Extracto
El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) vía de señalización tiene ha encontrado que desempeñan papeles importantes en el desarrollo y progresión de cánceres humanos mediante la regulación de los procesos de proliferación celular, apoptosis, migración, invasión, metástasis, y la adquisición de la transición fenotipo epitelial-mesenquimal (EMT). Por otra parte, la señalización de PDGF también se ha encontrado para alterar el perfil de expresión de miRNAs, que conduce a la reversión de EMT fenotipo. Aunque el papel de los miRNAs en el cáncer se ha documentado, existen muy pocos estudios que documentan las consecuencias celulares de objetivo re-expresión de miRNAs específicos. Por lo tanto, se investigó si el tratamiento de las células de cáncer de páncreas humano con PDGF podría alterar el perfil de expresión de miRNAs, y también se evaluó las consecuencias celulares. Nuestro estudio demuestra que miR-221 es esencial para el fenotipo PDGF mediada EMT, la migración y el crecimiento de células de cáncer pancreático. Baja regulación de TRPS1 por el miR-221 es fundamental para la adquisición mediada por PDGF de la EMT fenotipo. Además, el incremento de PDGF-dependiente de la proliferación celular parece estar mediado por la inhibición de un objetivo específico de miR-221 y la baja regulación de p27Kip1
Visto:. Su A, He S, Tian B, W, Hu , Zhang Z (2013) microARN-221 media los efectos de PDGF-BB sobre la migración, proliferación, y la transición epitelio-mesenquimal de las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (8): e71309. doi: 10.1371 /journal.pone.0071309
Editor: Takashi Tokino, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: April 2, 2013; Aceptado: June 27, 2013; Publicado: 13 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Su et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa más común de cáncer. -relacionado muerte en los Estados Unidos [1], y la agresividad del cáncer de páncreas es en parte debido a sus características de resistencia a fármacos intrínsecos y extrínsecos, que también están asociados con la adquisición del epitelio-mesenquimal transición (EMT) fenotipo [ ,,,0],2], [3]. La EMT es un proceso que es sugerente de características madre-como las células cancerosas, por lo que las células epiteliales con un fenotipo de adoquines adquieren características de las células mesenquimales con una morfología similar a fibroblastos en forma de huso [3], [4]. Este proceso implica el desmontaje de las uniones célula-célula, incluyendo la regulación por disminución de los marcadores epiteliales fenotipo de las células (E-cadherina, zonula occludens-1), así como la translocación de β-catenina de la membrana celular al núcleo, reorganización del citoesqueleto de actina, y la regulación de los marcadores de fenotipo de células mesenquimales (vimentina, fibronectina y N-cadherina) [4]. Este proceso reduce la capacidad adhesiva de las células mesenquimales fenotípicas, lo que conduce a un aumento de la migración celular y la invasión, lo que resulta en la agresividad del tumor [5].
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) puede regular muchos procesos celulares, incluyendo células proliferación, transformación, migración, invasión, la angiogénesis y la metástasis, mediante la activación de su receptor cognado [6]. En los últimos años, PDGF-BB y los afines de la tirosina quinasa beta-receptores se han encontrado para desempeñar papeles importantes en la adquisición del fenotipo epitelial-mesenquimal transición (EMT) de las células cancerosas [5], [7]. El tratamiento de las células de cáncer epitelial similar con la proteína PDGF purificado como resultado una disminución significativa expresión de E-cadherina y aumento de la expresión de la caja E zinc-finger homeo-cuadro 2 (ZEB2) que se une tanto a nivel de ARNm y proteínas en asociación con la inducción de características EMT [8]. ZEB2 ha demostrado estar involucrados en la regulación negativa de la expresión de muchos genes que codifican para proteínas cruciales del fenotipo de las células epiteliales, incluyendo la E-cadherina, concomitante con la sobre regulación de la expresión de vimentina [9]. Es importante señalar que PDGF también aumentó significativamente la expresión de la fibronectina, N-cadherina, y vimentina, con la pérdida concomitante de la E-cadherina. Sin embargo, más a fondo se requieren estudios sobre el mecanismo para entender cómo PDGF regula los procesos implicados en el fenotipo de la EMT.
Los microARN (miARN) han sido identificados que mejorar varios aspectos de la patogénesis del cáncer de páncreas, incluyendo metástasis, invasión, y auto-renovación [10]. Nuevas evidencias sugieren que la expresión de los genes que son fundamentales para la adquisición del fenotipo de las células tumorales EMT y la agresividad son regulados por miRNAs que conducen a la represión de traducción, ya sea o la degradación del ARNm diana [11], [12]. El miR-221 es altamente expresado en varias células cancerosas derivadas, incluyendo el carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata y células de carcinoma de tiroides [13], [14], [15]. Estudios recientes han demostrado que el miR-221 regula la EMT por la orientación TRPS1 (trico-rino-falángica síndrome de tipo 1) y el alivio de su inhibición de la ZEB2 [16]. Por otra parte, se ha demostrado que los altos niveles de miR-221 para promover la proliferación de estas células mediante la unión a la 3'-UTR del inhibidor del ciclo celular y tumor supresor p27Kip1 y la inhibición de su expresión [13], [15]. En los últimos años, la señalización de PDGF se ha encontrado para alterar el perfil de expresión de miRNAs, que conduce a la inversión del fenotipo EMT [17], [18].
Aunque el papel de miRNAs en el cáncer se ha documentado, hay muy pocos estudios que documentan la consecuencia celular del objetivo reexpresión de miRNAs específicos. Por lo tanto, la hipótesis de que la señalización de PDGF podría modular el fenotipo de EMT a través de la regulación de los genes miARN la biogénesis. En este estudio, se investigó si el tratamiento de las células de cáncer de páncreas humano con PDGF podría alterar el perfil de expresión de miRNAs, y también se evaluó las consecuencias celulares. Los resultados demuestran que PDGF exhibe sus efectos tanto en la proliferación celular y el fenotipo EMT mediante la inducción de la expresión de miR-221, que da como resultado la baja regulación de p27Kip1 y TRPS1 en células de cáncer pancreático.
Materiales y Métodos
Cell cultura y
Los cáncer pancreático ASPC-1 líneas celulares humanas estables obtenidos de banco de células Comisión de preservación de la cultura típica, Academia china de ciencias (Shanghai, china) se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen, CA) suplementado con suero bovino fetal 5% (FBS), 2 mmol /l de glutamina, 50 unidades /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina. Todas las células se mantuvieron en una atmósfera de 5% CO2 humidificado a 37 ° C
Reactivos y anticuerpos Investigación
recombinante humano PDGF-BB se adquirió de R & amp;.; D Systems. Químicamente sintetizado inhibidores de miRNA, imita, y los controles revueltos se obtuvieron de Dharmacon o Ambion. Los pequeños ARN de interferencia (siRNAs) sintéticos dirigidos TRPS1 o p27Kip1 humana eran la cautela Seleccionar RNAi (Invitrogen) y HP Validado siRNA (Qiagen). Las células se sembraron a 100.000 a 300.000 células /ml y se transfectaron por Oligofectamine (Invitrogen), reactivo de transfección DharmaFECT3 (Dharmacon) o RNAi MAX (Invitrogen) a las concentraciones indicadas. Los anticuerpos contra ZEB2, N-cadherina, y vimentina se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra ZEB1, snail1, Snail2, Twist, E47, E-cadherina y ZO-1 fueron adquiridos de Santa Cruz. Los anticuerpos contra TRPS1, p27Kip1 y GAPDH fueron adquiridos de Abcam. Conjugado con FITC anti-IgG de ratón para vimentina y E-cadherina tinción fue adquirido de Invitrogen. El kit de aislamiento mirVana miARN y miARN ensayos Taqman fueron adquiridos de Ambion y Applied Biosystems.
La transfección de genes miARN Imita y específicos anti-miRNAs
AsPC-1 células fueron sembradas a 3 × 10
5 células por pocillo en placas de seis pocillos y se transfectaron con miR-221 imita o miARN revueltos controles a una concentración final de 20 nM utilizando Oligofectamine (Invitrogen). células AsPC-1 se transfectaron con anti-miR221 (inhibidores de miARN) o un control anti-miARN a una concentración final de 200 nM utilizando el reactivo de transfección DharmaFECT3 (Dharmacon). Después de 3 días de la transfección, las células se dividieron y se transfectaron en varias ocasiones con el miR-221, los inhibidores de miRNA, o controlar cada 3-4 días durante los tiempos indicados.
pequeños ARN de interferencia y transfección
células AsPC-1 se transfectaron con 100 nmol humano TRPS1 /l, el ARN interferente pequeño p27Kip1 (si) o un control de siRNA (Santa Cruz), utilizando reactivo de transfección RNAi MAX. Los medios se retiraron después de una transfección de 24 horas, y luego se incubaron las células en medios que contienen 5% de FBS durante otras 24 horas. Los lisados celulares se prepararon para el análisis de Western blot, y el ARN total fue extraído de la inversa en tiempo real ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción.
Ensayo de proliferación celular
El ensayo MTT se realizó como se ha descrito previamente [19]. En total, 6 × 10
3 células se dividieron en placas de 96 pocillos. Las células se trataron con o sin 20 ng /ml de PDGF-BB durante 24 h, seguido de un ensayo de proliferación celular usando un ensayo no radiactivo CellTiter96 la proliferación celular (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 490 nm fue leído por un lector de placas de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Para el antígeno de células en proliferación nuclear (PCNA) tinción [20], las células AsPC-1 se tiñeron con un anticuerpo conjugado con FITC anti-PCNA (clon PC10) de Biolegend así como DAPI. Al menos 150 células fueron contadas por condición, y se presentan los porcentajes de células PCNA positivas.
Curación de Heridas Ensayo
Una herida ensayo de curación se realizó para examinar la capacidad de la migración celular y la invasión , como se describe anteriormente [21]. En pocas palabras, después de que las células crecieron hasta un 90-95% de confluencia en placas de 6 pocillos, una sola herida cero se generó con una punta de pipeta desechable de 200 l. Las heridas de rascar fueron fotografiados durante 7 h con un microscopio invertido Nikon con una cámara digital conectada, y sus anchuras se cuantificaron con el software ImageJ. Los datos se representaron gráficamente como el porcentaje de cierre de la herida, el establecimiento de la anchura inicial de cero como 100%. Los resultados se presentan como la media de mediciones por triplicado por condición en tres experimentos independientes.
Cell Invasion Ensayo
Los comportamientos invasivos de las células se ensayaron usando un ensayo de invasión Matrigel transmembrana. Transwell cámaras (Millipore) (8 micras de tamaño de poro) fueron recubiertas con Matrigel (15 mg /filtro). Las células (2,0 × 10
4) en medio libre de suero se sembraron en la cámara superior y la parte inferior de pozos se llenaron con medio completo. Las células se dejaron para invadir a través de la membrana recubierta con Matrigel durante 72 h a 37 ° C en 5% de CO2. Después de la incubación, las células se retiraron de la superficie superior del filtro por raspado con un hisopo de algodón. Las células invadidas que se adhirieron a la parte inferior de la membrana se fijaron con metanol y se tiñeron con DAPI. El número de células que penetró la membrana se determinó contando el número de células media de cinco campos de alta potencia seleccionados al azar.
Cuantitativo PCR en tiempo real
ARN se purificó usando RNeasy (Qiagen) o mirVana (Ambion) kits con la digestión DNasa en columnas RNeasy. El ADN complementario (ADNc) se consiguieron con la alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit (Roche). El análisis cuantitativo del cambio en los niveles de expresión se calculó por la máquina en tiempo real PCR (iQ5, Bio-Rad). Las condiciones de los ciclos de PCR fueron 94 ° C durante 3 min y 40 ciclos de (94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 20 s y 72 ° C durante 40 s). PCR en tiempo real se utilizó para cuantificar la expresión de mRNA. Las reacciones se realizaron por duplicado, y el umbral de delta-delta-Cycle valores (DDCT) se calcularon sobre la base de la media de los genes de normalización. ensayos TaqMan miARN se utilizaron para la cuantificación de miR-221, y los resultados se normalizaron a la media de los resultados obtenidos para RNU6B.
Análisis Western Blot
Western blot se realizó utilizando totales lisados celulares. Total de lisados de células de diferentes experimentos se obtuvieron lisando las células en tampón RIPA que contiene 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, NP-40, 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio 0,5%, fluoruro de sodio 2 mM, Na3VO42 mM 1% 2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, y 1 mM de cóctel inhibidor de proteasa. Los lisados celulares totales se separaron en geles de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore), inmunotransferencia con anticuerpos, y se visualizaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (Amersham Biosciences). Las bandas de proteína se cuantificaron por densitometría usando ImageJ software de análisis de gel (rsbweb.nih.gov/ij). Todos los valores se normalizaron a GAPDH.
inmunofluorescencia Microscopía
resumen, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron en 0,5% de Triton X-100 y luego se bloquearon con suero de cabra al 10%. Las células se incubaron durante 1 hora con anticuerpos contra E-cadherina (1:200) o vimentina (pre-diluido) en suero de cabra al 5%, y después se tiñeron durante 1 hora con un anticuerpo secundario conjugado con FITC (1:250 ). Las células fueron vistos por microscopía de fluorescencia y las imágenes fueron analizados utilizando el software Deporte Avanzada (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI).
Análisis estadístico
Los resultados presentados son la media de al menos tres experimentos, cada uno realizado por triplicado con los errores estándar. Los análisis estadísticos se realizaron mediante análisis de varianza seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey o la prueba de la t de Student usando SPSS15.0. los valores de p de 0,05 se consideraron significativos y se indican con asteriscos.
Resultados
PDGF Promovido migración y proliferación celular y alteraron la Epithelial- mesenquimales fenotipo de transición en ASPC-1 en las células
en primer lugar, examinamos si el PDGF promueve la migración celular usando un ensayo in vitro de la herida cero y el ensayo de invasión Matrigel transmembrana. En las células AsPC-1, el tratamiento con PDGF promueve fuertemente la migración de células (Fig. 1A, B). También se determinó si la proliferación celular se ve reforzada por PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) en las células AsPC-1. Los resultados del ensayo de proliferación celular MTT indicaron que PDGF aumentó el número de células viables 1,9 veces en comparación con el control (Fig. 1C). A continuación, confirmó estos resultados mediante el análisis cuantitativo de la tinción de PCNA. células ASPC-1 tratados con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h se tiñeron con PCNA para medir el número de células en proliferación (Fig. 1D). El resultado mostró que el aumento de PDGF mediada en la proliferación celular (1,6 veces) fue consistente con los resultados del ensayo de MTT en la Fig. 1B.
AsPC-1 en las células incubadas con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml) se sometieron al ensayo de cero de la herida (A) y el ensayo de invasión Matrigel transmembrana (B). Los resultados son la media ± SD. de triplicados mediciones de tres experimentos independientes. AsPC-1 en las células incubadas con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h se sometieron al ensayo de proliferación celular MTT (Los resultados se indican como las lecturas de absorbancia a 490 nm) (C) o se tiñeron con un FITC anticuerpo conjugado contra el PCNA marcador de proliferación y DAPI (se contaron 150 células por condición, y se presenta el porcentaje de células PCNA positivas.) (D). Los resultados son la media ± SD. para los ensayos por triplicado de tres experimentos independientes. Real-Time PCR se utilizó para determinar los niveles de ARNm para evaluar la expresión regulada por incremento de factores de transcripción (E) y genes EMT-específicos (F) en las células AsPC-1 se incubaron con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml, 24 hr ). Los niveles de ARNm relativas se normalizaron a GAPDH. Todos los tratamientos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se muestran como los medios ± SD. G: Las fotomicrografías de las células AsPC-1 incubadas con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h). Aumento original, 200X.
En este estudio, el uso de PCR en tiempo real, también se encontró que el tratamiento con PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) upregulated significativamente la expresión de represores de la transcripción en el procesos de la EMT, induciendo genes como ZEB2 en las células AsPC-1 (Fig. 1E). Hemos encontrado que no tiene ningún cambio en la expresión de Snail 1, Caracol 2, haga girar y E47. Estos cambios en la expresión eran concomitante con la pérdida de E-cadherina y zonula occludens-1 y con la ganancia de la vimentina, fibronectina y la expresión N-cadherina (Fig. 1F). Lo más importante, las células AsPC-1 tratadas con PDGF-BB muestran una morfología alargada /irregulares fibroblastoid, que mostró un aspecto en empedrado epitelial (Fig. 1G). Estos resultados sugieren que el PDGF condujo a la adquisición del fenotipo EMT.
Regulación de la expresión de los genes miARN por PDGF-BB Tratamiento en ASPC-1 en las células
En tiempo real se utilizó la PCR para determinar si el tratamiento de las células con PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) podría alterar la expresión de los genes miARN en comparación con las células no tratadas. Encontramos que el miR-221-3p y miR-221-5p eran dos de los pocos miRNAs enriquecidas en células AsPC-1 tratadas con PDGF-BB (Fig. 2A), lo que sugiere que el miR-221 expresión podría ser activado por la señalización de PDGF. Un curso temporal de la expresión de miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p y miR-222-5p fue examinado después del tratamiento de PDGF-BB en las células AsPC-1. MIR-221-3p y fueron inducidos miR-221-5p de 2,4 veces y 1,7 veces, respectivamente, después de 4 h de tratamiento con PDGF y disminuyó gradualmente por 10 h (Fig. 2B). Es importante destacar que se observó la inducción robusto tanto de los transcritos primarios (Pri-miR-221) y el producto intermedio (Pre-miR-221) de miR-221 tan pronto como 2 h después del tratamiento PDGF, lo que sugiere que miR-221 es probable que transcripcionalmente ser inducida por PDGF señalización (figura 2C).
A:. Los niveles relativos de miRNA en células ASPC-1 tratados con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) B, C: Tiempo -Curso expresión de la expresión relativa de miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p y miR-222-5p (B), y miR-221 transcripciones (Pri-miR-221), Pre- miR-221 o madurar el miR-221 (C) normalizaron a GAPDH (por Pri-miR-221 o pre-miR-221), o U6 pequeños ARN nucleares (por miR-221-3p, miR-221-5p, miR 222-3p, miR-222-5p y madurar miR-221) en células AsPC-1 tratados con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h). D: células AsPC-1 fueron tratados con vehículo o PDGF-BB (20 ng /ml), o transfectadas con un control negativo, el miR-221 imitan, anti-miR-221, o anti-miR-221 y seguidos por PDGF -BB tratamiento., y se sometió a QRT-PCR de miR221. Todos los tratamientos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se muestran como los medios ± SD.
miR-221 es esencial para la mediada por PDGF epitelial-mesenquimal transición fenotipo, Migración , y el crecimiento de las células AsPC-1
transfectaron células AsPC-1 con sintético miR-221 (miR-221 gráfico) o controlar mímica (que contiene una secuencia de GFP) y se examina el fenotipo de EMT. Exógenos miR-221 upregulated la expresión de ARNm y proteínas ZEB2 y vimentina, y reduce la expresión de E-cadherina ARNm y proteínas, similar al efecto de PDGF (Fig. 3A, B, C). A continuación, los oligonucleótidos de ARN contra miR-221 (anti-miR-221) se transfectaron en células AsPC-1 para inhibir la función miR-221. Anti-miR-221 transfección reduce tanto la basal y la expresión inducida por PDGF de miR-221 en más de un 70% (Fig. 2C). El análisis de transferencia Western (Fig. 3B) y PCR (Fig. 3C) en tiempo real indicaron que el fenotipo EMT mediada por PDGF-BB se vio afectada de manera significativa cuando miR-221 se inhibió. Estos resultados confirman que el miR-221 juega un papel esencial en el fenotipo EMT mediada por PDGF.
AsPC-1 células fueron transfectadas con un control negativo, los miR-221 imitan o oligonucleótidos antisentido a miR-221 ( anti-miR-221). Las células se trataron luego con PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h y se sometieron a QRT-PCR (A, C) o el análisis de transferencia Western (B) de los factores de transcripción y genes marcadores EMT-específicos. células AsPC-1 se transfectaron con un control negativo, los miR-221 imitan o oligonucleótidos antisentido a miR-221 (anti-mir-221) y se sometió al ensayo de transmembrana invasión Matrigel (D) en presencia o ausencia de 20 ng /ml de PDGF-BB. células AsPC-1 se transfectaron con un control negativo, los miR-221 oligonucleótidos imitan o antisentido para el miR-221 (anti-mir-221), seguido de un tratamiento de PDGF-BB durante 24 h, y después se tiñeron con FITC anticuerpo conjugado contra el PCNA marcador de proliferación y DAPI. En total, se contaron 150 células por condición, y se presenta el porcentaje de células PCNA positivas (e). Todos los experimentos de tratamiento en esta figura se llevaron a cabo por triplicado, y se muestran los resultados como las medias ± SD.
PDGF no sólo puede mediar en el fenotipo de la EMT, pero también puede promover la migración celular y la proliferación. Por lo tanto, AsPC-1 células fueron transfectadas con un miR-221 mímica, anti-miR-221, o anti-GFP (control) para examinar si la inducción de miR-221 por PDGF desempeña un papel en la migración celular y la proliferación. Cuando miR-221 función fue bloqueado por anti-miR-221, PDGF no alteró el nivel de la migración celular y la proliferación, lo que sugiere que la inducción de miR-221 es esencial para la migración celular PDGF-dependiente (Fig. 3D) y la proliferación (Fig . 3E). A la inversa, la transfección de la miR-221 imitan la migración celular solo significativamente elevado (Fig. 3D) y la proliferación (Fig. 3E) a un nivel similar al de las células no transfectadas tratadas con PDGF. Estos resultados indican que la inducción PDGF-dependiente de miR-221 es esencial para la promoción de la migración celular y la proliferación.
Por lo tanto, miR-221 media los efectos de PDGF sobre la migración, proliferación y diferenciación de las células ASPC-1 . Este resultado plantea la cuestión de si un único objetivo de miR-221 puede ser responsable de todos estos fenómenos, o si el miR-221 podría enviar la señal a través de múltiples objetivos funcional y físicamente distintos.
miR-221 Promueve la EMT al dirigirse a TRPS1
Un estudio previo ha demostrado que la familia GATA represor transcripcional TRPS1 puede inhibir la EMT por la disminución de la expresión ZEB2 [16], [22]. MIR-221 ha sido previamente demostrado que el objetivo TRPS1 mRNA, dando lugar a la reducción de expresión de los productos génicos a través de la degradación del ARNm y /o inhibición de la traducción [16]. En primer lugar, investigamos si el mRNA TRPS1 o los niveles de proteína son modulados por PDGF-BB en las células AsPC-1. El nivel TRPS1 ARNm se redujo en aproximadamente un 55% (Fig. 4A) tras el tratamiento de células AsPC-1 con PDGF-BB durante 24 h en condiciones que inhibió significativamente la expresión de marcadores de EMT (Fig. 3B, C). Por lo tanto, TRPS1 está regulada por la señalización de PDGF. Para evaluar si el miR-221 se hace responsable del PDGF-dependiente de la baja regulación de TRPS1, el imitador de miR-221 se transfectó en células ASPC-1, y después los niveles de proteína y ARNm de TRPS1, ZEB2, E-cadherina y vimentina fueron examinado por análisis de transferencia Western y PCR en tiempo real. Exógenos miR-221 redujo significativamente la expresión de TRPS1 y E-cadherina y el aumento de la expresión de ZEB2 y vimentina (Fig. 4B, C, D, E). Por el contrario, cuando más de 70% de endógeno miR-221 se agotó por anti-miR-221, los niveles de TRPS1 ARNm y proteínas fueron elevados (Fig. 4A, B), y las células AsPC-1 presentan el fenotipo EMT (Fig. 4F, G). Por otra parte, se observó que exógeno miR-221 no alteró aún más la expresión del fenotipo EMT después TRPS1 desmontables de siRNA. Más importante aún, el tratamiento PDGF-BB no reprimió TRPS1 en presencia de anti-miR-221 (Fig. 4A). Estos resultados demostraron que el miR-221 se dirige directamente a TRPS1 ARNm, como se ha observado anteriormente [16].
AsPC-1 células fueron transfectadas con un control negativo mímica, los miR-221 imitan, oligonucleótidos antisentido a miR-221 ( anti-miR-221) o TRPS1 siRNA. Las células se trataron luego con PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h y se sometieron a qRT-PCR de TRPS1. células AsPC-1 se transfectaron con un control negativo mímica, los miR-221 imitan, oligonucleótidos antisentido a miR-221 (anti-mir-221) o TRPS1 siRNA durante 3 días y se sometieron a análisis de transferencia de Western de TRPS1, ZEB2, E- cadherina y vimentina. células AsPC-1 fueron transfectadas con oligonucleótidos antisentido para el miR-221 (anti-mir-221). Las células se trataron luego con un control negativo o miR-221 imitador durante 3 días y se sometieron a QRT-PCR para ZEB2 (C), E-cadherina (D) y vimentina (E). células AsPC-1 se transfectaron con un control negativo imitan, los miR-221 oligonucleótidos antisentido o imitan a miR-221 (anti-mir-221). Las células se trataron luego con PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h y se sometieron a tinción de inmunofluorescencia para vimentina (F) y E-cadherina (G) Todos los tratamientos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado, y los resultados son muestra como las medias ± SD.
la inhibición de PDGF mediada por p27Kip1 de miR-221 promueve la proliferación celular
p27Kip1 es un miembro de la familia Cip /Kip de quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidores que funcionan para regular negativamente la progresión del ciclo celular de G1 a la fase S mediante la unión a CDK2 y complejos de ciclina e [23]. Para probar el papel de p27Kip1 en la proliferación celular AsPC-1, se redujo la p27Kip1 nivel endógeno por siRNA (si-p27Kip1) (Fig. 5A, B) y se midió el crecimiento celular durante 4 días (Fig. 5C). La proliferación de las células transfectadas-si-p27Kip1 fue significativamente mayor en comparación con las células control, lo que sugiere que la disminución de la expresión de p27Kip1 puede promover el crecimiento celular en las células AsPC-1. Por lo tanto, la hipótesis de que la promoción de PDGF-dependiente de la proliferación celular AsPC-1 podría ser mediada a través de la baja regulación de p27Kip1. El análisis cuantitativo de la tinción de PCNA mostró que la expresión p27Kip1 fue inhibida por PDGF-BB (20 ng /ml) después de 24 h de tratamiento, y la transfección de si-p27Kip1 aumentó el número de células en proliferación en un grado similar como tratamiento de PDGF (Fig. 5 C, D, E). MIR-221 ha sido previamente demostrado que inhibe p27Kip1 y promover la proliferación celular [13], [24], [25]. Por lo tanto, se investigó si la proliferación de PDGF mediada por las células AsPC-1 se ve afectada por la inhibición mediada por el miR-221 de p27Kip1. La transfección de la miR-221 imitan redujo significativamente la expresión de p27Kip1 (Fig. 5A, B) y la proliferación celular elevada (Fig. 5D, E), de manera similar a las células transfectadas con si-p27Kip1 (Fig. 5A, B, D, E ). Cuando endógeno miR-221 se agotó por anti-miR-221, el tratamiento PDGF-BB no reprimió la expresión de p27Kip1 (Fig. 5A, B). Por lo tanto, el aumento de PDGF-dependiente en la proliferación celular parece estar mediada por la inhibición de un objetivo específico de miR-221 y la baja regulación de p27Kip1
(A, B):. Se transfectaron células ASPC-1 con un control negativo imitar, los miR-221 oligonucleótidos mímica, antisentido para el miR-221 (anti-mir-221) o p27Kip1 siRNA. Las células se trataron luego con PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h y se sometieron a QRT-PCR (A) y análisis de transferencia Western (B) para p27Kip1. (C): células AsPC-1 fueron transfectadas con el control negativo o p27Kip1 siRNA y se someten al ensayo de proliferación celular MTT (Los resultados se indican como las lecturas de absorbancia a 490 nm). (C) (D, E): células AsPC-1 se transfectaron con un control negativo mímica, los miR-221 imitan, oligonucleótidos antisentido a miR-221 (anti-mir-221) o p27Kip1 siRNA. Las células se trataron luego con PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h y se sometieron a tinción con un anticuerpo conjugado con FITC contra el PCNA marcador de proliferación y DAPI (E). En total, se contaron 150 células por condición, y se presenta el porcentaje de células PCNA positivas (D). Todos los experimentos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado, y se muestran los resultados como las medias ± SD.
Discusión
Un número creciente de estudios sugiere fuertemente que el PDGF puede funcionar como un jugador clave en el desarrollo y la progresión de los cánceres humanos mediante la regulación de los procesos de proliferación celular, apoptosis, migración, invasión, la angiogénesis y la metástasis. Se ha informado de que la señalización de PDGF es frecuentemente desregulado en tumores malignos humanos, y la expresión de PDGF upregulated fue encontrado en páncreas, próstata, pulmón, renal, cáncer de ovario y cerebro [6]. En los últimos años, la señalización de PDGF se ha encontrado que desempeñan papeles importantes en la adquisición del fenotipo EMT en células de cáncer [6], [8], [26]. Además, se ha vuelto cada vez más claro que la EMT juega un papel importante en la progresión de cáncer y también es responsable de la resistencia de las células cancerosas a agentes quimioterapéuticos convencionales. Por lo tanto, la señalización de PDGF se ha considerado que es importante en tumores malignos humanos, y por lo tanto, la señalización de PDGF puede representar una nueva diana terapéutica, lo que sugiere que el desarrollo de agentes que se dirigen a la señalización de PDGF es probable que tenga un impacto terapéutico significativo en los cánceres humanos. Nuestro estudio demostró claramente que el tratamiento de PDGF-BB promueve la migración celular y la proliferación y dio lugar a la adquisición del fenotipo EMT por la sobre regulación de marcadores de células mesenquimales (ZEB1, ZEB2, Snail2, y vimentina) y la baja regulación de una célula epitelial marcador (E-cadherina) en las células AsPC-1. Por lo tanto, la orientación de señalización de PDGF puede inhibir la adquisición del fenotipo EMT, que dará lugar a la reversión de la resistencia a los medicamentos en el tratamiento de la enfermedad metastásica.
En el presente estudio, hemos demostrado, además, que el gen miR-221 la transcripción está regulada por la señalización de PDGF. La vía de PDGF es bien conocido como un modulador de la expresión de diversos genes de codificación de proteínas, pero miR-221 es el primer gen miRNA encontrado para ser regulada por PDGF. Es intrigante especular que el PDGF puede activar el miR-221 transcripción a través de la contratación de factor de transcripción asociado con microftalmia u otras proteínas de unión E-box. Se encontró que el miR-221 se indujo 2,5 veces después de 4 h de tratamiento con PDGF, y no se observaron tanto los transcritos primarios y productos intermedios de miR-221 tan pronto como 2 h después del tratamiento PDGF, lo que sugiere que miR-221 expresión se activa por la señalización de PDGF. miR-221 es altamente expresado en varias células cancerosas derivadas, incluyendo el carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata, y células de carcinoma de tiroides [14], [15]. Por otra parte, el miR-221 se ha demostrado que estimula varios aspectos de la patogénesis del cáncer, incluyendo metástasis, invasión y la auto-renovación [27], [28], [29]. Cuando la función de miR-221 fue bloqueada por los anticuerpos anti-miR-221, encontramos que el PDGF no alteró el nivel de la migración celular y la proliferación y el resultado en la adquisición del fenotipo EMT. Estos resultados confirman que miR-221 juega un papel esencial en el PDGF mediada epitelial-mesenquimal fenotipo de transición, la migración y el crecimiento de las células AsPC-1. MiR-221 y miR-222 comparten la misma secuencia de semillas, lo que indica un alto grado de solapamiento funcional entre estas dos ARNm.