, y las células epiteliales mamarias MCF10A humanos fueron todos adquiridos de ATCC y se mantuvieron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% con distintos niveles de glucosa y 1% penicilina estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Todas las líneas celulares se utilizaron dentro del paso de diez después de recibir de la ATCC para asegurar la autenticación de línea celular.
ensayo de muerte celular usando Sytox verde Nucleic Acid Stain
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trató con el tratamiento indicado para uno o dos días. Se añadió Sytox verde colorante de ácidos nucleicos (10 M) directamente a las células en placas de 96 pocillos y se incubó durante 10 minutos. La placa se leyó a excitación /emisión de 485 nm y 530 nm, respectivamente, con un corte de 515 nm usando un lector de placas de fluorescencia (SpectraMax M5 Multi-Mode lector de microplacas, de Molecular Devices, LLC). La fluorescencia se midió para obtener el número de células muertas. Posteriormente, para determinar el número total de células, 0.4% Triton-X100 se añadió a cada muestra y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células, y la fluorescencia a 485/530 nm se midió de nuevo para obtener el número total de células .
ensayo de ATP
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos seguido de incubación durante 24 horas. El tratamiento se administró con medio fresco durante 24 horas. Igual número de células se lisaron en cada grupo de tratamiento y 10 l se utilizó de cada muestra siguiendo el protocolo del fabricante para los ensayos de ATP (Invitrogen, kit de determinación de ATP, A22066). Brevemente, se midió a 100 l de la solución de reacción estándar en un luminómetro para el fondo de luminiscencia. A continuación, se añadieron 10 l de sobrenadante de lisado a la solución de reacción y la luminiscencia se midió de nuevo. la luminiscencia de fondo se sustrajo de la luminiscencia de la muestra y los resultados se representaron como veces el cambio de las muestras de control.
Western blotting
Las células en placas de 35 mm se lavaron una vez con PBS y se lisaron por adición de dodecilsulfato de sodio ( SDS) tampón de muestra [2.5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2,5% de SDS, ditiotreitol 100 mM, 10% de glicerol, 0,025% pironina Y]. Cantidades iguales de proteína de cada grupo de tratamiento se separaron en 10% o 15% SDS-geles de poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon P (Millipore) utilizando un aparato de Trans-blot semi-seco Bio-Rad con un tampón de transferencia de 48 mM Tris-HCl y glicina 39 mM. Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa seca o 5% de BSA en solución salina tamponada con Tris [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM] que contiene 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante una hora a temperatura ambiente. La membrana se incubó con el anticuerpo apropiado en TBS-T que contiene 5% de leche seca no grasa o 5% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Después de lavar en TBS-T, la membrana se incubó con la peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anticuerpo secundario. Las proteínas se detectaron utilizando el sustrato de quimioluminiscencia Super Señal West Pico (Pierce Biochemical). Anti-β-actina anticuerpo monoclonal (A5441, que se utiliza en 1:10,000) se adquirió de Sigma. Los anticuerpos contra la AKT fosforilada en la treonina 473 (# 05-669 utilizado en 1:1000) se adquirió de Upstate biotecnologías. Los anticuerpos contra la AKT fosforilada en la treonina 308 (# 4056, que se utiliza en 1:1000), ATK (# 4691, que se utiliza en 1:1000), S6K fosforilada (# 9206, que se utiliza en 1:2000), S6K (# 9202, utilizado en 1:2000), PARP (# 9542, que se utiliza en 1:2000), PARP escindida (# 9541, que se utiliza en 1:2000), la AMPK fosforilados en treonina 172 (# 2535, que se utiliza en 1:1000), y la AMPK (# 2532, que se utiliza en 1:1000), exfoliados caspasa 7 (# 9491, que se utiliza en 1:1000) fueron adquiridos de señalización Cell Technology. de rábano secundaria peroxidasa ligada anti-ratón (# 31430, que se utiliza en 1:5000) y anti-conejo (# 31460, que se utiliza en 1:5000) anticuerpos IgG se compraron de Pierce bioquímicos.
ensayo de lactato
MCF7 se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron como se indica durante 15 horas. Se recogió el medio de cada tratamiento y se ensayó para la concentración de lactato usando un kit de ensayo de L-lactato (Eton Biosciences Inc.). Las células se contaron usando el método de tinción verde Sytox como se describió anteriormente. los niveles de lactato relativas se obtuvieron después de la normalización por el número total de células.
Medición de acidificación extracelular Rate (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR)
ECAR y OCR se midieron usando un analizador Seahorse XF24 según las instrucciones del fabricante (Seahorse Bioscience). Brevemente, las células MCF7 se sembraron a 40.000 células /pocillo en placas de XF24 pocillos. Las células se trataron como se indica el día siguiente. Antes de ser procesado con el analizador Seahorse XF24, las células se lavaron y se equilibraron con medio libre de amortiguación (D5030, Sigma) a 37 ° C en una incubadora de CO
2-gratis durante una hora. Las mediciones iniciales de ECAR y OCR se obtuvieron seguido de la adición de diferentes concentraciones de glucosa (2,5 mM o 25 mM), fructosa (25 mM) o galactosa (25 mM). ECAR y OCR se midieron más de inyección siguiente de oligomicina y 2-desoxiglucosa. El número de células se obtuvo mediante tripsinización y contando las células usando un hemocitómetro. ECAR y OCR se trazaron después de la normalización por el número total de células
En vivo
estudios con ratones
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones nacionales e institucionales.; El protocolo fue aprobado por el comité de cuidado de los animales y el uso institucional de Sanford Investigación. Brevemente, utilizando una aguja de calibre 25, los ratones Balb /C fueron inyectados por vía subcutánea con 1 x 10
5 células en el flanco (10 ratones por condición de tratamiento). Cuatro días después de la inyección de las células tumorales, los ratones fueron cambiados a una restringida en calorías baja en carbohidratos dieta cetogénica (BIOSERV P3666) para el grupo KD (ver más abajo para los detalles de las dietas). Los grupos de control se mantuvieron con comida normal de ratón (Teklad Global 18% de proteínas Dieta de roedores) y fueron alimentados como libitum. La metformina (2 mg /ratón) se administró por vía intraperitoneal diariamente comenzando 7 días después de la inyección del tumor. El volumen del tumor se estimó usando A
2 × B donde A es el diámetro mayor y B es el diámetro más pequeño. Los animales se sacrificaron cuando el tamaño del tumor fue mayor de 15 mm en su mayor dimensión o volumen del tumor alcanzó 3000 mm
3, o cuando el animal fue sustancialmente descarnado.
medición de glucosa en suero
los niveles de glucosa en suero se midieron usando sangre vena de la cola después de la punción de la cola con una aguja de calibre 25 para producir una gota de sangre para cada prueba. La glucosa se midió utilizando un glucómetro Bayer Contour y las tiras reactivas de glucosa.
información de la dieta
La baja en carbohidratos dieta cetogénica se adquirió de BIOSERV (# F3666). Esta dieta proporciona calorías provenientes de proteínas, grasas y carbohidratos en aproximadamente 4.6%, 93.4% y 2%, respectivamente. Todos los ratones alimentados esta dieta fueron sometidos a restricción calórica del 30% (7 kcal /día /ratón) a partir del 4
º día después de la inyección de las células tumorales. La restricción calórica se determinó midiendo el peso de alimento consumido cada día. Se proporcionó la cantidad apropiada de la dieta cetogénica todos los días en una placa de Petri dentro de la jaula. Calorías se incrementaron a 7,5 kcal /día /ratón (25% de restricción) en el día 7 después de la iniciación de la dieta cetogénica para evitar la pérdida de peso. Las calorías se incrementaron más de 8 kcal /día /ratón en el día 11 después de la iniciación de la dieta cetogénica y se mantuvo a este nivel hasta el final del experimento. Los grupos de la dieta de control se alimentaron ad libitum con pienso estándar del ratón (Teklad Global 18% de proteínas dieta para roedores) que proporciona calorías de proteínas, grasas y carbohidratos en aproximadamente 24%, 18% y 58%, respectivamente.
el análisis estadístico
las barras de error que se muestran son las desviaciones estándar de la media de al menos tres réplicas. Dos colas de Student por pares
t
pruebas se utilizaron para comparar los dos grupos.
P
valores menores o iguales a 0,05 se considera que tiene importancia.
Resultados
Nuestra investigación previa ha demostrado que la metformina es citotóxico para muchos de mama y las líneas celulares de cáncer de ovario . Sin embargo, algunas líneas celulares tales como las líneas celulares de mama MDAMB231 y SKBR3 mostraron resistencia a la metformina citotoxicidad [14], [18], [19]. Los experimentos anteriores se llevaron a cabo en DMEM que contenía glucosa 25 mM, que es significativamente más alta que las condiciones fisiológicas normales de 4-8 mM. Para determinar la concentración de glucosa influencia tiene sobre la citotoxicidad de la metformina, hemos probado los efectos de diferentes concentraciones de glucosa en el medio de cultivo de las células cancerosas expuestas a tratamiento con metformina. Todos los cultivos celulares se mantuvieron inicialmente en un medio de alto contenido de glucosa (glucosa 25 mM) y se sembraron en placas de 96 pocillos durante un día, los próximos células día fueron tratados con metformina (0 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM y 16 mM) en un medio que contenía diferentes concentraciones de glucosa (0 mm, 2,5 mm, 5 mm, 10 mm, 15 mm y 25 mm) para un día. Como los niveles de glucosa en la disminución de medio, el tratamiento con metformina aumentó significativamente el porcentaje de células muertas en MDAMB231, MCF7 y células SKBR3 (Figura 1A, 1B, 1C). Los datos anteriores muestran que, en medio de los altos de glucosa, tanto en las células SKBR3 MDAMB231 y son resistentes al tratamiento con metformina (8 mM) durante un máximo de tres días [14], [18], [19]. En condiciones de alta de glucosa en estas líneas celulares, MDAMB231 y SKBR3, siguieron siendo resistentes a los tratamientos de metformina hasta concentraciones de 16 mm de la droga. Sin embargo, cuando los niveles de glucosa se redujeron a 2,5 mM o menos tanto MDAMB231 y SKBR3 muestran una respuesta citotóxica para el tratamiento con metformina desde 4 mM a 16 mM.
Todas las células se trataron con diferentes concentraciones de metformina (0, 2 , 4, 8, 16 mM) en medio que contenía diferentes niveles de glucosa (0, 2,5, 5, 10, 15, 25 mM) durante un día. Porcentaje de células muertas se determinó mediante la tinción de Sytox verde. La metformina aumentó significativamente el porcentaje de células muertas con la disminución de la concentración de glucosa en (A) MDAMB231 células, las células MCF7 (B), y las células SKBR3 (C) pero no en las células MCF10A (D). Los datos se presentan como media ± desviación estándar.
Al mismo tiempo, los efectos de la metformina a diferentes concentraciones de glucosa fueron examinados en el no-cáncer de células del epitelio mamario humano MCF10A (Figura 1D). En contraste con los cultivos de células de cáncer, la reducción de la concentración de glucosa no sensibilizar significativamente MCF10A al tratamiento con metformina más de este período de tiempo. Esta diferencia puede ser el resultado de diferencias subyacentes en el metabolismo de la glucosa entre las células epiteliales mamarias normales y células cancerosas
.
Con el fin de probar si estos efectos sobre la citotoxicidad metformina aplicarse a otros tipos de células de cáncer, también examinamos las células de cáncer de ovario . De manera similar, la reducción de la glucosa se encontró para aumentar la citotoxicidad de la metformina en las líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR3 y PA-1 (Figura 2). Esto sugiere que la reducción del flujo de glucosa en las células cancerosas podría mejorar significativamente la citotoxicidad de la metformina, y que este efecto puede ser muy relevante para varios tipos de células de cáncer.
A. Después de 48 tratamientos hora con metformina (5 mM, +) o vehículo de control (H
2O, -), en vivo se determinó el número de células OVCAR3 contando las células negativas azul de tripano y el número de células muertas se determinó contando las células positivas de azul de tripano. se determinó B. PA-1 muerte celular como se describe en imágenes de contraste de fase A. (40x) de las células cultivadas con (imagen inferior) o sin tratamiento con metformina (superior imagen). Los gráficos de barras representan la media ± desviación estándar. Todos los grupos tratados con metformina en medio que contiene niveles bajos de glucosa (1 mM) fueron significativamente diferentes de sus grupos de control. * Indica diferencias significativas entre los grupos.
Otras acciones celulares conocidas de la metformina incluyen la inhibición del complejo I de la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa [20]. Esta acción puede dar como resultado la producción de fallecidos de ATP y otros intermedios celulares. Los niveles celulares de ATP de MCF7, MDAMB231, y PA-1 se examinaron después de tratamiento con metformina (24 horas), ya sea en los altos de glucosa (25 mM) o baja glucosa (2,5 mM) medio de cultivo de tejidos (Figura 3). Los resultados muestran que la metformina disminuye fuertemente los niveles de ATP sólo en medio de glucosa baja. En condiciones de alta de glucosa, en este punto de tiempo, la metformina tendió a aumentar ATP pero no a un nivel de significación.
MDAMB231 (A) y (B) las células MCF7 fueron tratados con metformina (8 mM), ya sea en 25 mM de glucosa o glucosa 2,5 mM durante un día y los niveles de ATP se midieron y se pliegan cambio de ATP en comparación con el control se trazó. C. ATP mediciones en células PA-1 después de 12 horas con o sin metformina. Este punto de tiempo fue elegido debido a la rápida tasa de PA-1 de crecimiento en condiciones de cultivo de control. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Todos los grupos tratados con metformina en medio que contiene niveles bajos de glucosa (2,5 mM) fueron significativamente diferentes de sus grupos de control. * Indica diferencias significativas entre los grupos.
En condiciones de alta de glucosa, las células tratadas con metformina potencialmente mantener los niveles de ATP por la activación de la AMPK y la mejora de la glucólisis [21], [22]. Para probar esto, las células MCF7 fueron tratados con metformina (8 mM) durante 15 horas, el consumo de oxígeno celular (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) fueron medidos utilizando el analizador de caballito de mar XF24. Como era de esperar, la metformina consumo de oxígeno, inhibió de las células MCF7 en medio que contiene 25 mM o glucosa 2,5 mM (Figura 4A). glucólisis mejorada en las células tratadas con metformina en glucosa 25 mM medio que contiene se confirmó por el aumento de la acidificación del medio extracelular (Figura 4B) y la secreción de lactato (Figura 4C). Sin embargo, en el tratado de glucosa en las células cancerosas bajas mostraron una disminución de aumento de la producción de lactato y el CERA por la metformina, lo que indica una disminución de la capacidad para promover un aumento de la glucólisis (Figura 4B, 4C). Por lo tanto, la falta de promover suficientemente la glucólisis se correlaciona con una incapacidad para mantener ATP intracelular en estas condiciones.
A. células MCF7 fueron tratados con metformina (8 mM) durante 15 horas o bien en 25 mM de glucosa o de los medios que contiene 2,5 mM. tasa de consumo de oxígeno (OCR) se determinó utilizando el instrumento FX24 para el análisis de flujo metabólico. grupos tratados metformina fueron significativamente diferentes de sus grupos de control. células B. MCF7 fueron tratados con metformina (8 mM) durante 15 horas. velocidad de acidificación extracelular (ECAR) se determinó utilizando el instrumento FX24 para el análisis de flujo metabólico. grupos tratados metformina fueron significativamente diferentes unos de otros y sus grupos de control. células C. MCF7 fueron tratados con metformina (8 mM) durante 15 horas, y los niveles de lactato medianas se midieron como un indicador de flujo glucolítico. grupos tratados metformina fueron significativamente diferentes unos de otros. D. Los extractos de MCF7 y células MDAMB231 cosecharon un día de tratamiento con metformina, ya sea en 25 o 2,5 mM de glucosa fueron utilizados para la detección de Western blot de la AMPK fosforilada y AMPK total. ß-actina se detectó como control de carga. Densitometría de p-AMPK /AMPK o p-AMPK /actina de las células MCF7 se presenta como un gráfico de barras. Escindido capsase 7 en células MCF7 se detectó con el Western Blot. ß-actina se detectó como control de carga. células E. MCF7 en alta glucosa fueron tratados con metformina (8 mM) y el compuesto C (10 mM) como se indica durante 15 horas. DMSO es se determinó el control del vehículo para el compuesto C. ECAR como se describe en B. La metformina grupos tratados eran significativamente diferentes entre sí. células MCF7 F. en alta glucosa fueron tratados con metformina (8 mM) y el compuesto C (10 mM) como se indica durante 15 horas. los niveles de lactato Medium se determinaron como en los grupos tratados C. metformina fueron significativamente diferentes unos de otros. Todos los gráficos de barras representan la media ± desviación estándar. * Indica diferencias significativas entre los grupos
AMPK se sabe que regulan la glucólisis potenciando la captación y regulación de varias enzimas clave de la glucosa en la vía [21] -. [25]. Nuestros datos anteriores mostraron que la metformina podría activar AMPK por el aumento de la fosforilación de AMPK en la treonina 172 en medio que contenía glucosa 25 mM [14]. Por lo tanto, se examinaron los niveles de activación AMPK con el tratamiento con metformina en tanto alta glucosa y baja glucosa. MCF7 y MDAMB231 células fueron tratadas con metformina (8 mM) por un día, ya sea en 25 mM o glucosa 2,5 mM medio que contiene. Western Blot se realiza para detectar AMPK fosforilado y AMPK total. En ambas líneas celulares metformina mejora los niveles de fosforilada de AMPK, la forma activa de la enzima, en un medio que contiene glucosa 25 mM, pero no en medio que contiene glucosa 2,5 mM después de un tratamiento días (Figura 4D). En contraste, mientras que niveles bajos de glucosa, en sí, el aumento de la fosforilación de AMPK, la adición de metformina en estas condiciones pareció disminuir tanto fosfato AMPK y los niveles totales de la enzima. Esto se demuestra adicionalmente por densitometery de transferencias Western de células MCF7 para cuantificar la proporción de AMPK fosforilado a AMPK total y la relación de AMPK fosforilado a la actina (Figura 4D). En medio que contenía glucosa 2,5 mM, la metformina aún mejorarse la activación de AMPK en comparación con el control, demostrado por el aumento de la relación de AMPK fosforilado total AMPK. Sin embargo, debido a la fuerte reducción de la AMPK total AMPK fosforilado total se redujo con el tratamiento con metformina en comparación con el control. La reducción de los niveles de AMPK con el tratamiento con metformina en medio que contiene glucosa 2,5 mM se asoció con la muerte celular apoptótica significativa como se demuestra por el aumento de la caspasa 7 escindido (Figura 4D panel inferior). La variación en los niveles de AMPK activa entre medio alto y bajo de glucosa que contiene podría ser la causa subyacente de la diferencia en la estimulación del metabolismo glicolítico por tratamiento con metformina. Para confirmar aún más el papel de la AMPK en la promoción de la glucólisis, las células MCF7 se trataron con o sin compuesto C (10 mM), un inhibidor específico de la AMPK. Después de 15 horas en medio que contiene glucosa 25 mM con o sin metformina, ECAR, así como mediciones de lactato fueron obtenidos. El grado de aumento de ECAR y la acumulación de lactato con el tratamiento con metformina fue bloqueado parcialmente por co-tratamiento con el compuesto C (Figura 4E, 4F). Esto apoya un papel para la activación de AMPK inducida por la metformina en la estimulación de la glucólisis en los altos de glucosa medio que contiene. Además, estos resultados apoyan la conclusión de que el fracaso para activar o mantener la activación de AMPK por la metformina en niveles bajos de glucosa que contiene medio conduce al agotamiento de ATP.
Para comprender mejor los cambios intracelulares que se producen con el tratamiento con metformina en alta y baja se examinaron los medios de glucosa, los niveles de proteína de varias quinasas. Tanto MCF7 y MDAMB231 células fueron tratadas con metformina (8 mM) durante un día en medio que contiene 25 mM o glucosa 2,5 mM. La transferencia Western se realizó para probar la fosforilación de AKT y objetivos de la señalización de mTOR. La respuesta a la metformina fue alterado en gran medida considerablemente en condiciones de poca glucosa. En condiciones de baja de glucosa se encontró metformina para reducir sustancialmente la fosforilación de AKT y disminuir los niveles de fosforilación de los objetivos de mTOR (S6K y 4EBP1), en comparación con condiciones de alta glucosa (Figura 5A, 5B). Como se sabe que estas vías para promover la supervivencia celular, así como el metabolismo glicolítico, su inhibición por la metformina puede contribuir a la glucólisis reducida, el agotamiento subsiguiente de ATP, y en última instancia la muerte celular
.
MCF7 y MDAMB231 células fueron tratadas con metformina en DMEM que contenía glucosa 25 mM o glucosa 2,5 mM durante un día. Western Blot se utilizó para estimar los niveles de p-AKT (Thr308), AKT p-AKT (Thr473), total, p-S6K, S6K total 4EBP1 (bandas inferiores representan hypophosphorylated y bandas superiores representan hiperfosforilada), y β-actina como control de carga.
con el fin de investigar más a fondo el papel de la glucosa en la protección de células de la muerte metformina inducida, los efectos de la glucosa se compararon con los de azúcares relacionados, incluyendo la fructosa hexosas y galactosa. Previamente se ha informado que la fructosa y galactosa no contribuyen de manera significativa al metabolismo glicolítico en células de cáncer [26], [27]. Además, el procesamiento de galactosa a través de los resultados de la glucólisis en ninguna síntesis neta de ATP. Sobre la base de estos hallazgos predijimos que la fructosa y galactosa serían incapaces de apoyar la síntesis de ATP en presencia de metformina. Para probar esto, medio de cultivo celular libre de glucosa se complementó con glucosa, fructosa, o galactosa y los cultivos se analizaron de nuevo para la muerte celular (Figura 6A, 6B). líneas celulares de cáncer de mama MCF7 y MDAMB231 fueron tratadas con o sin metformina durante 1,5 días en DMEM que contenía glucosa (0 o 25 mM), fructosa (25 mM), galactosa (25 mM), o fructosa más galactosa (12,5 mM cada uno). Similar a los resultados anteriores, el aumento de la concentración de glucosa reduce sustancialmente la citotoxicidad de la metformina en tanto MCF7 y células MDAMB231. Sin embargo, fructosa y galactosa no fueron eficaces en la prevención de la citotoxicidad de la metformina. los niveles de ATP también se examinaron en las células tratadas con metformina en medio que contiene las diversas hexosas. El tratamiento con metformina llevado a una disminución significativa en los niveles de ATP bajo nivel de glucosa, de alta fructosa, galactosa o condiciones de alta, pero no en los altos de glucosa (25 mM) condiciones. La reducción de ATP a pesar de alta fructosa o galactosa puede explicar por qué estos azúcares no son capaces de rescatar las células de metformina citotoxicidad inducida
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MCF7 (A) y células MDAMB231 (B) fueron tratados con metformina en DMEM sin glucosa, con glucosa 25 mM, con galactosa 25 mM, fructosa 25 mM, o fructosa 12,5 mM más galactosa 12,5 mM durante 1,5 días. Porcentaje de células muertas se determinó mediante tinción Sytox verde. grupos tratados con metformina en galactosa 25 mM, fructosa 25 mM y fructosa 12,5 mM más galactosa 12,5 mM fueron significativamente diferentes de los grupos tratados con metformina en glucosa 25 mM. células MCF7 (C) y (D) MDAMB231 fueron tratados en el medio indicado con o sin metformina (8 mM) durante un día y se midieron los niveles de ATP. grupos tratados con metformina en glucosa 2,5 mM, galactosa 25 mM y fructosa 25 mM fueron significativamente diferentes de sus grupos de control. Los resultados se muestran como factor de cambio en comparación con el control. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. * Indica diferencias significativas entre los grupos.
A fin de examinar la glucosa como fuente de carbono específico para el mantenimiento de la glucólisis y la producción de ATP en presencia de la metformina, próximo a prueba los efectos de la droga sobre la fosforilación oxidativa y glucólisis por la medición de OCR y ECAR en glucosa 25 mM, fructosa 25 mM, o 25 mM de medios galactosa. Zhou et al.