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PLOS ONE: mesenquimales de transición epitelial inducida por factores de reprogramación Atenúa la malignidad del cáncer Cells


Extracto

transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso biológico de cáncer metastásico. Sin embargo, una terapia eficaz contra el cáncer que se dirige directamente el programa EMT todavía no se ha descubierto. Estudios recientes han indicado que mesenquimales a la transición epitelial (MET), el fenómeno inverso de EMT, se observa en los fibroblastos durante la generación de células madre pluripotentes inducidas. En el presente estudio, se investigó los efectos de factores de reprogramación (RFS) en células de carcinoma de células escamosas (SCC). RFS-introducidas células cancerosas (RIC) demostraron las características mejoradas en la morfología del epitelio con alteraciones en la expresión de mRNA y microRNA. Las actividades de la motilidad e invasoras de los CRI
in vitro
se redujeron significativamente. Por otra parte, los xenoinjertos de CRI no mostraron metástasis de ganglios linfáticos, mientras que no se detectó metástasis en ratones inoculados-SCC parentales. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que los CRI recuperaron propiedades epiteliales a través MET y demostraron una reducción de malignidad del cáncer
in vitro
y
in vivo
. Por lo tanto, la comprensión del proceso de MET en células cancerosas mediante la introducción de los FR puede conducir al diseño de una nueva estrategia contra el cáncer

Visto:. Takaishi M, Tarutani H, J Takeda, Sano S (2016) mesenquimales de epiteliales de transición inducida por factores de reprogramación Atenúa la malignidad de las células cancerosas. PLoS ONE 11 (6): e0156904. doi: 10.1371 /journal.pone.0156904

Editor: William B. Coleman, Universidad de Carolina del Norte Facultad de Medicina, Estados Unidos |
Recibido: Diciembre 23, 2015; Aceptado: 20-may de 2016; Publicado: Junio ​​del 3, 2016

Derechos de Autor © 2016 Takaishi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. M. Takaishi fue apoyada por el Ministerio japonés de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura (http://www.jsps.go.jp/english /e-grants/index.html). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer representa una condición que amenaza la vida con el aumento de la mortalidad cuando se hace metástasis. Aunque los mecanismos de la metástasis del cáncer todavía no se entienden completamente, se sabe que la adquisición de propiedades invasivas es impulsado por transición epitelial a mesenquimal (EMT) [1, 2]. Cáncer bajo EMT se caracteriza por una pérdida de adherencias intercelulares, una ganancia de la motilidad celular, y aumento de la actividad invasiva. Una característica importante de EMT es la pérdida funcional de la proteína de unión de adherencia, E-cadherina (CDH1), a través de múltiples mecanismos, incluyendo la mutación de genes, la hipermetilación y la represión de su promotor [1, 3, 4].

factores de transcripción represivas para CDH1 incluyen (a) la familia Snail (Snai1 y SNAI2) [5, 6], (b) la familia Twist (TWIST1 y TWIST2) [7, 8], y (c) la familia ZEB (ZEB1 /dEF1 y ZEB2 /SIP1) [9-11]. Esos factores de transcripción pueden interactuar con el elemento de caja E de la
CDH1
promotor, lo que lleva a la baja regulación de su expresión. La sobre-expresión de esos genes EMT inductor se observa con frecuencia en las células de cáncer metastásico [1, 3, 4]. Por el contrario, la baja regulación de la expresión génica EMT-inducir restaura
CDH1
expresión y conduce a la atenuación de la malignidad del cáncer a través de un mecanismo conocido como mesenquimales del epitelio de transición (MET), el programa inversa de EMT [1, 12-14].

los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes que regulan su expresión genes diana a nivel post-transcripcional y se sabe que juegan un papel esencial en diferentes tipos de cáncer. Se ha informado de que los factores de transcripción que induce la EMT, que suprimen la
CDH1
expresión, están regulados negativamente por los miRNAs (miR-200, miR-familia 203 y miR-205, etc.) [15 -17].

Durante la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de fibroblastos murinos mediante la introducción de genes de factores de reprogramación de cuatro, Oct3 /4, Sox2, Klf4 y Myc, las células pasaron por MET [ ,,,0],18, 19]. Mientras iPSCs se han generado a partir de las células primarias, estudios recientes han explorado las posibilidades de la reprogramación de las células malignas, incluyendo leucemia, sarcoma, melanoma y otros tipos de células de cáncer de exhibir un estado de IPSC-como
in vitro
[ ,,,0],20-25]. Las células malignas reprogramadas mostraron un estado pluripotente, como con un programa de diferenciación alterado que condujo a la pérdida de tumorigenicidad. Sin embargo, no estaba claro si la malignidad del cáncer se atenuó a través del mecanismo mediado por MET con factores de reprogramación.

Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es demostrar que las células SCC disminuyen el potencial maligno
in vitro
y
in vivo a través
MET por la introducción de factores de reprogramación sin el estado pluripotente similar. Estos hallazgos son muy relevantes para el desarrollo de nuevas y eficaces estrategias terapéuticas para el tratamiento del cáncer.

Materiales y Métodos

Generación de células iPS usando el sistema de transposón piggyBac

queratinocitos epidérmicos humanos normales ( NHEKs) aisladas a partir de prepucios se obtuvieron de Kurabo (Osaka, Japón) y se cultivaron en Epilife II (Invitrogen) suplementado con HuMedia KG-(Kurabo). pCMVmPBase y plásmidos que contienen el transposón piggyBac que lleva los factores de reprogramación (POU5F1 (OCT3 /4), SOX2, KLF4, cMYC, y Lin28) [26, 27] se transfectaron en las NHEKs con sistema NEON transfección (Invitrogen). Los NHEKs transfectadas se inocularon inmediatamente en células alimentadoras en Primate ES Cell Medium (ReproCELL, Yokohama, Japón) suplementado con bFGF (4 ng /ml), Y-27632 (10 mM), CHIR99021 (3 M), PD0325901 (0,5 M) y SB431542 (5 M), todos esos reactivos fueron de Wako Pure Chemical Industrias (Osaka, Japón). El medio se cambió a uno nuevo cada dos días. células ES como colonias apareció en los días 10-14, y se seleccionaron y se amplió en aproximadamente el día 21. Para investigar si las células iPS derivadas de NHEKs tiene fenotipo ES-como, las células se tiñeron con el kit de sustrato de fosfatasa alcalina (Vector Laboratories, Burlingame, CA), y con anti-anticuerpo Nanog (Abcam, Cambridge, UK). Las células iPS se inocularon en ratones SCID de los testículos (CLEA Japan, Tokio, Japón) bajo anestesia y los ratones fueron sacrificados para extirpar los testículos en el día 60 después del trasplante de células. Los testículos se fijaron con formalina y se procesaron para la sección de parafina para el examen histopatológico.

Las líneas celulares

SCC líneas celulares humano, HOC313 y TSU [28, 29], fueron dotados por el Dr. Kamata, Instituto de Biomédica & amp; Ciencias de la Salud, Universidad de Hiroshima, Japón. Las células OSC-19 y células NCCIT se adquirieron de la Colección japonesa de Recursos Biológicos de Investigación Banco de Células (Ibaraki, Japón). Todas las líneas celulares se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y antibióticos

Introducción de factores de reprogramación

el vector transposón PiggyBac y el vector de expresión de la transposasa-fueron co-transfectadas a las células subconfluentes SCC utilizando el reactivo Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza). Dos días después de la transfección, se añadió puromicina a una concentración final de 1 ~ 5 mg /ml al medio de cultivo de células para la selección. Las células se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS y antibióticos.

Cell morfológica evaluación

Los cambios en la morfología celular se evaluaron mediante el cálculo de la relación de longitud a anchura de cada célula en el microscopio utilizando 20 células por grupo.

cuantitativa en tiempo real RT-PCR

los ARN totales se extrajeron mediante un kit RNAeasy (Qiagen, Venlo, Holanda) y se transcrito de forma inversa usando hexámeros aleatorios y superíndice III (Thermo Fisher Scientific). Cada ADNc se sometió a PCR cuantitativa, utilizando energía SYBR Green PCR Master Mix en la secuencia de los sistemas de detección 7300 (Thermo Fisher Scientific). la expresión de ARNm relativa se normalizó a la expresión de la hipoxantina guanina fosforribosil (HPRT). Los primers utilizados en este estudio se han enumerado en la Tabla S1.

Detección de microRNAs

El total de ARN se prepararon a partir de las células cultivadas utilizando un kit miRNeasy mini (Qiagen). De acuerdo a las instrucciones del fabricante, cada plantilla de cDNA se preparó usando un kit miScript II RT (Qiagen) y la expresión de microRNAs se ensayó usando un kit miScript SYBR Green PCR junto con miScript Primer Ensayo (Qiagen). Esto fue seguido por la normalización de los genes miARN con SNORD61.

MTS ensayo

Un total de placas de 96 pocillos se consideraron para el estudio que contenía 1000 células cada uno, que se sembraron. Uno y dos días más tarde, el reactivo MTS (Promega, Madison, WI, EE.UU.) se añadió a cada pocillo y se incubó a 37 ° C durante dos horas. Posteriormente, los valores de absorbancia también se determinaron a 490 nm usando un espectrofotómetro.

Inmunofluorescencia tinción

Las células cultivadas en portaobjetos de cámara (Thermo Fisher Scientific) se fija ya sea con 4% de paraformaldehído en solución PBS a 4 ° C o 100% de metanol a -20 ° C, y se bloquearon con solución de bloqueo libre de suero (Dako, Glostrup, Dinamarca). Los anticuerpos primarios se incubaron a 4 ° C durante la noche, seguido de lavado en PBS y la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific). Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI). Los anticuerpos primarios utilizados se han enumerado en la Tabla S2. Las imágenes de fluorescencia fueron capturados utilizando un microscopio con un sistema de cámara de dispositivo de carga acoplada. (DP-71; Olympus, Tokio, Japón)

La inmunohistoquímica

Las secciones incluidas en parafina obtenidos de los xenotrasplantes eran deparaffinized y se incubaron en tampón citrato 10 mM (pH 6,0) durante 10 minutos a 105 ° C. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, seguido de lavado en PBS y la incubación con los respectivos anticuerpos secundarios (Dako). Las señales se visualizaron utilizando 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). Los núcleos se counterstained con hematoxilina. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla S2.

citometría de flujo

suspensión celular se incubó con el anti-TRA-1-60 (Millipore), TRA-1-81 (Millipore ), o IgM de ratón (Bioledend) como control de isotipo durante 30 minutos en hielo y seguido por incubación con 488 anticuerpo anti-IgM de ratón conjugado con Alexa Fluor. Las células se analizaron en un citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences) utilizando el software FlowJo (FlowJo, Ashland, Oregón).

La microscopía electrónica

células completamente confluentes en placas de 35 mm se fijaron con 2% glutaraldehído en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,3) y post-fijaron con 1% de tetróxido de osmio, seguido de 5% de sacarosa en tampón de fosfato 0,1 M. El óxido de propileno se usa para disolver las placas de cultivo para obtener las láminas de células. Se observaron las secciones ultrafinas con un microscopio Hitachi H-7100 de electrones (Hitachi High-Technologies, Tokio, Japón).

análisis de transferencia de Western

Se prepararon los lisados ​​de células usando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (tampón RIPA; Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, EE.UU.) o solución de urea (9 M urea, 2% de Triton-100, 5% de 2-mercaptoetanol), se separó en geles de gradiente de 4-15% (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.) y se transfirieron en difluoruro de polivinilo (PVDF) membranas (Bio-Rad). Se utilizó un kit ECL Prime (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) para la detección de la señal. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla S2. ImageJ (NIH) se utilizó para la cuantificación de las señales.


in vitro
cicatrización de heridas ensayo

células confluentes completamente en seis placas de pocillos fueron tratados con mitomicina C (10 g /ml) durante tres horas, seguido de heridas cero utilizando una punta de micropipeta de color amarillo y el lavado con un medio de pre-calentado. Se observó la cicatrización de heridas por las células que migran utilizando un microscopio de contraste de fase y fue fotografiada en los tiempos especificados. La distancia de la migración celular a través de la herida se midió en el tiempo.

invasión de la célula de ensayo


In vitro
la invasión de células se evaluó usando Boyden cámaras en presencia de revestimiento matrigel ( Corning, Corning, NY, EE.UU.). Un total de 25 × 10
3 células se inocularon en las cámaras superiores de las placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 horas. Las células unidas a la membrana entre las cámaras superior e inferior se tiñeron con azul de toluidina y se contaron bajo un microscopio.

El xenotrasplante de células SCC humanos en los ratones /nu nu

Para el modelo ortotópico, los factores parentales cultivadas o la reprogramación introducidas OSC-19 células, que se suspendieron en PBS a una densidad de 1,0 x 10
7 células /ml. Bajo la anestesia con isoflurano, 2,0 × 10
5 células viables se inocularon en el margen lingual de siete semanas de edad ratones /c-nu /nu hembras BALB (Japón SLC, Hamamatsu, Japón). El peso corporal de los ratones se midió tres veces por semana para controlar su condición hasta punto final experimental. Las lengüetas y ganglios linfáticos de drenaje fueron disecados de los ratones sacrificados en el día 21. Las lengüetas se fijaron con formalina y se procesaron para el análisis histológico. Las áreas tumorales en los tejidos de la lengua se calcularon bajo un microscopio usando el software de aplicación (DP2-BSW, Olympus). ARN total fue extraído de los ganglios linfáticos cervicales, y la expresión del gen de la citoqueratina humana 18 se evaluó a través cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Para el modelo de metástasis de órganos distantes, los padres OSC-19 células y los CRI eran suspender a una densidad de 1,0 x 10
6 células /ml y 2,0 x 10
5 células fueron trasplantadas a través de la vena de la cola de la hembra nu /nu ratones. Día 47 después de que el trasplante de células, los ratones fueron sacrificados y seguidos por la necropsia. lóbulo craneal del pulmón derecho se utilizó para la extracción de ARNm y siguió cuantitativa en tiempo real RT-PCR para detectar la expresión de genes de citoqueratina humana 18. Izquierda pulmón, hígado, riñón y bazo se fijaron con formalina y se procesa para análisis histológico. Se aseguró que todos los experimentos con ratones estrictamente las directrices institucionales establecidos para minimizar la angustia a los animales. El estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Escuela de Medicina de Kochi.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el software Prism (GraphPad, CA, EE.UU.) utilizando un Student para datos independientes
t
prueba y la prueba exacta de Fisher.

resultados

la introducción de factores de reprogramación (FR) en células epiteliales de SCC Restaura Morfología pero no facilita la pluripotencialidad

Para introducir los FR, se utilizó el vector piggyBac transposón, en el que em
POU5F1 gratis (
OCT3 /4
),
Sox2
,
KLF4
,
cMYC
, y
Lin28
se incluyeron [26, 27]. El uso de este, podríamos generar con éxito células iPS (figura 1B) de los queratinocitos epidérmicos humanos normales (Figura 1A). Las células iPS expresaron la fosfatasa alcalina (Fig 1C) y NANOG (Fig 1D), indicando la stemness. Ellos desarrollaron teratomas
in vivo
y mostraron tres elementos germinales, es decir, el epitelio (figura 1F), el epitelio neural (Figura 1G) y el cartílago (figura 1H). Para investigar el impacto de los FR en las células cancerosas
in vitro
, utilizamos tres líneas de SCC humanos: HOC313, TSU y células OSC-19. Entre ellos, las dos líneas celulares, HOC313 y TSU, tenían una forma similar a fibroblastos husillo con un aumento de Snail 1 y la disminución de la E-cadherina expresión, que indicaron que las células SCC se sometieron a EMT [30]. El uso de este sistema de vector de transposón, se introdujeron las líneas de SCC los FR, que fue evaluada por Western Blot (Figura 2C). Sorprendentemente, las células del cáncer de RF-introducido (RIC) de todas las líneas de SCC mostraron un cambio morfológico drástico del husillo a la forma poligonal (Figura 2A). Evaluación de la longitud de la célula /anchura entre parental SCC y CRI reveló reducción específica de este último (figura 2B), lo que sugiere que MET también se indujo en los CE como se muestra en fibroblastos durante la inducción de iPC por RF [18, 19]. Cabe señalar que los CRI de ambas líneas de cáncer no expresaban Tra-1-60 y Tra-1-81, los marcadores de superficie de células pluripotentes, mientras que una línea teratoma NCCIT ellos expresado por transferencia Western (Fig 2D) y citometría de flujo (Fig 2E y 2F). Este resultado sugiere que los CRI no adquirió la pluripotencia, incluso después de la introducción de los FR. Para estudiar el impacto de MET inducida por los FR se utilizaron las células y las células HOC313 OSC-19 para una mayor investigación.

(B, A) Imagen de contraste de fase de los queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK) (A) y iPS células generadas a partir de NHEK por la introducción de los vectores piggyBac transposón (B). Bares, 200 micras de A & amp; Las células iPS B. (C, D) tiene actividad fosfatasa alcalina (C) y expresan NANOG (D), lo que sugiere stemnss de las células iPS derivadas de queratinocitos humanos. Bares, 100 micras en C & amp; D. (E) Los teratomas se desarrolla cuando se inocularon las células iPS en los testículos de ratones SCID. Bar, 400 micras. (F-H). Los teratomas albergan tres elementos de la capa germinal, epitelio (F), epitelio neural (G) y cartílago (H), lo que indica la pluripotencia de las células iPS. Bares, 100 micras en F, G y H.

(A) SCC células humanas de los padres (izquierda) y de HOC313 TSU exhiben morfología similar a fibroblastos; Sin embargo, los factores de reprogramación de células introducidas (CRI), paneles de la derecha muestran la morfología poligonal, de tipo epitelial. Los CRI de OSC-19 células muestran más casas de colonias de células que las células de los padres. (Barra de escala, 100μm) (B) La morfología celular se cuantifica por relación de longitud a anchura de cada celda de al menos 20 células cada uno a partir de células parentales de SCC (círculos abiertos) y CRI (círculos cerrados). La relación de los CRI se aproxima a uno, que indica como epiteliales, células de forma poligonal. **
P Hotel & lt; 0,01 por Estudiante
t-test
. (C) Los factores de reprogramación introducidas se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. P, las células parentales. R, CRI. β-actina (ACTB) se utilizó como control de carga. (D-F) Expresión de TRA-1-60 y TRA-81 fue estudiada por el Western Blot (D) y citometría de flujo (E, F). Los datos representativos y media ± desviación estándar de tres experimentos independientes de citometría de flujo se muestran en E y F, respectivamente. hipoxantina-guanina (HPRT) se utilizó como control de carga en (D). Las líneas azules; los anticuerpos específicos, líneas rojas; control de isotipo IgM de ratón en (E). NCCIT, una línea celular humana teratoma, se utilizó como control en (DF).

mesenquimal-epitelial de transición se produce en los CRI

A continuación exploramos los cambios en la expresión de células epiteliales y la firma genes mesenquimales en los CRI de HOC313 y células OSC-19 usando QRT-PCR. firma genes epiteliales, incluyendo
CDH1
,
DSC 2
,
DSP
,
TGM1
, y
JUP
se upregulated significativamente en ambos CRI en comparación con las respectivas células parentales (Figs 3A y 4A). La regulación positiva de
ITGA6
y
Hoteles en ITGB4 CRI de
HOC313
células y de los
Hoteles en KRT14 CRI de OSC-19 células también se observó. Sin embargo, la expresión de uno de los factores de transcripción-epitelio específico, Grainyhead-como la proteína 2 homólogo (GRHL2) fue no cambió entre células parentales y CRI de ambas líneas de SCC.

(A, B) Alteración de la expresión génica perfil en CRI de HOC313 células, genes marcadores epiteliales (a) y genes marcadores mesenquimales (B). La expresión de ARNm se normalizaron con HPRT, y se muestra la cantidad relativa de cada gen. Las barras azules, células parentales. Las barras rojas, RIC. Las barras representan media ± SD de al menos tres experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0.01. Estudiante
t-test
. (C) Análisis de transferencia Western. P, las células parentales. R, CRI. (D) Las señales del oeste de análisis se cuantificaron utilizando ImageJ. Las señales se normalizaron con HPRT. Doble cambio en el CRI de células de los padres estaban representados, media ± DE y media razón de tres experimentos independientes. (E) tinción de inmunofluorescencia de las células HOC313 de los padres y los CRI con anti-pankeratin (KRTs), y los anticuerpos β-catenina (CTNNB1). micrografías (F) de electrones. Las flechas indican las estructuras desmosome similar. Barra de escala, de 0,2 micras. (G) La expresión de miRNAs en el CRI (barras rojas) en comparación con las células parentales HOC313 (barras azules). miARN se normalizó con SNORD61. Las barras representan media ± SD de al menos tres experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0.01 por Estudiante
t
alltests.

(A, B) La alteración del perfil de expresión génica en los CRI de OSC-19 células, genes marcadores epiteliales (A) y genes marcadores mesenquimales (SEGUNDO). La expresión de ARNm se normalizaron con HPRT, y se muestra la cantidad relativa de cada gen. Las barras azules, células parentales. Las barras rojas, RIC. Las barras representan media ± SD de al menos tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01. Estudiante
t-test
. (C) Análisis de transferencia Western. P, las células parentales. R, CRI. (D) Las señales del oeste de análisis se cuantificaron utilizando ImageJ. Señales normalizadas con HPRT. Doble cambio en el CRI de células de los padres estaban representados, media ± DE y media razón de tres experimentos independientes. (E) tinción de inmunofluorescencia de las OSC-19 células de los padres y los CRI con anti-pankeratin (KRTs), anti-E-cadherina (CDH1), y anti-desmocollin2 (DSC2) anticuerpos. micrografías (F) de electrones. Las flechas indican estructuras desmosome o desmosome similares. Barra de escala, de 0,2 micras. (G) Longitud de desmosomas o estructuras desmosome que se extienden sobre las micrografías electrónicas. Media ± SD de los 30 objetos. **
P Hotel & lt; 0,01 por Estudiante
t-test
. (H) Los desmosomas o desmosome-como la estructura con tonofilamentos se contaron entre los 30 objetos. (I) La expresión de miRNAs en el CRI (barras rojas) en comparación con los padres OSC-19 células (barras azules). miARN se normalizó con SNORD61. Las barras representan media ± SD de al menos tres experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0,01 por Estudiante
t-test
.

A la inversa, los CRI de HOC313 células mostraron una expresión significativamente reducida de la firma genes mesenquimales (Figura 3B), incluyendo
TGFB1
,
TGFBR2
,
Snai1
,
SNAI2
y
ZEB2
. OSC-19 CRI demostraron una reducción de la expresión del gen de C
DH2
,
TGFB2
,
TGFBR2
,
VIM
y
COL1A2 gratis ( Fig 4B). Entre los genes marcadores mesenquimales,
TGFBR2
se downregulated comúnmente en los CRI a partir de dos líneas. Western blot detectaron niveles de CDH1, JUP (γ-catenina), DSC2, y KRTs aumentó en CRI, que se asociaron con el fenotipo epitelial (figuras 3C y 3D y 4C y 4D). Como conformidad con Q-RT-PCR, la pérdida de SNAI2 y la ganancia de KRT14 también se observó por Western blot en HOC313 CRI y OSC-19 CRI, respectivamente. En consecuencia, el proceso de inmunotinción reveló que OSC-19 CRI tenían un marcado aumento de las queratinas, CDH1 y DSC2 (Fig 4E). El aumento de expresión de las queratinas también se observó en HOC313 CRI (Fig 3E). localización alterada de CTNNB1 sugirió mejorada de células para la adhesión celular en HOC313 CRI (Fig 3E). Por otra parte, la microscopía electrónica mostró maduró desmosome con tonofilamentos en HOC313 CRI mientras que las células parentales mostraron estructuras similares a desomosome incompletas, donde el área de alta densidad electrónica se ve en frente a dos membranas celulares (Figura 3F). En OSC-19 CRI, los desmosomas eran más grandes que los de las células de los padres y la mayoría de ellos exhibieron tonofilamentos maduros, mientras que las células de los padres mostraron desmosome inmadura sin tonofilamentos (figura 4F y 4H). En conjunto, los CRI mostraron reaparición de los cruces desmosomas, que son la principal característica de las células epiteliales bien organizados, lo que sugiere MET.

A continuación examinó microRNAs (miRNAs), que según los informes, las moléculas dirigidas EMT inductores. Los HOC313 CRI mostraron niveles de miR-200 miembros de la familia aumentaron (miR-200a, -200b, -200C, -141, -429 y), miR-203 y miR-205 (Figura 3G), lo que podría regular negativamente la familias SNAI y ZEB [15-17]. Las OSC-19 CRI mostraron niveles de miR-203 y miR-205 se incrementaron, aunque los miembros de la familia miR-200 no fueron alterados (Figura 4E). Esto sugiere que la introducción de los FR condujo a la expresión de miRNAs con algunos perfiles diferentes entre las células SCC EMT-supresión. En conclusión, los FR inducidos MET en las líneas celulares de SCC humanos a nivel transcripcional y post-transcripcional.

factores de reprogramación afectan a la motilidad celular de SCC
in vitro

altamente expresados FR en los CRI (figura 2C) podrían haber afectado a la proliferación celular [31], por lo tanto, el
in vitro se accedió
la proliferación celular en los CRI. El ensayo MTS no reveló diferencias significativas en la proliferación celular entre los CRI y las células parentales (figura 5A y 5E). Las células cancerosas bajo EMT adquirieron aumento de la motilidad celular que condujo a la invasión y la metástasis. Para evaluar si los FR revertir la motilidad de las células de SCC, se utilizó un
in vitro
herida ensayo de curación. La migración de las células de los CRI de HOC313 y OSC-19 se atenuó notablemente en comparación con las células parentales (figura 5B, 5C, 5F y 5G). En comparación con las células parentales, la capacidad de migración de los CRI se redujo a 25% y 40% en HOC313 CRI y OSC-19 CRI, respectivamente. Cell invasividad
in vitro se evaluó usando
Boyden cámaras en presencia de revestimiento matrigel. El número de CRI, que migra a través de la membrana, fue significativamente menor que la de las células parentales (figura 5D y 5H). Estos resultados indican que tanto la motilidad celular y la invasión
in vitro
se deterioraron notablemente en los CRI.

HOC313 células de los padres y los CRI (AD), OSC-19 células de los padres y los CRI (EH ). (A, E) La proliferación celular se estudió por el ensayo de MTS. se muestra el número de células proliferado relativa durante 24 horas. Media ± SD de tres experimentos independientes. NS, no hubo diferencia significativa. (B, F)
In vitro
ensayo de curación de la herida reveló que la migración celular se vio afectada notablemente en CRI, en comparación con las células parentales. (Barra de escala, 500μm). Los datos representativos se muestran a partir de tres experimentos independientes. Los tiempos de evaluación se indican. (C, G) Migración de distancia de los CRI (barra roja) se redujo significativamente en comparación con las células parentales (barra azul). Los valores muestran la media ± SD.
n = 3.
**
P Hotel & lt; 0,01 por Estudiante
t-test
. (D, H) la actividad invasiva de las células se reduce en CRI (barras rojas) en comparación con las células parentales (barras azules) utilizando cámaras de Boyden recubiertas con Matrigel. Los valores muestran la media ± SD.
n = 3.
**
P Hotel & lt; 0,01 por Estudiante
t-test
.

Reducción de
in vivo
malignidad en los CRI

Para estudiar el impacto de MET inducida por los FR en la atenuación de SCC tumor maligno, que utiliza las células OSC-19, ya que se sabe que hacer metástasis a los ganglios linfáticos cervicales cuando se implanta en el margen lingual de ratones nude [32]. Como se ha demostrado en el estudio realizado por Maekawa
et al
. [32], 2,0 × 10
5 de células parentales o RIC fueron trasplantadas en las lenguas de los ratones desnudos para verificar si los CIR mostraron alteraron el
in vivo
comportamiento maligno. Posteriormente, la formación de tumores en las lengüetas y la metástasis a los ganglios linfáticos de drenaje se evaluaron en el día 21. Los tumores derivados de los CRI expresó Lin28, uno de los FR (Fig 6A). También mostraron una mayor expresión de DSC2 que las células parentales (figura 6A), lo que indica que los CRI conservan las características epiteliales mejorada observada inicialmente
in vitro
(Fig 4A y 4C). El tamaño de los tumores formados por CRI (
n
= 15) fue significativamente menor que el formado por las células de los padres (
n
= 15), lo que indica la atenuación de
in vivo
crecimiento de los CRI (Fig 6A y 6B). Las metástasis de los padres OSC-19 células a los ganglios linfáticos cervicales fueron detectados por la presencia de la expresión keratin18 humano mediante RT-PCR y se encontró en 6 de cada 15 células parentales ratones inoculados, mientras que sin metástasis se encontraron en el grupo RIC-inoculado ( la figura 6C,
P Hotel & lt; 0,01 mediante la prueba exacta de Fisher). En particular, en ratones que fueron inoculados con células SCC de los padres, el tamaño de las masas tumorales correlacionadas con la probabilidad de metástasis (círculos cerrados en la figura 6B). De hecho, las zonas tumorales en las lenguas de los ratones portadores de cáncer metastásico y sin metástasis fueron 4,83 ± 1,65 mm
2 y 1,90 ± 1,85 mm
2, respectivamente (
P Hotel & lt; 0,01 por t de Student -prueba). En contraste, los tumores derivados de RIC no metastatizan incluso cuando crecieron tan grande como tumores de células de los padres metástasis (Fig 6B). Además, para investigar la capacidad metastásica de las células a órganos distantes, los padres OSC-19 células y los CRI se trasplantaron en ratones desnudos a través de vena de la cola (2 × 10
5 células /ratón). La célula trasplantada ratones desnudos vivió sin ningún síntoma hasta que el punto final experimental, el día 47 después del trasplante de células. No el crecimiento del tumor se observó en los órganos torácica o abdominal macroscópicamente. Además, no se observó evidencia de crecimiento del tumor en el pulmón, hígado, bazo y riñón (datos no mostrados). Sin embargo, la expresión de citoqueratina 18, aunque era muy bajo nivel, se detectó a partir de los tejidos del pulmón, en 2 de 4 muestras de OSC-19 ratones células inoculadas parentales, mientras que no se detectó señal en todas las muestras de CRI-inoculó ratones (Fig 6D). Esto sugiere la presencia de micrometástasis pulmonar de OSC-19 células de los padres. Por lo tanto, el potencial de la exposición CRI menos malignos de las células de los padres
in vivo

(A) Imágenes representativas de la histología (H & amp; E). Y la tinción inmunohistoquímica para Lin28 y DSC2 en masas tumorales de las lengüetas 21 días después de la inoculación de OSC-19 células y CRI parentales. El área del tumor en un tejido de la lengua fue rodeado con una línea de puntos (paneles de H & amp izquierda; E tinción). Las barras de escala, 500 micras y 100 micras de H & amp; E y tinción de 100 micras de inmunotinción. (B) El crecimiento del tumor en las lenguas de los ratones nu /nu en el día 21 después de la inoculación de las células parentales (círculos) y CRI (cuadrados). símbolos negros indican los ratones que presentan metástasis a los ganglios linfáticos. Las barras muestran el área media del tumor (mm
2).
n = 15
(resultados acumulativos de tres experimentos independientes.
n = 5
, cada grupo). *
P Hotel & lt; 0.05 por Estudiante
t-test
. (C) Detección de la queratina humana 18 mRNA de ganglios linfáticos de ratones inoculados con células parentales, pero no de ratones RIC-inoculadas. se detectó expresión de keratin18 humano en los ganglios linfáticos mediante qRT-PCR y se normalizó con HPRT ratón excepto para los controles positivos, que son normalizados con HPRT humano. metástasis de ganglios linfáticos se produjeron en seis de cada 15 ratones inoculados con células SCC de los padres en las lenguas, en agudo contraste con sin metástasis en ratones inoculados-RIC. DO; controlar los ganglios linfáticos sin xenotrasplantes, P; parentales células OSC-19, R; CRI de OSC-19. El nivel de expresión de la queratina humana 18 era casi igual para las dos líneas celulares.

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