Extracto
Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes, que son reguladores críticos de diversas enfermedades. El microARN-20a (miR-20a) previamente ha alterado de manera significativa en una variedad de cánceres. En este estudio, hemos detectado la relación entre el miR-20a y el desarrollo de cáncer de cuello uterino mediante qRT-PCR, se encontró que el nivel de expresión de miR-20a fue significativamente mayor en los pacientes con cáncer de cuello uterino que en los controles normales, la expresión aberrante de MIR -20Â se correlacionó con metástasis en los ganglios linfáticos, el grado histológico y el diámetro del tumor. Entonces hemos establecido con éxito las líneas estables anti-miR-20a cervical de células de cáncer de lentivirus. Inhibido miR-20a impide la progresión del tumor mediante la modulación del ciclo celular, apoptosis, y la metástasis in vitro e in vivo. TIMP2 y ATG7 se demostraron ser blanco directo de miR-20a, usando el ensayo de luciferasa y Western Blot. Estos resultados indican que miR-20a suprime la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer de cuello de útero a través de la orientación ATG7 y TIMP2. Nuestros resultados apoyan la participación de miR-20a en la tumorigénesis cervical, especialmente metástasis en los ganglios linfáticos. Proponemos que los miRNAs podrían usarse como agente terapéutico para el cáncer de cuello de útero
Visto:. Zhao S, D Yao, Chen J, N Ding, Ren F (2015) miR-20a Promueve cáncer de cuello proliferación y metástasis in vitro e in vivo. PLoS ONE 10 (3): e0120905. doi: 10.1371 /journal.pone.0120905
Editor Académico: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 25 de Septiembre, 2014; Aceptado: 27 de enero de 2015; Publicado: 24 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro de los archivos de información de apoyo
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (No.2011GXNSFA018184 y 2013GXNSFBA019132), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81460398), y apoyado por el Departamento de Salud de Guangxi (No.Z2013018). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es el segundo tipo más común de cáncer en mujeres en todo el mundo, que es la principal causa de muerte por cáncer, lo que resulta en alrededor de 300.000 muertes cada año [1]. La mayoría de los pacientes con cáncer de cuello uterino reciben radioterapia y la quimioterapia estándar. Sin embargo, los resultados clínicos varían significativamente. De acuerdo con el mundo, había alrededor de 500.000 nuevos casos cada año, el 85% de los tipos patológicos fueron el carcinoma de células escamosas. Aunque la criba citología cervical beneficia mucho en la detección temprana y el tratamiento temprano de las últimas décadas, las tasas de morbilidad del cáncer de cuello uterino siguen siendo altos, y no hubo más y más casos jóvenes recientemente. Así que muchos investigadores se dedican a encontrar la patogénesis y la terapia de tumores más eficaz. microRNAs (miRNAs) son pequeños ARN no codificante de aproximadamente 21-25 nucleótidos (nt) y actúan como reguladores post-transcripcional de la expresión génica [2]. Estas pequeñas moléculas se han encontrado para regular los genes implicados en diversos procesos biológicos tales como la proliferación celular, el desarrollo, la diferenciación, la apoptosis y otros. Numerosos estudios han demostrado que las alteraciones en la síntesis de miRNAs en los cánceres humanos suelen estar relacionados con el desarrollo del tumor, la progresión y la metástasis [3]. Nuestros primeros experimentos de hibridación de matrices compararon el perfil de expresión de microARN entre los tejidos normales del cuello del útero y cuello uterino escamosas tejidos carcinomas de células, se examinaron 89 miRNAs, y miR-20a se reguló hasta-significativamente. MiR-20a se sabe que pertenece a la agrupación de miR-17-92, que es el grupo más ampliamente estudiado que tiene una función oncogénica [4]. En este estudio nos centramos en el miR-20a, que podría ser un punto de partida prometedor para el desarrollo futuro tratamiento contra el cáncer de cuello de útero basados en miARN.
Materiales y Métodos
Declaraciones éticas
La procedimiento de autorización y la conductancia de este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad médica de Guangxi. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki. Los datos se recogieron de forma anónima. Verbal se obtuvo el consentimiento de todos los sujetos, fue testigo, y se registra formalmente por cada encuesta. Se obtuvo el consentimiento por escrito para el uso de las muestras con fines de investigación de todos los pacientes antes de la cirugía. experimento con animales se llevó a cabo en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos, y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad Médica de Guangxi.
pacientes y muestras
muestras de tejido del cuello uterino se recogieron del departamento de oncología ginecológica, el tumor Afiliado del hospital de la Universidad médica de Guangxi entre 2010 y 2011. Ochenta muestras de cáncer de cuello uterino de la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO ) stageⅠ-ⅱA se obtuvieron de pacientes que se sometieron a tratamiento quirúrgico. Veinte muestras de stageⅡB-Ⅳ se obtuvieron de biopsia de cuello uterino. Todas las muestras fueron carcinoma de células escamosas. No hay un tratamiento local o sistémico anterior había sido llevado a cabo en estos pacientes antes de la operación o una biopsia. MNV fue confirmada en pacientes de fase Ⅰ-ⅡA que utilizamos para la operación del primer tratamiento. La edad media de los pacientes fue de 49 años con un rango de 25 a 69 años. Normales muestras de epitelio cervical se obtuvieron de 120 pacientes que tuvieron una histerectomía por enfermedad benigna. La edad media de los sujetos de control fue de 45 años, de entre 33 y 57 años. Los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la extirpación quirúrgica y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.
Quantitative Real-Time Reacción en Cadena de la Polimerasa
ARN fue extraído de los tejidos de cáncer de cuello uterino frescos congelados, tejidos normales del epitelio cervical y células de cáncer cervical utilizando el kit de aislamiento de miRcut miRNA (Tiangen, china) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron utilizando un kit de MiraMasTM (Bioo científica, EE.UU.), que contiene poli polimerasa (A) utilizado para la poliadenilación de los genes miARN. QRT-PCR se realizó usando un kit estándar de SYBR Green PCR (Takara, Japón) .Las cebadores se sintetizaron (Shanghai GenePharma, China) como sigue: miR-20a reenvía cebador: TAC GAT AAA GTG CTT ATA GTG CAG GTA G. U6 hacia delante imprimación: GGA ATT ACG ATA CAG AGA AGA TT. cebador inverso universal: GTC CTT GGT CCG CGA GTG. La mezcla de 20 l de PCR consistió en 12,5 l SYBR Supermix Verde, 3,5 l de agua libre de RNasa, 1 l cebadores directos, 1 l atrás primers, y 2 hacia atrás l producto transcrito. Las condiciones de reacción fueron 40 ciclos de amplificación de 95 ° C durante 3 min, 95 ° C durante 12 s, y 62 ° C durante 50 s utilizando un BIO-Chromo4 (Bio-Rad, EE.UU.) el sistema de PCR cuantitativa en tiempo real. U6 se utilizó como referencia para miRNAs. Cada muestra se analizó por triplicado. comparativa ciclo umbral (CT) Método veces el cambio (2-ΔΔCT) se utilizó para analizar los cambios relativos.
Cell Cultura y
Las líneas celulares de cáncer cervical SiHa, HCC94, C33A y Caski se obtuvieron a partir laboratorio central del hospital de Tumores Afiliado de la Universidad médica de Guangxi. Estas células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% en RPMI-1640, con suero bovino fetal al 10%.
Establecer las líneas cervicales anti-miR-20a estables de células de cáncer de lentivirus
los vectores de lentivirus con miRNAs que se basaban en el marco de miR-20a fue construido por la Compañía GeneChem (Shanghai, china). Brevemente, el oligonucleótido de doble cadena que codifica anti-miARN y control negativo se hibridaron y se insertaron en los eucariotas Pfu-GW-009 vector linealizado (GeneChem). Todos estos vectores se confirmaron por secuenciación. Los vectores de recombinación y los vectores de embalaje (pHelper 1,0 y 2,0) (pHelper GeneChem) se co-transfectaron en células 293T (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) con Lipofectamine2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes de cultivo se recogieron a las 48 horas después de la transfección, se concentró. Todos los vectores lentivirales expresadas aumento de proteína verde fluorescente (GFP), lo que permitió tittering y la medición de su eficacia de infección en células infectadas. Las células se dividieron en tres grupos de acuerdo con nuestros objetivos: a: sin infección del virus (Carolina del Norte); b: infección de virus de control (NC-LV); c:.. la infección de anticuerpos anti-miR-20a virus (anti-miR-20a-LV)
función de la biología celular en
ensayo de viabilidad celular in vitro
La capacidad de proliferación celular se midió con el ensayo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT). Veinticuatro horas después de la transfección, 1 × 10
4 células fueron sembradas en placas de microtitulación de 96 pocillos durante 24, 48, 72, y 96 h, respectivamente. A continuación, las células se incubaron con 20 l de MTT (5 mg /ml, pH = 7,4) durante 4 horas a 37 ° C y 150 l de sulfuro de dimetilo, se añadió para solubilizar los cristales de 20 min a temperatura ambiente. La densidad óptica (OD) se midió a una longitud de onda de 490 nm. Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces y se calcularon utilizando los resultados promedio, que utilizamos para dibujar las curvas de crecimiento. tasa de inhibición del crecimiento se calcula de la siguiente manera: (AC-AT) /AC × 100% (AC = valor de absorbancia de la NC y AT = valor de la absorbancia del grupo experimental)
ensayo de ciclo celular.. Las células se fijaron en etanol al 70% durante 2 horas a 4 ° C. Después de lavar con PBS, las células se trataron con ARNasa A (50 mg /ml) y se tiñeron con yoduro de propidio (25 g /ml) durante 30 min a 37 ° C. Las muestras se analizaron utilizando un citómetro de flujo y la distribución de las fases del ciclo celular se determinó utilizando Modfit Software (BD Biosciences). El índice de proliferación se calculó como el porcentaje de células en /M-fase S /G2.
ensayo de apoptosis de la célula.
Las células se recogieron y se tiñeron con anexina V-PE y 7AAD utilizando la anexina Kit V-PE (Beckman) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se sometió a análisis de citometría de flujo.
ensayo invasivo y migración.
50.000 células fueron sembradas en transwell inserto (Corning) suplementado con 1640 con 10% de suero. El lado inferior de los cultivos polarizados se llenó con 1640 con 20% de suero. Para el ensayo de transmigración, Matrige l (BD Biosciences) se sembró en transwell inserto y se dejaron crecer hasta la confluencia durante 1 día. 50.000 células fueron sembradas en insertos Transwell suplementado con 1640 con 10% de suero. El lado inferior de los cultivos polarizados se llenó con 1640 con 20% de suero. Después de 24 horas, las membranas se tiñeron utilizando la tinción con hematoxilina-eosina, las células se contaron bajo el microscopio fluorescente. Este experimento se realizó de forma independiente en tres ocasiones en los duplicados.
ensayo de formación de colonias.
Se colocaron aproximadamente 500 células en una placa de 6 pocillos fresca durante otras 12 horas y se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contiene 10% FBS durante 2 semanas. Las colonias se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en 20% de metanol durante 15 min. Las células se contaron bajo el microscopio fluorescente. Este experimento se realizó de forma independiente en tres ocasiones en los duplicados.
Ensayos in vivo para la proliferación del tumor
Veinticuatro de 6 semanas de edad que pesa 19-21 g inmunodeficientes beige /desnudo /XID nu /nu hembra ratones se adquirieron de la Universidad médica de Guangxi, y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos con Chow irradiado. En nuestro experimento, 2 × 10
6 células de diferentes grupos en 0,2 ml de PBS se inyectó subcutáneamente en el tronco de 24 ratones, lo que lleva a la formación de un tumor por animal. hidrato de cloral 0,2 ml se inyecta por vía intraperitoneal a tomar imágenes fluorescentes después de la anestesia cuando el diámetro del tumor fue de 2 cm. Dibujar la curva de crecimiento. El crecimiento del tumor fue supervisado por el volumen del tumor, que se calculó como se describe:. Volumen (mm
3) = anchura
2 (mm
2) x longitud (mm) /2
Western blot
Las proteínas celulares se prepararon usando tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, EDTA 2 mM, NaCl 10 mM, 2 mg /ml de aprotinina, 5 mg /ml leupeptina, 2 mg /ml de pepstatina, DTT 1 mM, 0,1% de SDS y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM). Igual cantidad de proteínas (50 g) fueron separados por SDS PAGE al 10% y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (NY, EE.UU.) mediante electrotransferencia. Las membranas se bloquearon con 5% de BSA en TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, y 0,05% de Tween 20) durante 1 h, y después se incubaron con anticuerpos primarios (Santa Cruz) durante la noche a 4 ° C antes de incubación posterior con segundo anticuerpo (BD) durante 1 hora a 37 ° C. La proteína se visualizó usando el reactivo de quimioluminiscencia (Santa Cruz).
luciferasa ensayo
Los sitios de UTR 3 'ATG7 /o mutante TIMP2 3' UTR de unión de miR-20a se clonaron en el reportero pGL3 vector de luciferasa (GeneChem). Para el ensayo de reportero, 100 nM miR-20a imitar o controlar miRNA fue co-transfectadas con 0.1μg de la de tipo salvaje pGL3-3'UTR o ADN de los plásmidos mutantes en células SiHa en placas de 96 pocillos utilizando Lipofectamine 2000. La actividad de luciferasa se midió 48 horas después de la transfección como se ha descrito anteriormente.
El análisis estadístico
Todos los datos fueron procesados mediante PASW Statistics 16. Los datos se presentan como media ± SEM. mediante pruebas t para las comparaciones 2-grupo. Si bien los resultados no mostraron una distribución normal, optamos por analizar los datos con métodos no paramétricos. (Prueba de Mann-Whitney U entre dos grupos y la prueba de Kruskal-Wallis H para tres o más grupos). Un
valor de p inferior a 0,05
se considera estadísticamente significativo.
Resultados
miR-20a se regula en marcha en el cáncer de cuello de útero
El uso de un QRT método de PCR, se detectaron los niveles de miR-20a en 100 tejidos cervicales cáncer y 120 tejidos cervicales normales, así como líneas de células cervicales. Entre los 100 pacientes con cáncer de cuello uterino, los datos reportados en la Fig. 1A muestra el miR-20a es definitivamente hasta reguladas en el tejido deteriorado con una mediana de 6,92, lo que sugiere que el aumento de miR-20a fue un evento frecuente en el cáncer de cuello uterino. Los pacientes con hasta reguladas expresión de miR-20a tendían a tener MNV (
P
= 0,001) como en la figura. 1B, el aumento del tamaño del tumor (
P = 0,013
, Mann-Whitney U test), en estadio avanzado (
P = 0,004
, prueba de Kruskal-Wallis H), y el grado histológico avanzado (
P = 0,027
, Mann-Whitney U test) de cáncer de cuello uterino. Estos resultados sugieren que el miR-20a podría desempeñar un papel crítico en la metástasis del cáncer de cuello uterino y la progresión
A:. MiR-20a se midió mediante qRT-PCR. Datas se presentaron como log10 del factor de cambio. Se realizó la prueba de Mann-Whitney para examinar la diferencia entre los controles normales y pacientes con cáncer de cuello uterino, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis H para definir la diferencia entre los estadios I-IV de pacientes con cáncer de cuello uterino. B: Se comparó la expresión entre los pacientes que tenían metástasis en los ganglios lymp o no en el mismo escenario. C: Los niveles de expresión de miR-20a se detectó mediante qRT-PCR en líneas celulares de cáncer de cuello uterino (SiHa, HCC94, C33A y Caski).
P-valor
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Por otra parte, los niveles de expresión de miR-20a se detectaron mediante qRT-PCR en líneas celulares de cáncer de cuello uterino (SiHa, HCC94, C33A y Caski) (Fig. 1C), que fue el más alto en la línea celular SiHa.
miR-20a facilita el crecimiento del cáncer de cuello del útero y la metástasis in vitro
Teniendo en cuenta la correlación entre los niveles regulados hasta el miR-20a y la progresión del cáncer de cuello uterino, se investigó el efecto de miR-20a en las capacidades de crecimiento, migración e invasión de líneas celulares de cáncer de cuello uterino. línea celular SiHa estaba infectado con cualquiera de anti-miR-20a o el control de los lentivirus y establecer la línea estable de células SiHa anti-miR-20a (Fig. 2A). En comparación con la expresión del grupo de control, el miR-20a fue significativamente las reguladas en la línea celular SiHa después de la infección con anti-miR-20a-LV (Fig. 2B). Las células se dividieron en tres grupos de acuerdo con nuestros objetivos: a: sin infección del virus (Carolina del Norte); b: infección de virus de control (NC-LV); c:. la infección de anticuerpos anti-miR-20a virus (anti-miR-20a-LV)
A: GFP etiquetado flujo citometría de análisis indicó que el porcentaje de células positivas para GFP fueron aproximadamente un 97% en el establo lentivirus infectan- línea celular SiHa. B:. MiR-20a se expresó más baja en la línea celular SiHa anti-miR-20a estable, mientras que el nivel de expresión de miR-20a seguía siendo muy alta en las células infectadas con el control negativo
A continuación, el crecimiento celular características, ciclo celular, formación de clon, la migración celular, la adhesión, se realizaron experimentos de invasión celular. Las curvas de crecimiento mostraron que la infección de crecimiento de la línea celular de cáncer cervical anti-miR-20a se redujo (Fig. 3A). La citometría de flujo mostró que el promedio de período G1 de las células en el grupo de anti-miR-20a-LV es 69,6%, mientras que el grupo de control correspondiente fue de 55%, es en la reducción del ciclo de proliferación de las células (Fig. 3B). tasa de apoptosis se incrementó y alcanzó significación estadística diferencias en cada grupo (
P Hotel & lt; 0,001) (Fig. 3C). Migración, también se detectó capacidad de adhesión de la invasión en células de cáncer cervical, miR-20a podría facilitar la metástasis (
P
& lt; 0,01) (Fig. 3D y 3E). La tasa de formación de colonias de los dos grupos, hubo una diferencia significativa (
P
& gt; 0,05) (Fig. 3F). Como era de esperar, los pies en la expresión de miR-20a suprimió de forma significativa la capacidad de proliferación celular, la migración y la invasión
A:. Abajo reguladas miR-20a proliferación celular inhibió significativamente en las células SiHa por ensayo MTT. B: Ciclo celular determinada por citometría de flujo de tinción PI. C: la apoptosis de la célula detectada por Anexina V-PE flujo etiquetado combinado citometría, tasa de apoptosis se aumentó y alcanzó significación estadística diferencias en cada grupo. D, E representa los resultados de la invasión de células y la migración a través de la membrana, con o sin Matrigel, que mostró que el anti-miR-20a reduce la capacidad de migración celular y la invasión. F: Las tasas de formación de colonias de estos tres grupos no tenía ninguna diferencia significativa
miR-20a aumenta el crecimiento del tumor in vivo
Sobre la base de la disminución observada en los comportamientos migratorios, invasivos y proliferativas. en las células SiHa infectadas con anti-miR-20a-LV, el próximo investigó el papel de miR-20a in vivo. Nos inoculadas subcutáneamente ratones desnudos con igual número (1 × 10
6 células por ratón) de células SiHa con la expresión forzada de miR-20a o NC, la incidencia de tumores se evaluó cada cinco días, y los tumores aparecieron en todos los ratones. Los resultados mostraron que lentivirus mediada por anti-miR-20a puede suprimir significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de cuello uterino en ratones desnudos (Fig 4).
A:. Se estableció modelo de cáncer por vía subcutánea trasplantado cervical humano en ratones desnudos. Al final del experimento, se midieron los volúmenes tumorales para dibujar la curva de crecimiento de los diferentes grupos. En el modelo de tumor subcutáneo la dimensión del tumor en el grupo experimental es menor que en el grupo de control. Hubo una diferencia significativa entre cada grupo (
P
& lt; 0,01). B:. Fotos de tumores en cada grupo
miR-20a directamente a las metas e inhibe ATG7 y TIMP2
Para entender cómo miR-20a facilita el crecimiento del cáncer de cuello uterino y la metástasis, hemos utilizado tres algoritmos (TargetScan, PicTar y Miranda) para ayudar a identificar los objetivos de miR-20a en los cánceres cervicales humanos. De estos genes diana que se predijo por los tres algoritmos (Fig. 5A), la proteína relacionada con la autofagia 7 (ATG7) e inhibidores tisulares de la metaloproteinasa 2 (TIMP2) atrajeron la atención de inmediato, ya que han sido implicados en la tumorigénesis y metástasis. Hemos clonado el ATG7 y TIMP2 3'-UTR en un vector indicador de luciferasa. Ensayo de la luciferasa reveló que miR-20a unido directamente a ATG7 y TIMP2 3'-UTR, y por la que se reduce notablemente las actividades de luciferasa (Fig. 5B). Sin embargo, la mutación de los sitios de miR-20a putativos en la 3'-UTR de ATG7 y TIMP2 abrogó la capacidad de respuesta de la luciferasa de miR-20a. Para evaluar directamente el efecto de miR-20a en ATG7 y TIMP2 expresión, se realizó un análisis de transferencia Western. Como se ve en la Fig. 5C, desmontables de miR-20a, a través de la infección de anti-miR-20a-LV, en las células SiHa aumentó los niveles de proteína y ATG7 TIMP2. Tomados en conjunto, estos resultados indican ATG7 y TIMP2 son abajo objetivos directos de miR-20a en las células SiHa. Los resultados anteriores nos llevó a examinar si el miR-20a suprime el crecimiento del cáncer de cuello uterino y la metástasis a través de la represión de ATG7 y expresión TIMP2
A:. Predicción de emparejamiento consecuente de la región de destino y miARN por TargetScan, PicTar y Miranda. B: La actividad de luciferasa muestra una disminución significativa siguiente expresión forzada de miR-20a en comparación con el grupo control negativo. C:. Western blot análisis mostró caída de miR-20a, a través de la infección de anti-miR-20a-LV, en las células SiHa aumentaron los niveles de proteína y ATG7 TIMP2
Discusión
Nuestro grupo se ha centrado en el mecanismo molecular del desarrollo carcinoma de células escamosas de cuello uterino en los últimos años, especialmente dedicando a la investigación del crecimiento y la metástasis. ganglionar (MNV) es el más importante factor pronóstico de los pacientes con estadio IB o IIA, la tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes disminuye drásticamente desde aproximadamente el 80-95% en pacientes sin metástasis en los ganglios linfáticos de aproximadamente 50-65% en los pacientes con ganglios linfáticos positivos. Por lo tanto, se esperaba que la desregulación de los microARN puede facilitar el progreso avanzado de carcinoma de células escamosas de cuello uterino. Zhang J, et al arrojar luz sobre la regulación de la retroalimentación negativa de NF-kB /miR-130a /TNF-α /NF-kB en el cáncer de cuello de útero y puede dar una idea de la carcinogénesis del cáncer de cuello de útero [5]. Wen SY, et al encontró que el miR-506 expresión se había reducido regulado en aproximadamente el 80% del cáncer de cuello uterino muestras examinadas e inversamente correlacionada con la expresión de Ki-67 [6]. Entre los miRNAs oncogénicos, uno de los mejor caracterizados es el miR-17-92, un grupo policistrónico miARN, designado como OncomiR-1 [7]. El RNA precursor contiene estructuras de horquilla tallo-bucle de seis tándem que finalmente producen seis miRNAs maduros: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, 19b-miR-1 y miR-92-1 [8]. En particular, miR-17-92 está situado en 13q31.3, una región amplificada en varias malignidades hematopoyéticas y tumores sólidos, incluyendo los linfomas difusos de células B, linfomas foliculares, linfomas de Burkitt y el carcinoma de pulmón [9].
los resultados recientes indican que estos miRNAs son componentes de las vías moleculares que regulan el desarrollo de tumores y mantenimiento tumor integrados, los efectos de la sobreexpresión de miR-20a han sido examinados en varios modelos animales, los cánceres humanos, y sistemas de cultivo de células por su capacidad para regular una serie de procesos celulares que favorecen la transformación maligna [10-11]. Estos estudios en su conjunto revelaron que las funciones de miR-20a pleiotropically tanto durante el desarrollo normal y la transformación maligna de promover la proliferación, la diferenciación inhiben, aumentan la angiogénesis, y mantener la supervivencia celular. Sin embargo, la función de potencial de este microRNA en la progresión del carcinoma de células escamosas de cuello uterino humano tiene pocos informes. En el presente estudio, estamos interesados en el papel potencial de miR-20a en la progresión maligna de las células SiHa.
En este estudio, encontramos que el miR-20a era con frecuencia hasta reguladas en las muestras de tejido. Por lo tanto, se supone que el miR-20a puede ser un nuevo oncogén tumor miARN y su desregulación puede implicar el progreso avanzado de cáncer humano. A continuación, se investigó la función de miR-20a en las células SiHa. Establecer las líneas celulares de cáncer de cuello uterino anti-miR-20a estables por lentivirus, y preceder a las características de crecimiento celular, el ciclo celular, la formación de clon, la migración celular, la adhesión, y los experimentos de invasión. El modelo de xenoinjertos de cáncer de cuello uterino miR-20a-expresado abajo en ratones desnudos también se estableció que exploran el potencial de anti-miR-20a in vivo. Entonces se encontró que inhibe miR-20a impide la progresión del tumor mediante la modulación del ciclo celular, la proliferación, la apoptosis, y la invasión. Las curvas de crecimiento mostraron que la infección de crecimiento de la línea celular de cáncer cervical anti-miR-20a se desaceleró. se estableció el modelo de miR-20a xenoinjertos de cáncer de cuello uterino expresado abajo-en ratones desnudos, los resultados mostraron que los lentivirus mediada por anti-miR-20a puede suprimir significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de cuello uterino en ratones desnudos.
más ATG7 caracterizado y TIMP2 objetivos funcionales de miR-20a por los ensayos de gen reportero de luciferasa y Western blot, respectivamente. La autofagia ofrece componentes citoplasmáticos a los lisosomas para la degradación y el reciclaje de los productos de degradación, tales como aminoácidos, hidratos de carbono y lípidos que se utilizan para sintetizar nuevas proteínas y orgánulos o metabolizados para suministrar energía [12]. La autofagia está íntimamente asociada con la muerte celular y la apoptosis eucariota. De hecho, en algunos casos las mismas proteínas controlan tanto la autofagia y apoptosis. Apoptótica de señalización pueden regular la autofagia y por el contrario la autofagia puede regular la apoptosis. Se ha propuesto que "la muerte celular por autofagia" es otro tipo de muerte programada "activa" [13]. ATG7 es uno de los reguladores maestros del proceso de autofagia, responsable de dos reacciones principales implicadas en la formación y en autophagosome vesícula progresión [14]. Por otra parte, ya se había establecido que ATG7 - /- ratones knockout mueren dentro de un día desde el nacimiento y muestran la reducción del tamaño perrito, debida a una vía de la autofagia alterada [8]. Yoshihiro Inami, et al encontró que la pérdida de ATG7 en el hígado del ratón provoca adenoma hepatocelular [15]. A través de la utilización de moléculas de ganancia o pérdida, hemos demostrado que el miR-20a era capaz de modular la autofagia variando los niveles de expresión endógenos ATG7, y este efecto es mediado a través de una secuencia de consenso de miR-20a contenida en la 3'-UTR del gen .
Durante el proceso de invasión tumoral, pasos esenciales incluyen la degradación de las membranas basales y la remodelación de la matriz extracelular (ECM) por las enzimas proteolíticas, tales como las metaloproteinasas de matriz (MMPs) en virtud de la regulación por los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP ). MMPs, especialmente MMP-2 y MMP-9, son enzimas clave conocidos para degradar los componentes de la ECM circundante durante la invasión del cáncer y la metástasis [16]. La predicción computacional de sitios miRNAtarget sugirió TIMP2 tal vez el objetivo de miR-20a, que fue verificada por el ensayo de luciferasa y Westernblot también.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que la expresión de miR-20a puede estar relacionado de un proceso maligno de cáncer de cuello uterino, especialmente la invasión y la metástasis por la orientación ATG7 y TIMP2. Se necesitan a gran escala y los estudios de seguimiento a largo plazo para confirmar la importancia de miR-20a en el cáncer de cuello uterino. MiRNAs pueden ser un objetivo atractivo para la intervención terapéutica.
Apoyo a la Información
S1 Fig. . Fondo de la correspondencia
A: mapa Lentivirus vector; B mapa pGL3 promotor del vector
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s001 gratis (DOC)
S2 Fig. Lentivirus vector resultados de la secuenciación
doi: 10.1371. /Journal.pone.0120905.s002 gratis (DOC)
S1 conjunto de datos. . secuencias de genes diana por síntesis química
Ambos lados de las secuencias de codificación fueron XbaI sitios de enzimas de restricción de corte, zonas marcadas se comportándose sitios
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s003 gratis (DOC)
S1 tabla. Asociación entre la expresión de miR-20a con las características clínico-patológicas en pacientes con cáncer de cuello uterino
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s004 gratis (DOC) sobre Table S2. valor de la DO después de la infección (MTT)
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