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PLOS ONE: miR-200b inhibe el cáncer de próstata EMT, el crecimiento y Metastasis

2015/10/17


Extracto

miARN regulan la expresión génica a nivel post-transcripcional y afinar los procesos biológicos clave, incluyendo la progresión del cáncer. Aquí, se demuestra la implicación de miR-200b en la diseminación metastásica del cáncer de próstata. Se identificaron miR-200b como diana aguas abajo del receptor de andrógenos y vinculada a la disminución de su expresión tumorigenicidad y la capacidad metastásica de las células de cáncer de próstata. La sobreexpresión de miR-200b en las células PC-3, inhibió su proliferación y la formación de tumores subcutáneos. Además, en un modelo ortotópico, miR-200b bloqueado metástasis espontánea y la angiogénesis por células PC-3. Esta disminución potencial metastásico era probablemente debido a la inversión de la transición epitelio-mesenquimal, como se evidenció por un aumento de marcador de E-cadherina pan-epitelial y marcadores específicos de epitelio de próstata, citoqueratinas 8 y 18. Por el contrario, los marcadores mesenquimales, fibronectina y vimentina, se downregulated significativamente por miR-200b. Nuestros resultados sugieren un papel importante para el miR-200b en la progresión del cáncer de próstata e indican su utilidad potencial para el tratamiento del cáncer de próstata

Cita:. Williams LV, Veliceasa D, E Vinokour, Volpert VO (2013) miR-200b Inhibe El cáncer de próstata EMT, crecimiento y metástasis. PLoS ONE 8 (12): e83991. doi: 10.1371 /journal.pone.0083991

Editor: Hari K. Koul, centro de Louisiana State University Health Sciences, Estados Unidos de América

Recibido: 23 Septiembre, 2013; Aceptado: 11 de noviembre de 2013; Publicado: 31 de diciembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Williams et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Herman L . Fondo Kretschmer, a través de la Universidad de Northwestern Departamento de Urología (OV), la espora en el Premio de piloto de cáncer de próstata CA090386 P50 (OV), la diversificación de profesores de educación superior en Illinois Fellowship Grant (PVI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

microARN (miARN) son cortos, (21-22 nucleótidos) no codificante del ARN que se unen a ARNm y reprimen la expresión génica mediante la degradación de ARNm /oa través de la desestabilización deteriorado traducción [1]. El microARN se transcriben primero como miARN estructuras de horquilla 100 pb primarias, que posteriormente son escindidos por Drosha en pre-miARN y exportan desde el núcleo al citoplasma para su tratamiento posterior [2], [3]. La escisión de pre-miARN por proteínas Dicer produce moléculas de doble cadena de 22 pb, de las cuales una de las cadenas se carga selectivamente sobre las proteínas Argonaute, que facilitan miARN unión a las secuencias diana 3'UTR de ARNm. Mirna jugar un papel fundamental en varios procesos de desarrollo y patológicas, incluyendo cáncer de mama, piel, pulmón, cuello uterino y [4] - [9].

El miARN hsa-miR-200b pertenece a una familia que incluye miR-200a, miR-200c, miR-141 y miR-429. La desregulación de miR-200b se ha atribuido un papel fundamental en la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la metástasis en el cáncer como el de mama, gástrico, y carcinomas de páncreas [10] - [12]. Humana miR-200b participa en un doble bucle de retroalimentación con los dos reguladores de la transcripción de E-cadherina, y ZEB1 ZEB2 [13]. En las células epiteliales normales, miR-200b se expresa en niveles altos; apuntando a las regiones 3'UTR de la transcripción pro-metastásico factores ZEB1 y ZEB2 que bloquea la expresión y detiene la EMT [10]. Por el contrario, en las células mesenquimales, donde la expresión ZEB1 /ZEB2 es anormalmente alta, que suprimen el miARN de miR-200 de la familia mediante el bloqueo de su actividad promotora [13]. Múltiples estudios evalúan la función de miR-200b en EMT, aunque hay pocos intentos de abordar su papel en el crecimiento del tumor primario.

A continuación, se demuestra que el miR-200b posee una actividad similar en el cáncer de próstata. Tratando de identificar los genes miARN que contribuyen a la disminución de la agresividad y la tumorigénesis en el cáncer de próstata, se realizó perfiles de miARN de líneas celulares con expresión inducible de los receptores de andrógenos desarrollado previamente en nuestro laboratorio. Encontramos que el miR-200b se reguló de manera significativa en las células PC3 AR-positivo mal tumorigénicas y que la sobreexpresión de miR-200b lleva a una disminución del crecimiento del tumor. Esta disminución de la tumorigénesis era probablemente debido a la disminución de la proliferación. Por otro lado, miR-200b upregulated fuertemente el marcador de células epiteliales E-cadherina en células de CaP, mientras que los marcadores mesenquimales fibronectina y vimentina eran concomitantemente disminuyeron. De acuerdo con los análisis realizados en otros tipos de tumores, ZEB1, un regulador transcripcional de E-cadherina se redujo también en el miR-200b sobreexpresión. Además, el miR-200b reduce el potencial invasivo de las células de CaP
in vitro
y la disminución de la metástasis. Nuestros resultados muestran que el miR-200b disminuye el crecimiento del tumor y revierte la EMT en el cáncer de próstata.

Métodos

Bienestar Animal Assurances

Todos los estudios con animales de laboratorio (ratones) fueron aprobados por Universidad de Northwestern Cuidado de Animales y el empleo Comisión y realizado de acuerdo con las directrices aprobadas y sugeridas por los Institutos nacionales de Salud (número de animales aseguramiento A3283-01, fecha de vencimiento 31/05/2014).

Líneas celulares y Tratamiento condiciones

se establecieron células PC3 transfectadas con el receptor inducible de tipo salvaje de andrógenos (AR) o un plásmido de control anteriormente [14]. Las células se mantuvieron en medio RPMI suplementado con 10% libre de tetraciclina suero bovino fetal (FBS), 2% de penicilina /estreptomicina, 50 mg /ml de zeocina y 1 mg /ml Blasticidin. Para la expresión AR, las células PC3-AR fueron tratados durante 5 días con 1 g /ml de doxiciclina y 1 nM de metiltrienolona (R1881) en fenol medios de comunicación libre de rojo RPMI suplementado con 10% tratado con carbón vegetal FBS, 2% de penicilina /estreptomicina, 50 g /ml de zeocina y 1 mg /ml Blasticidin. Las células PC3 de los padres se mantuvieron en RPMI con 10% de FBS y 2% de penicilina /estreptomicina. Todas las células fueron cultivadas a 37 ° C y 5% de CO
2, en un incubador humidificado.

inmunotransferencia

Las células se sembraron a una densidad de 100.000 células por placa de 10 cm. Las células se recogieron por raspado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugaron a 2500 RPM durante 10 minutos a 4 ° C. El sedimento de células se lisaron en tampón RIPA (Sigma, St. Louis, MO) suplementado con 1X solución de inhibidor de proteasa /fosfatasa (Thermo Scientific, Waltham, MA) y se centrifugó a 12.000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C. Se determinó la concentración del sobrenadante por triplicado mediante el ensayo de proteína (ensayo de proteínas DC, Biorad, Hercules, CA). Los lisados ​​se sometieron a electroforesis en 4% -20% en geles de Tris HCL de poliacrilamida (BioRad, Hercules, CA). Proteína lisado fue trasladado durante la noche a membranas de PVDF (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA). Cada membrana se enjuagó en 1X solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween 20 (TBS-T), se bloquearon con leche no grasa al 5% en TBS-T y se sondaron con anticuerpos como se indica en la Tabla S3.

ARN extracción

Para la detección de los genes miARN, el ARN total fue aislado con miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Para la extracción de ARNm, los tumores fueron instantánea congelada en nitrógeno líquido y se transfieren a una solución de estabilización de ARN (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). Los tumores se mantuvieron a -80 ° C y la extracción de ARN se realizó mediante miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). La concentración y pureza del ARN se midió con NanoVue Plus espectrofotómetro (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).

Tiempo real RT-PCR

El ARN se transcribe de forma inversa con el Kit miScript II RT (Qiagen , Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA resultante se utilizó para el análisis de PCR en tiempo real utilizando miScript SYBR Green PCR kit (Qiagen, Valencia, CA). Por miARN individuales cuantificación se utilizó miScript Primer Ensayos (Qiagen, Valencia, CA). Para el análisis de la polimerasa reacción en cadena (PCR), adelante y atrás primers fueron diseñados y adquiridos de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) y reacciones realizadas utilizando SYBR mezcla súper verde (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD). Las reacciones se realizaron en un iCycler Thermal (Biorad, Hercules, CA). Cada muestra se ensayó por triplicado.

Análisis de matriz miRNA

células PC3-AR fueron tratados con doxiciclina (Dox) y R1881 (como se describió anteriormente) para la expresión y la activación de receptor de andrógenos (AR) , respectivamente. Se extrajo el ARN como se ha descrito anteriormente y 5 g de cada muestra se envió a las Ciencias de LC (Houston, TX) para el análisis de matriz. Las muestras se marcaron con Cy
3 o Cy
5 y se utilizó la relación de intensidad de cada uno para determinar los cambios en el nivel de expresión de los genes miARN. Una secuencia de control de RNA de 20 nucleótidos complementaria a múltiples sondas de control manchas en cada chip se incluyó en cada muestra como un control interno. Los microarrays se realizaron por triplicado para las secuencias de humano, ratón y rata. El espectro objetivo potencial para selecto miARN se definió utilizando Sanger miRBase 11.0. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student para p & lt; 0,10, p & lt; 0,05 y p & lt;. 0,01

miR-200b sobreexpresión

vector lanzadera secuencia de codificación precursor de hsa-miR-200b (pMIRNA1 Pcdh-CMV-MCS-EF1-copRFP) y el vector de control (Pcdh-CMV-MCS-EF1-copRFP) del Sistema de Biociencias (SBI, Mountain View, CA) se propagaron en caldo Luria 50 mg /ml de ampicilina durante la noche a 30 ° C en un agitador orbital. ADN de plásmido libre de endotoxinas fue aislado utilizando Endo-Free Maxi Prep kit (Qiagen, Valencia, CA). partículas lentiviral fueron producidos para cada plásmido en las células HEK293T utilizando el sobre pMD2.G y psPAX2 2
ª generación de plásmidos de embalaje (Addgene, Cambridge, MA). El título se determinó por citometría de flujo de células infectadas como se describe anteriormente [15]. Para la transfección, las células PC3 se sembraron en placas de 6 pocillos a 10
5 células /pocillo. Al día siguiente, el medio se reemplazó con 1 ml de DMEM que contenía 1X la MOI apropiada de partículas lentiviral para miR-200b y el control de vector vacío. Después de 6 horas de incubación, las células se alimentaron con medio RPMI con 10% de FBS y 2% de penicilina /estreptomicina y se incubaron durante 48 horas adicionales. Se aislaron células transducidas que expresan altos niveles de marcador de RFP y citometría de flujo combinada con clasificación de células y se mantuvieron en RPMI con 10% de FBS, penicilina /estreptomicina y 1 mg /ml puromicina para la selección adicional.

Tumorigénesis Ensayos

(1) la inoculación subcutánea.

células PC3 de los padres, se cultivaron células PC3 transducidas con lentivirus células control y miR-200b como se describió anteriormente, se recogieron y se resuspendieron a 2 x 10
7 células /ml en RPMI libre de suero. El cien por l de suspensión de células (2 × 10
6 células /ratón) se inyectaron por vía subcutánea en los cuartos traseros traseros de ratones macho atímicos (Nu /Nu, n = 5). Los tumores se midieron con microcalipers tres veces a la semana y el experimento se terminó a los 29 días después de la implantación. Los tumores se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C para su posterior análisis.

(2) la implantación de las células tumorales ortotópico se llevó a cabo como se describe anteriormente [16].

En pocas palabras , se hicieron incisiones en la línea media, superior a la zona genital de los ratones atímicos macho anestesiado supino (nu /nu). La vejiga se exterioriza y se extendió con un hisopo de algodón para revelar las vesículas seminales y el dorso de la próstata. Las células tumorales en 50 l de RPMI libre de suero (10
6 por animal) fueron inyectadas en la próstata y el músculo y la piel se cerraron con suturas y grapas de metal, respectivamente. Todos los procedimientos se realizaron en ambiente estéril. clips metálicos se retiraron 2 semanas después de la inyección. El crecimiento tumoral se controló mediante la fluorescencia de GFP, usando pequeño OV100 sistema de imágenes de animales (Olympus). El experimento se terminó 20 días después de la implantación. Los tumores fueron extirpados y se congelaron para su posterior análisis. Para evaluar la metástasis, se midió la fluorescencia residual después de la eliminación del tumor primario.

Ensayo de proliferación de

Las células se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos a 3 x 10
3 células /bien. Después de 24, 48, y 72 horas, 10 l de reactivo WST-1 (Roche, Indianapolis, IN) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 2 horas. La absorbancia se midió para cada punto de tiempo a 450 nm de longitud de onda con el lector de microplacas BioRad (BioRad, Hercules, CA).


in vitro
Invasión Ensayo
insertos
Transwell (Corning, Tewksbury, MA) se recubrieron con 100 l de 1 mg /ml de rojo de fenol factor de crecimiento libre reducido Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se dejó solidificar a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos durante 24 horas . Las células se resuspendieron a una densidad de 10
6 células /200 l en RPMI libre de suero, se siembran en duplicados en la parte superior de los insertos revestidos y se incubaron a 37 ° C durante 24 horas, con 700 l de 10% FBS añadió a la cámara inferior como un quimioatrayente. Las células se fijaron y tiñeron utilizando soluciones DiffQuick de fijación (Dade Behring, Malvern, PA) y 6 campos fueron imágenes para cada condición experimental. La invasión fue calculada como porcentaje de células invadidas. El experimento se realizó dos veces.

Cell Cycle Análisis

Las células se sembraron a 10
6 células /ml en RPMI suplementado con 0,2% de FBS. Después de 48 horas se tripsinizaron las células, se lavaron dos veces en PBS frío, se fijaron en 10 ml 75% de etanol enfriado en hielo y se mantuvieron durante la noche a -20 ° C. Las células se lavaron dos veces en 1X PBS a 4 ° C, se resuspendieron en 2,0 ml de solución de tinción DAPI (0,1% Triton X 100 en 10 ml de PBS, 100 l de 1 mg /ml DAPI) y se analizaron por FACS.

Análisis estadístico

Todos los datos cuantitativos se generan a partir de al menos dos experimentos independientes agrupados juntos, con cada punto de datos individual realizado por triplicado. La desviación estándar (SD) se calcularon utilizando el software Microsoft Excel. Para determinar la significación estadística de los difffrences observados, hemos realizado la comparación por pares de los conjuntos de datos, utilizando la prueba t de una cola de Student. La significación estadística se fijó en el valor de p inferior o igual a 0,05.

Resultados

miR-200b está regulada positivamente por AR

Los datos previos de nuestro grupo demostraron que los receptores de andrógenos (AR) inhibe propiedades oncogénicas de la línea celular de cáncer de próstata AR-negativos, PC-3 [14]. El microARN son modificadores importantes de las funciones biológicas, incluyendo el crecimiento del tumor. Se buscó el miARN que son controlados por AR y participa en la regulación negativa de la progresión del cáncer de próstata. Para este fin, se realizó un perfilado miARN de la línea celular generada previamente con AR expresión inducible por tetraciclina ([14], Fig. 1a). Las células se trataron con doxiciclina (Dox) para asegurar la expresión AR y con R1881, para inducir la translocación nuclear y la actividad transcripcional de AR.

(A) de transferencia de Western para confirmar la expresión AR inducible en células PC3-AR. células PC3-AR fueron tratados con doxiciclina 5 días para inducir la expresión de AR y con R1881 para inducir la activación y translocación nuclear de AR. La comparación es con el control sin tratar. Total de lisados ​​celulares se utilizaron para el análisis. (SEGUNDO). mapa de calor de expresión de miRNA en células PC3-AR y de control. El ARN total de células en A se utilizó para el análisis de microarrays y cada muestra se analizó por triplicado. La significación estadística de los cambios de expresión se muestra ha sido determinada mediante la prueba t de Student. los valores & lt P; 0,05 se atribuyó significación estadística

Análisis de microarrays reveló estadísticamente significativa expresión diferencial de los genes miARN 837 individual en respuesta a la activación de AR. (p & lt; 0,05, determinada por la prueba t de los estudiantes), de las cuales 116 fueron mostraron valores de p por debajo de 0,01 (Figura 1b, Tablas S1 y S2). Seleccionamos miARN que se han cambiado más de 2 veces y se analizaron sus objetivos y funciones potenciales utilizando Sanger miRBase versión 11.0 y Diana Micro T versión 3.0. Se seleccionaron ocho miARN base a su potencial implicación en la progresión del cáncer como se determina por
in silico
análisis y estudios publicados. Cinco de los genes miARN seleccionada aumentada en las células PC3-AR menos tumorigénicas también se asociaron con una disminución de la tumorigénesis en otros tipos de cáncer (Tabla 1). MicroARN de la agrupación de miR-200 (miR-200a, miR-200b) se han demostrado actuar como supresores de tumores en gástrico, de cuello uterino, de pulmón, de mama y de próstata [9], [10], [17], [18] . Aumento de los niveles de miR-200C se han relacionado con la disminución de la metástasis en el melanoma, carcinoma de células escamosas y cáncer de próstata [6], [18], [19]. miR-30a y miR 30-d expresión se redujo significativamente en la leucemia mieloide crónica, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células renales, y cáncer de próstata [20] - [23]. Por el contrario, el miR-7 y miR-9 niveles se redujeron en la línea celular de menos tumorigénico. De acuerdo, el miR-7 ha sido identificado como un oncogén en el carcinoma renal de células [24] y miR-9 atribuido un papel en la leucemia [25] - [27]. Se observaron niveles bajos de miR-196a en el melanoma maligno [28] (Tabla 2).

Nos han validado seleccione microARN identificado por análisis de matriz mediante PCR en tiempo real. De hecho, el miR-200b, 30a, 30d y se aumentaron, y miR-9 se ha reducido, y estos cambios fueron estadísticamente significativas (p = 0.05) (Figura 2a). Seleccionamos el miR-200b para su posterior análisis, ya que mostró el mayor cambio veces y debido a su conocido papel en la EMT y la metástasis [10], [13].

(A). miARN expresión se normalizó a la de las células de control (CTRL). PC3-AR y el control de las células fueron tratadas con doxiciclina 5 días para inducir la expresión de AR y con R1881 para inducir la activación y translocación nuclear de AR y el ARN total recogido para su análisis. La comparación es con el control sin tratar y RNU1A_1 no codificante de ARN se utiliza como un control interno. La significación estadística de las diferencias observadas en comparación con el control es p = 0.05 *, ** y p≤0.01 como se determinó mediante una cola t de Student. Los valores medios se calcularon para dos experimentos independientes realizados por triplicado. (B) la activación de AR aumenta la expresión de miR-200b. células PC3-AR (barras grises) se trataron 5 días tanto con doxiciclina para inducir la expresión AR y con R1881 para inducir la activación AR y la translocación nuclear. La comparación es con el control sin tratar. Se añadió flutamida donde se indica para bloquear la actividad de AR. Control de las células (ctrl) PC3-AR se dejaron sin tratar. RNU1A_1 ARN no codificante se utilizó como control interno. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01 como se determina por ensayo t de Student. Los valores medios se calcularon para dos experimentos independientes realizados por triplicado.

midieron los niveles de miR-200b en células PC3-AR tratados con la combinación de doxiciclina, un andrógeno sintético R1881 y el antiandrógeno flutamida , un inhibidor competitivo de la función de AR. MiR-200b se incrementó significativamente en respuesta a R1881 y este aumento fue abolida por la flutamida en una forma dependiente de la dosis, lo que sugiere una regulación transcripcional directa de AR (Figura 2b).

miR-200b suprime el crecimiento de cáncer de próstata xenoinjertos

a continuación trató el efecto de la expresión de miR-200b en la tumorigénesis del cáncer de próstata. Overexpressed miR-200b en las células PC3 mediante transducción con lentivirus alto título, utilizando el vector vacío (Pcdh-CMV-MCS-EF1-copRFP) como control negativo, y se confirmó la expresión de miR-200b por tiempo real de RT-PCR (Figura 3a). Las líneas celulares resultantes y las células PC3 parentales se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos macho. Es importante destacar que los tumores formados por las células que expresan miR-200b fueron significativamente más pequeño que los tumores formados por la PC3 parental y las células transducidas con el control de vector (Figura 3b). Es importante destacar que la expresión de miR-200b se mantuvo durante la duración del experimento, como se verificó por tiempo real de RT-PCR (Figura 3c). Debido a las interacciones tumorales con su microambiente juegan un papel crítico en la progresión del tumor, se realizó la implantación ortotópica de la PC3-200b y controlar las líneas celulares como se describe anteriormente [16] en la próstata dorsal de ratones atímicos macho. Nos aprovechamos de la RFP marcador incorporado en el vector lentiviral bicistrónico para realizar
in vivo de imágenes
longitudinal. La fluorescencia general pre-disección fue significativamente menor en los ratones portadores de PC3 miR-200b tumores positivos en comparación con el grupo de control del vector (Figura 3d, e). Por lo tanto la expresión de miR-200b fue suficiente para reducir el crecimiento del tumor. Por otra parte, las imágenes del abdomen después de la extirpación del tumor reveló significativamente menor fluorescencia debido a lesiones secundarias, lo que sugiere que miR-200b disminuyó tanto el crecimiento primario y metástasis de las células PC-3 con CaP (ver abajo).

A) Forced la expresión de miR-200b en las células PC3. células PC3 se trasduced con un vector lanzadera lentiviral bicistrónico (pMIRNA1 Pcdh-CMV-MCS-EF1-copRFP) codificación hsa-miR-200b y el control de vector vacío (ctrl). ARN total fue aislado y expresión miR 200b midió utilizando en tiempo real de RT-PCR. Los valores representan tres experimentos independientes realizados por triplicado. *, P≤0.01. (B) miR-200b reduce la tumorigénesis de células PC-3. PC3 células parentales, las células PC3 trasduced con control de MIR (ctrl) y miR-200b se inyectaron por vía subcutánea en los cuartos traseros traseros de ratones macho atímicos (n = 5). Se muestra el peso del tumor en el día 29 después de la inyección. *, P = 0.05; **, P≤0.01. (C) Los tumores mantienen la expresión de miR-200b. Relativa expresión de miR-200b se mide por tiempo real RT-PCR en los tumores del panel (B). * P = 0.05. (RE). MIR 200b disminuyó el crecimiento del tumor en un modelo ortotópico de cáncer de próstata. PC3-ctrl-RFP etiquetados y las células fueron PC3-200b implaned en la próstata de los ratones macho atímicos. La fluorescencia media se midió 20 días después de la inyección. (E) por animal fluorescencia se determinó a través de imágenes de todo el cuerpo, con el sistema Olympus OV100. *, P = 0.05. (F) El crecimiento celular se midió mediante WST-1 de ensayo. células PC3-ctrl o PC3 miR-200b se sembraron a 3000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Se midió la absorbancia en los puntos de tiempo indicados utilizando un lector de microplacas Biorad Modelo 680. Los resultados representan la media de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *, P = 0.05 por T de Student. (G, H) Tumor secciones se tiñeron para Ki-67, para evaluar la proliferación. Nota una disminución significativa en los núcleos Ki-67-positivas en presencia de miR-200b. *, P. & Lt; 0,001

miR-200b suprime la proliferación de las células de CaP

factores que contribuyen a la disminución del crecimiento del tumor Buscando, se realizó un análisis de control del ciclo celular de PC3 y PC3 miR 200b células y observaron un aumento leve en la fase G2 /M om células positivas miR-200b que sugieren la detención del ciclo celular (Figura S1). De hecho, WST-1 de ensayo para células viables reveló una ligera pero significativa reducción en el número de células en las células miR-200b positivos en comparación con el control de vector (Figura 3g, h). Combinado con disminución significativa de Ki-67 núcleos positivos en los tumores PC-3 después de la expresión de miR-200b (Figura 3f), nuestros resultados sugieren que la observó una disminución en el crecimiento del tumor fue causado por la disminución de la proliferación.

miR 200b revierte epiteliales de transición Mesencymal en células de CaP

en estudios previos, la expresión de miR-200b en la mama, gástrico, y el carcinoma de células renales se correlaciona con el estado más diferenciado, y la reintroducción de miR-200b invierte EMT [ ,,,0],10], [11], [29]. Estos cambios pueden en última instancia contribuirá tanto a la disminución del crecimiento tumoral y la metástasis. Por lo tanto, se analizaron los niveles de marcadores conocidos EMT y diferenciación expresados ​​por las células PC-3 en la presencia o ausencia de miR-200b. En primer lugar, el análisis de Western blot mostró un aumento significativo en los marcadores de diferenciación típicos de epitelio de próstata citoqueratina CK8 y CK18 de miR-200b, lo que sugiere un estado más diferenciado de células positivas de miR-200b (Figura 4).

(A ). CK y CK 8 18 fueron analizados por Western blot de lisados ​​totales de proteínas a partir de células PC3-ctrl y PC3 miR-200b. (B) Análisis cuantitativo del experimento (A) con el software Image J. La gráfica representa la media de datos de dos experimentos independientes. *, ** P = 0.05 y, p. & Lt; 0,01 mediante la prueba t de Student

De acuerdo, los niveles de E-cadherina también se incrementaron (Figura 5a), lo que sugiere un desplazamiento hacia el fenotipo epitelial . Además, vimentina, un marcador mesenquimal, se sometió a una disminución estadísticamente significativa en la expresión de miR-200b. Otro marcador mesenquimal, fibronectina (FN) muestra una tendencia similar aunque la disminución no alcanzó significación estadística (Figura 5b). Debido a que en los estudios previos de miR-200b controla E-cadherina y EMT por la represión del factor transcripcional ZEB1, hemos evaluado tanto el total de los niveles de proteína ZEB1 y ARN en las células de miR-200b-positivas y de control PC-3. Se ha observado una disminución significativa y reproducible en proteínas y ZEB1 mRNA en respuesta a miR-200b (Figura 5c, d). Este resultado es consistente con la E-cadherina expresión aumentado (Figura 5a). Nuestros resultados demuestran claramente que la expresión de miR-200b promueve las características de las células epiteliales y mesenquimales suprime funciones en las células PC3.

Marcadores (A) afectados por el miR-200b en células PC-3. E-cadherina, fibronectina, y vimentina se detectaron en lisados ​​de células enteras de ctrl PC3 y PC3 células miR-200b por Western blot. (B) Análisis cuantitativo del experimento se muestra en (A) realizó con el software Image J. *, P & lt; 0,05 y **, p≤0.01 como se determinó mediante la prueba t de Student. Dos experimentos independientes se agruparon juntos. (C) de transferencia de Western para ZEB1 y cuantificación realizada como anteriormente (se muestra el promedio de dos experimentos). (D) PCR de punto final para ZEB1. (E)
in vitro
transwell ensayo de invasión: la comparación de las células PC3 y PC3-ctrl miR-200b. 10% de FBS se utilizó como quimioatrayente y el experimento se realizó por duplicado. *, P & lt; 0,05 mediante la prueba t de Student. (F) Los
in vivo
metástasis espontáneas de células PC3-ctrl y PC3 miR-200b. Las células se implantaron de forma ortotópica en la próstata ventral de ratones desnudos masculinos. Los ratones fueron sometidos a imágenes de cuerpo entero de masas RFP-positiva imagen de la superficie utilizando. Al final del experimento, los animales fueron sacrificados, la cavidad peritoneal se abrieron y metástasis visualizado por imágenes de fluorescencia después de la eliminación de un tumor primario dentro de la cavidad peritoneal y en la pared frontal del abdomen (cavidad peritoneal). se muestran de campo claro (BF) y la fluorescencia (RFP, proteína fluorescente roja). (G) Cuantificación del experimento se muestra en la (F). Las metástasis fueron contados y la fluorescencia total por metástasis calculan (izquierda). carga metastásica macroscópica se estimó como fluorescencia total por ratón. Ctrl indica control y 200b indica miR-200b. **, P≤0.01 mediante la prueba t de Student.

miR-200b Disminuye la invasión y metástasis de células PC-3

Debido a que el miR-200b causado reversión de EMT en el CaP PC- 3 células, era razonable esperar que un potencial invasivo disminuyó también. El uso de un procedimiento estándar para medir la invasión de células, se observó una disminución significativa en el porcentaje de células invadidas debido a la expresión de miR-200b, en comparación con el control (Figura 5e). Esta invasión disminuido probablemente subyace en la disminución de la metástasis regional PC3 miR-200b células
in vivo
.

inyección ortotópico de células PC-3 y el control de vectores de los padres en las próstatas dorsal de ratones macho atímicos resultado en metástasis espontánea, como se detectó después de la eliminación de los tumores primarios (Fig. 5f y la Figura S2). La fluorescencia en general, debido a la metástasis se redujo drásticamente en los ratones implantados con los PC-3 células que sobreexpresan el miR-200b (Figura 5f, G y Figura S2). Así, nuestros datos sugieren que el miR-200b disminuye significativamente las características mesenquimales en células de cáncer de próstata y por lo tanto reduce sus características invasoras y potencial metastásico.

miR-200b Reduce la angiogénesis tumoral

Otra característica que puede permitir la metástasis es la angiogénesis y EMT suele ir acompañada de aumento de la angiogénesis. La expresión de miR-200b apareció para revertir cambio angiogénico en las células PC-3 como se evidenció por la disminución de la densidad microvascular en los tumores de miR-200b positivos en comparación con los tumores de control PC-3 o vector parental (Fig. 6).

Secciones de los tumores formados por control y miR-200b positivos PC-3 tumores se tiñeron para el marcador CD31 endotelial y el número de microvasos por campo determinadas en diez 10 × campos. *, P & lt;. 0,01

Discusión

La familia de miR-200 es una familia de tumor supresor de microARN que juegan un papel crítico en la supresión de la EMT. Mientras que el papel de la familia miR-200 en mama y otros cánceres epiteliales está bien establecida, hay pocos descubrimientos que relacionan el miR-200 con cáncer de próstata. Un estudio a pequeña escala (20 pacientes) sugiere una asociación entre la recaída bioquímica después de la prostatectomía radical y los niveles más bajos de miR-200c [30]. Un estudio de He
et al.
Demuestra que los niveles bajos de miR-200b-3p en las células independientes de andrógenos son causadas por disminución de la expresión de la p73 proteína relacionada con p-53-y contribuyen a un aumento de la proliferación [31] . Los dos grupos que codifican la familia miR-200 se encuentran en los cromosomas 1 y 12, con el miR-200b, miR-200a, y miR-429 en el cromosoma 1 y miR-200c y miR-141 en el cromosoma 12. 200c microARN se piensa que es epitelial específica y su expresión es reprimida por la hipermetilación de la isla CpG proximal en los fibroblastos y en las líneas celulares de cáncer de mama [32]. En el PC-3, pero no en las células LNCaP y DU145 CaP, la hipermetilación similar de la isla CpG coincide con los bajos niveles de miR-200c y miR-141 [32]. De acuerdo con nuestros resultados, en este estudio las células PC3 negativos para miR-200c y miR-141, presentan un fenotipo mesenquimal clara y la capacidad de invasión y metástasis [32]. Dos estudios indican el papel de miR-200 en la tumorigénesis de las células madre de PCA. En células de CaP madre-como la expresión de Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B y /o Notch1 es consistente con la supervivencia clonogénico mejorada y la capacidad de formar esferoides (prostaspheres). Estas características madre-como están conectados a una disminución de la expresión de miR-200b /c y /o de let-7 de la familia mediante el cual la re-expresión de miR-200 inhibe la formación de prostasphere y reduce Notch1 y Lin28B, los conductores de auto-renovación [33] . En un estudio relacionado, los clones tumorigénicas invasivos derivan de la hiperplasia prostática benigna (HPB) -1 línea celular expuestos crónicamente a las funciones de visualización de EMT prominentes TGF-ß con altos niveles de SNAI2, ZEB1, y ZEB2, todos miR-200 blancos confirmados; Sin embargo, las basales de miR-200 en los niveles de estas células se mantienen inalteradas que sugiere un mecanismo divergentes [34].

Las características madre-como aumentada sugieren tumorigenicidad mejoradas. De hecho, varios grupos han demostrado que el miR-200b altera la tasa de crecimiento de tumores experimentales por las células de CaP en cultivo [35]. Nuestros datos corroboran claramente estas observaciones.

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