Extracto
Nuestro estudio anterior indica que la proteína DEK se sobreexpresa en el carcinoma colorrectal (CCR) en comparación con la mucosa colorrectal normal. DEK también se correlacionó significativamente con las características de pronóstico de los pacientes con CCR, lo que demuestra que DEK jugó un papel importante en la progresión del CRC. En este trabajo, evaluamos los efectos de DEK sobre los comportamientos biológicos en el CCR y explorar los mecanismos moleculares relacionados. Los resultados mostraron que DEK se sobreexpresa en tejidos de CRC humanos, y se correlacionó con el índice Ki-67 y el índice de apoptosis. DEK agotamiento de RNAi en células SW-620 y HCT116 disminuyó significativamente la proliferación celular, pero aumento de la apoptosis celular. La regulación positiva de DEK estuvo implicado en las vías de p53 /MDM, familia Bcl-2 y la caspasa. Nuestro estudio demuestra que DEK promueve el crecimiento de CRC, y podría ser una diana terapéutica en el CCR
Visto:. Lin L, J Piao, Ma Y, Jin T, C Quan, Kong J, et al. (2014) mecanismos subyacentes crecimiento del cáncer y apoptosis por DEK sobreexpresión en cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (10): e111260. doi: 10.1371 /journal.pone.0111260
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 26 de Junio, 2014; Aceptado: September 24, 2014; Publicado: 23 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Fondo Especial de 973 Profase Investigación del Ministerio Nacional de Ciencia & amp; Tecnología de Fondo Básico de Investigación Científica de la Universidad de Jilin en China (2013-01) China (2014CB560708), las subvenciones de los Fondos Nacionales de Ciencias Naturales de China (61371067), y. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común y la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La calidad de vida y la tasa de supervivencia a 5 años son bajos en los CRC avanzados incluso con la escisión quirúrgica acompañada por la quimioterapia y la radioterapia. La detección temprana del CRC es crucial para el éxito del tratamiento debido a la enfermedad avanzada de alto grado se correlaciona con el aumento de la metástasis y la mortalidad [2] - [4]. Por lo tanto, la identificación de nuevos biomarcadores y mediadores CRC, en particular los relacionados con la metástasis y el crecimiento, la mortalidad sigue siendo fundamental para el combate de la enfermedad recurrente. El progreso en la patogénesis del cáncer puede ayudar a desentrañar los biomarcadores moleculares vitales /válidos implicados en la carcinogénesis colorrectal y ayudar en el desarrollo y el descubrimiento de nuevas intervenciones terapéuticas y estrategias y agentes preventivos. Nuestros datos anteriores han demostrado que la expresión de la proteína DEK es upregulated en los tejidos de CRC [5]. La sobreexpresión es particularmente marcado en alto grado y la fase tardía de los CRC, haciendo DEK un potencial nuevo biomarcador para el pronóstico de la CRC y un objetivo en la lucha contra la recurrencia [5].
DEK fue descubierto originalmente como el objetivo de un evento de translocación cromosómica t (6; 9) en un subconjunto de las leucemias mieloides agudas [6] - [7]. Ahora, DEK está emergiendo como un miembro de una nueva clase de moduladores de la topología del ADN que pueden ser blancos y los efectores de eventos pro-tumorigénicos [8]. DEK localiza en el cromosoma 6p22.3 [9], y es una nucleoproteína muy conservadas que pueden ser fosforilados. Compuesta de 375 aminoácidos, DEK se distribuye principalmente en el núcleo de la eucromatina, y preferentemente se expresa en la proliferación activa y malignas células, donde puede alcanzar hasta 4 a 6 millones de copias por núcleo [8]. Estudios posteriores han identificado repetidamente DEK como un gen sobreexpresado con frecuencia en una serie de tumores [10] - [12]. Además, DEK puede ejercer efectos sobre mRNA de empalme, el control de la transcripción, reparación de daños en el ADN, la diferenciación, la viabilidad celular y la célula a célula de señalización [11], [13] - [15]. Sin embargo, no se han evaluado las funciones de DEK
in vitro
en el comportamiento celular CRC. Anteriormente, hemos demostrado que la proteína DEK se sobreexpresa en 109 casos de tejidos de CRC, se correlacionó significativamente con las características de pronóstico de los pacientes, y fue un factor de riesgo independiente para la supervivencia general [5]. En este estudio se observa la expresión de DEK en un nuevo grupo de CRC primarios recogidos, y se correlaciona con la expresión DEK los Ki-67 y la apoptosis índices, que reflejan las contribuciones de la proliferación celular y la pérdida de células, respectivamente. Además, aclaramos el papel de DEK en la progresión del CRC con la interferencia de ARN DEK (RNAi) en una línea celular derivada de un CRC.
DEK es un inhibidor de p53-dependiente y -independiente de senescencia celular y la apoptosis fenotipos [ ,,,0],7], [14], [16], y transcriptionally upregulated por la ruta de Rb /E2F, que está perturbado con frecuencia en CRC [17] - [19]. Por lo tanto, su expresión es un fuerte indicador de la proliferación y la apoptosis. Aquí definimos las actividades oncogénicas específicas de DEK en CRC
in vitro
, e identificar un mecanismo molecular mediante el cual DEK contribuye al crecimiento del tumor.
Métodos
Ética Declaración
Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para el estudio que cumplió con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por los comités de ética humana y la ética de la investigación de la Universidad de Yanbian Medical College en china. A través del formulario de consentimiento de la cirugía, se informó a todos los participantes que los especímenes resecados fueron almacenadas por el hospital y potencialmente utilizados para la investigación científica, y que su privacidad se mantendrían.
Las muestras de tejido
Fresh muestras de los cuatro casos de CCR se emparejaron con los tejidos no cancerosos adyacentes, y se incluyeron con la rutinaria procesados y diagnosticados 55 casos de cáncer colorrectal tejidos que fueron seleccionados al azar de los pacientes sometidos a cirugía entre 2009 y 2012 en el tejido tumoral Banco de Yanbian Medicina de la Universidad . Los parámetros patológicos fueron revisados cuidadosamente en todos los casos. También se incluyeron un total de 22 de los tejidos de la mucosa de colon normal adyacente del margen de resección de cáncer y 18 de los tejidos adenoma colorrectal. Ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia antes de la cirugía o tenían metástasis a distancia. Los H & amp;. Portaobjetos teñidos-E fueron revisados por dos patólogos experimentados (Lin Z, Jin T) y un bloque de parafina adecuada se seleccionó para este estudio
Las técnicas de inmunohistoquímica (IHC) para DEK y Ki-67
El método de tinción IHC y criterios de interpretación fueron descritas anteriormente [5]. En pocas palabras, para eliminar la actividad peroxidasa endógena, 4 secciones de tejido micras de espesor se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron con 3% de H
2O
2 en metanol durante 15 min a temperatura ambiente (RT). La recuperación del antígeno se realizó a 95 ° C durante 20 min mediante la colocación de los portaobjetos en tampón de citrato de sodio 0,01 M (pH 6,0). Los portaobjetos se incubaron después con el anticuerpo DEK (1:50, BD Biosciences Pharmingen, CA, EE.UU.) y un ratón monoclonal anti-Ki-67 anticuerpo (clon: MIB-1; Dako, Glostrup, Denmarkat 4 ° C durante la noche después. incubación con el anticuerpo secundario biotinilado a TA durante 30 min, los portaobjetos se incubaron con complejo de estreptavidina-peroxidasa a TA durante 30 min. la inmunotinción se desarrolló utilizando 3,3'-diaminobencidina, y hematoxilina de Mayer se utilizó para la contratinción. se utilizó IgG de ratón como que controle un isótopos. Además, las secciones de tejido positivos se procesaron omitiendo del anticuerpo primario como controles negativos.
Tanto DEK y Ki-67 se expresa normalmente en el núcleo de la célula. la tinción IHC para DEK era semi- cuantitativamente marcado como "-" (negativo, no o menos de 5% de células positivas), '+' (5-25% de células positivas), ++ '' (26 a 50% de células positivas) y "+++" ( más de células positivas 50%). Sólo el patrón de expresión nuclear fue considerada como una tinción positiva, y los medios fuertemente positivas "++" y "+++" células positivas. El índice Ki-67 (el número de células tumorales Ki-67-positivos dividido por el número total de células tumorales × 100%) se determinó contando el número de células tumorales en 20 campos de alta potencia seleccionados al azar (× 400). ensayo de
apoptóticas en secciones de tejido de CRC
El índice de apoptosis se midió utilizando un kit de detección de apoptosis in situ (Takara Bio, Otsu, Japón). Los procedimientos de tinción se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la desparafinación de rutina, la sección de tejido se sometió a digestión con proteinasa K (20 mg /ml en PBS) durante 15 min a temperatura ambiente y se lavó con PBS. Los portaobjetos se incubaron a continuación en peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 min y se lavaron con PBS. enzima TdT y el sustrato se pipetearon sobre las secciones, que se incubaron luego a 37 ° C durante 90 min. Después del lavado, se añadió anti-FITC conjugado HRP a los portaobjetos durante 30 min. Los portaobjetos se lavaron, se tiñeron con diaminobenzine (Nichirei, Tokio, Japón), y el contraste con hematoxilina. El índice apoptótico (el número de células tumorales positivas dividido por el número total de células tumorales × 100%) se determinó contando el número de células tumorales en 20 campos de alta potencia seleccionados al azar (× 400) [20]. Las correlaciones entre la expresión DEK y el índice Ki-67 o apoptosis fueron evaluados en tejidos humanos por encima de CRC.
Western Blot
Los anticuerpos primarios a DEK (1:1000, BD, Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.), mutante-p53 (1:2000, Santa Cruz, CA, EE.UU.), MDM2 (1:2000, Santa Cruz, CA, EE.UU.), Bcl-2 (1:2000, Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), Bax (1:2000, Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), PARP (1:2000, Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), caspasa-3 (1:2000, Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), 8 caspasa-(1:2000, la señalización celular, se utilizaron Danvers, MA, EE.UU.), y la caspasa-9 (1:2000, Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.).
muestras de tejidos frescos de CRC se molieron a polvo en nitrógeno líquido y se lisaron con tampón de muestra SDS-PAGE. Las células confluentes se lisaron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 0,5 mM, 0,09 unidades /ml de aprotinina, 1 mg /ml de pepstatina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 10 mM, y 1 mg /ml de leupeptina) . Muestras de igual de proteínas (20 g) se separaron en 12% de geles de SDS poliacrilamida y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween-20 durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. La membrana se lavó 3 veces con TBST, y se incubó con cabra conjugado con HRP anti-IgG de ratón. (Cwbiotech, Pekín, China) y conjugado con HRP de IgG de cabra anti-conejo (Cwbiotech, Pekín, China) a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación, se detectó la expresión usando reactivo de detección ECL Prime Western blotting (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. β-actina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se utilizó como control de carga. Las imágenes fueron capturadas con el sistema de análisis de imágenes profesional Champchemi (Sagecreation, Pekín, China), y bandas de proteína se cuantificaron utilizando el software CARRIL 1D (Sagecreation, Pekín, China).
inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT PCR) y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
para RT-PCR, el ARN total a partir de muestras de CRC y líneas celulares se extrajeron utilizando el reactivo Trizol (Takara, Shiga, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Primera línea de cDNA fue sintetizado por el primer guión de la transcriptasa inversa (Takara Bio, Dalian, China) y oligo (dT), siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las reacciones de PCR se realizaron en 20 l de mezcla de reacción, a partir de 4 min a 94 ° C para la desnaturalización de ADNc, a continuación, la amplificación PCR se realizó durante 23~36 ciclos de 94 ° C durante 15 s y 53~58 ° C durante 30 s para recocer los cebadores, y la extensión de los cebadores a 72 ° C durante 1 min. Alícuotas de la reacción de PCR se retiraron después de varios números de ciclos y se resolvieron por electroforesis en geles de agarosa al 3%. Las imágenes fueron capturadas con el sistema de análisis de imágenes profesional Champchemi (Sagecreation, Pekín, China), y la cuantificación se realizó con el software CARRIL 1D (Sagecreation, Pekín, China).
-PCR en tiempo real se llevó a cabo por un Bio- Rad sistema de detección de secuencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el Kit de doble hebra de ADN específica SYBR Premezcla Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japón). Los conjuntos de cebadores para genes específicos se muestran en la Tabla 1. en tiempo real las reacciones de PCR se realizaron por triplicado, y los números de ciclo umbral (Ct) se determinaron en el nivel que mostró los mejores parámetros de PCR cinéticas. control sin plantilla se utilizó como control negativo, y se obtuvieron las curvas de fusión para confirmar la especificidad del producto de PCR. Un método comparativo CT (2
-ΔΔCt) se utilizó para medir la cuantificación relativa de gen DEK.
Cultivo de células y transfección
líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW-620 , HT29, SW-480, y HCT116 fueron adquiridos de la célula Banco de la Academia china de Ciencias Médicas (Shanghai, china), y conservados por el Centro de Investigación del cáncer de la Universidad de Yanbian. Estas líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 o medio DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD, EE.UU.) suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 2 mmol /l de L-glutamina, y 100 U /ml de penicilina /estreptomicina en humidificado 5% CO
2 a 37 ° C
DEK siRNA (Sidek) dirige el gen DEK humana, y se utilizaron dúplex de siRNA con secuencias no específicas como controles negativos (siCONTROL).; Todas las secuencias fueron diseñados y sintetizados por RiboBio (RiboBio, Guangzhou, China) (Tabla S1). El Sidek utilizado en este estudio se muestran en la Tabla 1.
ensayo MTT
A mil células por pocillo se incubaron en placas de 96 pocillos. Veinticuatro horas más tarde, siCONTROL y Sidek fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se añadieron las secuencias Sidek en una forma dependiente de la dosis a 30 nM, 50 nM y 100 nM. Cuarenta y ocho horas más tarde, /mL de MTT se añadió 5 mg a cada pocillo. Después de incubación a 37 ° C durante 4 h, los sobrenadantes se retiraron cuidadosamente. A continuación se añadieron 200 l de sulfóxido de dimetilo a cada pocillo y los pocillos se mezclaron a fondo durante 10 minutos. El valor de absorbancia (DO) a 560 nm de cada pocillo se midió utilizando un lector de microplacas (TECAN-infinito Pro M200, Mannedorf, Suiza).
inmunofluorescencia tinción
La línea celular CRC, SW- 620, se hizo crecer en cubreobjetos a 70% de confluencia, y luego se fija en 4% de paraformaldehído durante 10 min y se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 durante 10 minutos después de 24 h. El bloqueo se realizó con 3% de albúmina de suero bovina fracción V (Solarbio, Beijing, China) para 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con DEK anti-humano de ratón (01:50, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche, seguido de incubación con Alexa Fluor 568 de cabra anti-IgG de ratón (H + L) (A11004, 1:1000, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las células fueron contrastados con 49-6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Beyotime, Shanghai, China) y los cubreobjetos fueron montados con Antifade medio de montaje (Beyotime, Shanghai, China). Por último, las señales de inmunofluorescencia se visualizaron y se registran utilizando Leica SP5II microscopio confocal [21].
Colonia ensayo de formación de
revueltos Sidek (siCONTROL) y Sidek transfectadas SW620 línea de células se sembraron en placas de 10 cm en la densidad de 5 × 10
4 células por placa. Después de días, el medio se reemplazó con medio que contiene 800-1000 g /ml de G418 (Gibco, Gaithersburg, MD, EE.UU.). Después de aproximadamente 7 días, fue reemplazado medio. El ensayo se detuvo cuando las colonias fueron claramente visibles incluso sin mirar bajo el microscopio, y que era de unos 2~3 semanas de incubación a 37 ° C, 5% CO2. Luego, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 0,5%, se tiñeron con violeta cristal y se contaron entonces de acuerdo al tamaño definido de la colonia [22].
Hoechst33342 tinción
Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
4 células /ml y se cultivaron durante 2 a 4 días hasta 80% a 90% de confluencia. Una densidad celular de 0,5-3,0 x 10
6 células /ml se alcanzó y se fija durante 10 minutos a temperatura ambiente con 3% de paraformaldehído (50 l) antes del tratamiento con Hoechst 33342. Hoechst 33342 se disolvió en agua destilada a 25 mg /ml y se añadió a DMEM (medio eagle modificado por Dulbecco) con 2% de FBS a una concentración final de 16 mg /ml durante 15 min. La tasa de apoptosis se calcula contando 500 células en un microscopio de fluorescencia.
La citometría de flujo
SW-620 células fueron cultivadas en placas de seis pocillos y se transfectaron con el DEK-siRNA la orientación o la lucha siRNA durante 48 h con Lipofectamine 2000 Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.. Después del tratamiento, las células fueron cosechadas por la tripsina (0,25%) - EDTA y se recogieron por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de unión, antes de ser marcado con Anexina V-FITC y 7AAD para 20 min. Fluorescencia (contenido de ADN) se midió por citometría de flujo utilizando software estándar. Las células que eran Anexina V-FITC (-) y 7AAD (-) fueron considerados células viables, mientras que las células que eran Anexina V-FITC (+) y 7AAD - células apoptóticas en etapa temprana se consideraron (). Las células que estaban Anexina V-FITC (+) y 7AAD (+) se consideraron células apoptóticas en etapa tardía.
El análisis estadístico
Cada experimento se realizó por triplicado. Todos los datos se expresan como la media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.), y se realizaron comparaciones entre los grupos utilizando la prueba t de Student. Las correlaciones de los niveles de expresión de DEK con CCR y los factores histológicos se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a
P
. & Lt; 0,05
Resultados
DEK proteína se sobreexpresa en los CRC
Para demostrar el papel de DEK sobre la CRC , que mide los niveles de proteína DEK en cuatro casos de CCR con tejidos frescos no tumorales adyacentes emparejados. Western blot datos mostraron robusta expresión de la proteína en los tejidos DEK CRC en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes emparejados (Fig. 1).
(A) Imágenes de transferencias Western de expresión de la proteína DEK en cuatro pares emparejados de CRC ( T) y los tejidos no tumorales adyacentes (NT). (B) se muestran las proporciones relativas de T /NT de DEK niveles de expresión de proteínas en emparejado CRC y los tejidos no tumorales adyacentes (aumento del factor de cambio, **
P Hotel & lt; 0,01).
expresión de la proteína DEK mostró un patrón de tinción nuclear IHC en CRCs (Fig. 2). El número de células que contienen la proteína DEK (tasa positiva) fue significativamente mayor en los tejidos de CRC (80,0%, 44/55) que en mucosa adyacente normal (36,4%, 8/22) y en adenomas colorrectales (16,7%, 3/18) . Del mismo modo, la tasa fuertemente positiva de la proteína DEK fue 50,9% (28/55) en los CRC, que fue significativamente mayor que en mucosa de colon normal adyacente (18,2%, 4/22) y en adenomas colorrectales (16,7%, 3/18) (Tanto
P Hotel & lt; 0,001). (Tabla 2)
(a) DEK tinción de proteínas fue negativo en tejidos de colon normales adyacentes. proteína (B) DEK mostró difusa tinción positiva y fuertemente nuclear en la fase final del CRC. proteína (C) DEK es positiva en las células cancerosas invasoras en la serosa del colon. proteínas (D) DEK es negativo en el CCR y sin metástasis.
Las correlaciones entre la expresión DEK y el índice y la apoptosis índice Ki-67 en tejidos humanos CRC
evaluó la correlaciones entre la expresión DEK y el Ki-67 y los índices de apoptosis en los tejidos humanos CRC. El índice Ki-67 era 26,60 ± 8,12% en los tejidos con bajos niveles de expresión DEK y 48,17 ± 7,87% en los tejidos con altos niveles de expresión DEK (Fig. 3A). DEK niveles de expresión y el índice Ki-67 se correlacionaron positivamente (
P = 0,030
). El índice apoptótico fue de 0,78 ± 0,10% en los tejidos con bajos niveles de expresión DEK y 0,30 ± 0,16% en los tejidos con altos niveles de expresión DEK (Fig. 3B). También hubo una correlación significativa entre los niveles de expresión de DEK y el índice de apoptosis (
P
= 0,010).
(A) se observaron diferencias significativas en la correlación de expresión DEK y el índice Ki-67 (
P = 0,030
). (B) También hubo una correlación significativa entre la expresión de DEK y el índice de apoptosis (
P
= 0,010). . (DEK baja, "-" y "+";. DEK alta, "++" y "+++")
DEK expresión en células CRC por RT-PCR y Western Blot
los datos IHC aparecen arriba y nuestro datos de informes anteriores [5] sugieren que DEK podría estar implicada en la progresión de la CRC y un buen marcador de la proliferación y metástasis. Por lo tanto, se han detectado los niveles de expresión de ARNm y proteínas DEK en varias líneas celulares de CRC, incluyendo SW-620, SW-480, HCT116 y HT29. datos de RT-PCR mostraron que toda la SW-620, SW-480, las células HT29 y HCT116 mostraron altos niveles de expresión de mRNA DEK (Fig. 4A). Se observaron resultados similares para los niveles de proteína de estas líneas celulares por ensayos de Western blot (Fig. 4B). Aquí se seleccionaron las células SW-620, que tienen alto potencial de proliferación y metástasis confirmada por los informes anteriores [23], para los siguientes experimentos.
Efectos de DEK RNAi sobre la proliferación celular de la línea celular de cáncer de colon , SW620
transfectadas células SW-620 con DEK RNAi, y se encontró que DEK RNAi downregulated eficazmente los niveles de mRNA y expresión de proteínas de DEK en células SW-620 por la tinción de inmunofluorescencia, RT-PCR, y análisis Western blot (Fig. 5A-C).
(a) de localización nuclear de la proteína DEK se observa en siCONTROL y células Sidek SW-620. DEK (rojo) localizado en los núcleos de las células SW-620 por la tinción de inmunofluorescencia y la observación de microscopía confocal. se incluyó DAPI (azul) para visualizar el núcleo. (B) la expresión de ARNm DEK en la línea celular humana CRC SW-620 después de siCONTROL y Sidek. expresión de la proteína (C) DEK en la línea celular humana CRC SW-620 después de siCONTROL y Sidek.
Los efectos de la expresión de la proteína DEK sobre el crecimiento celular se ensayaron usando un ensayo MTT. La tasa de crecimiento de las células tratadas con Sidek nM 100 disminuyó de una manera dependiente de la dosis (Fig. 6A). Los valores de absorbancia del ensayo MTT después de 72 h y 96 h fueron 0,43 ± 0,02 y 0,62 ± 0,03 para el siCONTROL, y 0,35 ± 0,03 y 0,39 ± 0,02 para las células SW-620 transfectadas con Sidek, tanto
P
& lt; 0,05, respectivamente (Fig 6B.). Además, un ensayo de formación de colonias mostró SW-620 células se redujeron de manera eficiente en presencia de Sidek (100 nM). En comparación, Sidek inhibió la formación de colonias en células SW-620 en alrededor de 70% (
P
& lt; 0,05) (Fig. 6C). Estos datos indicaron que hubo una reducción significativa en el crecimiento celular en las células transfectadas en comparación Sidek-con las células siCONTROL.
(A) ensayo de MTT mostró la Sidek (100 nM) imita redujeron significativamente la proliferación de SW- 620 células en relación al grupo siCONTROL (
P
= 0,034). (B) ensayo MTT después de 24 h, 48 h, 72 hy 96 h para siCONTROL y Sidek-transfectaron células SW-620, *
P Hotel & lt; 0,05, respectivamente. (C) Ensayo de formación de colonias mostró tratamiento inhibe la formación de colonias Sidek en células SW-620 en alrededor de 70% (
P
& lt; 0,001).
efectos de la expresión DEK en la apoptosis de las células SW-620
Como se muestra en la Fig. 7A, después de las células SW-620 se transfectaron con 100 nM Sidek o siCONTROL, la tasa de apoptosis fue significativamente mayor en las células Sidek SW-620 en comparación con las células SW-620 transfectadas con siCONTROL. + 7AAD- células El porcentaje de Anexina V-FITC /fue 13,13% en el grupo Sidek, y 4,99% en el grupo siCONTROL, lo que indica que DEK agotamiento aumentó principios apoptosis de las células SW-620 (Fig. 7B).
(A) Hoechst33342 tinción mostró que desmontables del gen DEK apoptosis inducida. (B) transfectadas Sidek durante 48 h aumentó notablemente en apoptosis en etapas iniciales indican mediante un mayor porcentaje de Anexina V-FITC + células /7AAD- en comparación con el grupo siCONTROL.
La expresión de p53 /MDM2, familia de las caspasas y proteínas Bcl-2 /Bax en las células transfectadas con Sidek
Tal como se muestra en la Fig. 8A, los niveles de expresión de p53 mutante y la expresión de MDM2 en células SW-620 tratadas con Sidek disminuyó en gran medida en los ensayos de Western blot, lo que sugiere que DEK estimula el crecimiento de células SW-620 a través de la vía de p53 /MDM2. Por otra parte, la expresión de Bcl-2 se downregulated después del tratamiento Sidek. En contraste, la expresión de Bax se upregulated en las mismas condiciones. Estas observaciones sugirieron que la vía de Bcl-2 /Bax desempeña un papel importante en la progresión de SW-620 células que está regulada por DEK (Fig. 8B).
Mutant-p53 y MDM2 proteínas (A) fueron significativamente downregulated en células SW-620 Sidek transfectadas. (B) La relación de Bcl-2 /Bax se redujo significativamente en células SW-620 transfectadas con Sidek. (C) expresión de la proteína PARP era mucho mayor en las células Sidek, y la caspasa-3 y -9 proteínas fueron significativamente menores en transfectadas con Sidek células SW-620 que aquellos en el grupo de siCONTROL. Caspasa-8 los niveles de proteína se mantuvo sin cambios.
Además, nuestros datos también mostraron que escinde la caspasa-3 y caspasa-9 escindida se redujo en las células Sidek, mientras que el nivel de expresión de la caspasa-8 no lo hizo cambio. Sin embargo, poli ADP ribosa polimerasa escinde (PARP) se incrementaron los niveles de expresión con la aplicación Sidek. Estos datos sugirieron que la caspasa-3 y caspasa-9, pero no caspasa-8, están involucrados en SW-620 apoptosis de las células después de la transfección Sidek, lo que indica que Sidek también activa las vías dependiente de caspasa (Fig. 8C).
El mecanismo de la función DEK en el CCR también se confirmó en otra línea celular HCT116 CRC, y encontró resultados similares con los que en las células SW620. Los datos se proporcionan como las figuras complementados (Fig. S1-S3).
Discusión
amplificación del gen
DEK y upregulated expresión han sido descritos en múltiples tipos de cáncer incluyendo el carcinoma hepatocelular, cáncer de vejiga, y el melanoma [7], [16], [24]. Las obras de Khodadoust et [7] al mostraron que los niveles de expresión DEK pueden distinguir nevos benignos de los melanomas malignos, lo que indica que esta proteína puede resultar muy útil para diagnósticos diferenciales. Recientemente, Datta et al. [24] informó de que la oncoproteína DEK se reguló en tejidos de cáncer de vejiga en comparación con sus homólogos normales según lo determinado por transferencias Western. De hecho, la proteína de DEK estaba presente en la orina espontánea de los pacientes con bajos y de vejiga de alto grado de tipos de cáncer, lo que sugiere que DEK podría ser utilizado como un biomarcador para la detección de cáncer de vejiga usando muestras de orina de pacientes. Nuestro estudio es el primero en informar sobre las actividades oncogénicas de DEK en el CCR por el agotamiento de DEK, y definir los mecanismos moleculares y funcionales de DEK en el CCR patogénesis.
Nuestro estudio anterior [5] mostró que la fuertemente positiva tasa de proteína DEK fue 48,62% (53/109) en el cáncer colorrectal, que era significativamente mayor que en cualquiera de mucosa de colon normal adyacente (9,17%, 10/109) o adenomas colorrectales (13,46%, 7/52). DEK sobreexpresión en los CRC se correlacionó positivamente con el tamaño del tumor, grado, metástasis en los ganglios linfáticos, invasión serosa, etapa tardía, y la supervivencia a 5 años las tasas de supervivencia libre de enfermedad. Otros análisis mostraron que los pacientes con CCR última etapa y la expresión de alto DEK tenían peores tasas de supervivencia que aquellos con baja expresión DEK. Por otra parte, el análisis multivariado mostró una expresión de alto DEK, invasión serosa, y la fase tardía son importantes factores de riesgo independientes de mortalidad en el CCR. En este trabajo, western blot y tinción IHC análisis mostraron que la expresión de alto DEK fue significativamente más frecuente en los tejidos de CRC que en cualquiera mucosa colorrectal normal adyacente o adenomas colorrectales.
El antígeno Ki-67 se expresa por la proliferación de las células durante la la G1, S, G2, y M fases, pero no durante la fase G0 (células en reposo) [25]. Ki-67 se utiliza como un marcador de la proliferación de tumor y la agresividad, y puede tener un efecto importante en el pronóstico de pacientes con CRC [26] - [27]. Nuestros resultados anteriores demostraron que el patrón de expresión de la proteína DEK era muy similar a el antígeno Ki-67 como un marcador de proliferación en los cánceres de cuello uterino [28]. Una correlación positiva entre la expresión DEK y el índice Ki-67 o apoptosis en los tejidos de CRC también se encontró en este estudio.
Wise-Draper et al. [29] empleado RNAi enfoques para la orientación específica de DEK en el cáncer y las células primarias, y se encontró que la depleción de DEK en células de cáncer cervical HeLa resultó en la inducción de la apoptosis. Se obtuvieron resultados similares con los queratinocitos humanos primarios, que implican a DEK como un cáncer y factor de supervivencia de células primarias. En este estudio, también se detectó la asociación entre la sobreexpresión DEK y comportamientos más malignas de las células utilizando CRC CRC humanos HCT116 SW-620 y con y sin tratamiento de RNAi. El análisis apoptosis de las células reveló que DEK agotamiento aumentó la apoptosis temprana de las células HCT116 SW-620 y. A pesar de esto, también se observó que el agotamiento de DEK inhibió el crecimiento celular en un ensayo MTT ensayo y la formación de colonias. Estos resultados estuvieron de acuerdo con los resultados del índice Ki-67 y la apoptosis en la muestra de tejido CRC. Nuestros hallazgos indican que DEK regula el crecimiento celular y la supervivencia CRC
in vitro
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La proteína p53 humana es el gen supresor de tumores más frecuentes en el cáncer humano inactivado y está implicado en el control de la proliferación celular en respuesta al estrés [30]. Sin embargo, p53 tiene una vida media corta y se mantiene en niveles bajos o indetectables por la degradación proteolítica continua en las células normales. la degradación sostenida de p53 está mediada principalmente por la ligasa E3 MDM2 [31]. Por p53 de unión, MDM2 bloquea el dominio de transactivación de p53 y por lo tanto inhibe su actividad transcripcional [32]. Desafiados con señales de estrés tales como hipoxia o daño en el ADN, el bucle de realimentación de MDM2-p53 se altera, lo que lleva a la apoptosis o malignidad [33]. El estudio de Khodadoust sugiere un nuevo papel para DEK en la supervivencia celular, que implica la desestabilización de p53 de una manera que es probable que contribuya a la carcinogénesis humana [7]. Además, Wise-Draper et al. también consideró que la muerte celular en respuesta al agotamiento de DEK fue acompañado por una mayor estabilidad de la proteína y la actividad transcripcional del supresor de tumores p53, y la posterior regulación al alza de conocidos genes diana p53 tales como Bax [29]. Bax, un factor pro-apoptóticos de la familia Bcl-2, se encuentra en una forma monomérica en el citosol o débilmente unido a las membranas en condiciones normales. Después de un estímulo muerte, citosólicas y monomérica Bax translocan a las mitocondrias, donde se convierten en proteínas integrales de membrana.