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PLOS ONE: microbioma de cuello uterino y de citoquinas perfil en diversas etapas del cáncer de cuello uterino: un estudio piloto


Extracto

El cáncer cervical (CC) es causada por la persistencia de alto riesgo del virus del papiloma humano debido al microambiente tumoral mediada por citoquinas inmunosupresoras. microbiota vaginal determina la presencia de ciertas citoquinas localmente. Se evaluó la asociación entre la diversidad microbiota cervical y el diagnóstico histopatológico de cada etapa de CC, y se evaluaron los niveles de mRNA de expresión cervical de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α y IFN-γ a través el diagnóstico histopatológico y grupos bacterianos específicos. Se determinó la microbiota del cuello uterino por secuenciación de alto rendimiento de los amplificados 16S rDNA y clasificados en tipos de estado de la comunidad (CST). analiza diferencia media entre diversidad alfa y el diagnóstico histopatológico se llevaron a cabo, así como un análisis de β-diversidad en el diagnóstico histológico. la expresión de ARNm de citoquinas de cuello uterino se analizó a través de las CST y en los diagnósticos histopatológicos. Se encontró una diferencia significativa en la diversidad de la microbiota en mujeres negativas NCL-VPH frente a aquellos con lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) y CC (p = 0,006, p = 0,036) se evaluó .Cuando β-diversidad, las muestras de CC mostró la mayor variación dentro de grupos (p & lt; 0,0006) y la distancia más grande en comparación con los negativos NCL-VPH (p & lt; 0,00001). Las bacterias predominantes en las mujeres con citología normal eran
L
.
Crispatus
y
L
.
Iners
, mientras que para SIL, fue
Sneathia spp
. y para CC,
Fusobacterium spp
. Encontramos altos niveles cervicales medianas de la IL-4 y TGF-β1 mRNA en el CCT dominados por
Fusobacterium spp
. Estos resultados sugieren que la microbiota cervical puede estar implicado en la patología del cáncer cervical. Se necesitan más estudios de cohortes para validar estos hallazgos

Visto:. Audirac-Chalifour A, Torres-K Poveda, Bahena-Román M, Téllez-J Sosa, Martínez-Barnetche J, Cortina Ceballos-B, et al . (2016) y de cuello uterino microbioma de citoquinas perfil en diversas etapas del cáncer de cuello uterino: un estudio piloto. PLoS ONE 11 (4): e0153274. doi: 10.1371 /journal.pone.0153274

Editor: María Lina Tornesello, Istituto Nazionale Tumori, ITALIA

Recibido: 4 de diciembre de 2015; Aceptado: 25 Marzo de 2016; Publicado: 26 Abril 2016

Derechos de Autor © 2016 Audirac-Chalifour et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Pública, México y subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (MX) (CONACYT) Fondo septiembre CB -2011-01-169552, CONACyT-Fondo E0013 APOYO COMPLEMENTARIO Cátedras-2014-C01-245520 y CONACyT-FONSEC SSA /IMSS /ISSSTE-2014-C01-234149, México. Audirac-Chalifour agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) para la beca de maestría 2976418945. K Torres Poveda es CONACyT-Investigador del Instituto Nacional de Salud Pública (INSP), Cuernavaca, Morelos, México.

Conflicto intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer cervical (CC) es el cuarto cáncer más común en las mujeres y la séptima posición a nivel mundial, estimando un 485 000 nuevo. 236 casos y 000 muertes en 2013. CC causados ​​6,9 millones de años de vida ajustados por discapacidad (AVAD) en 2013 [1], y fue la segunda causa más común de muerte por cáncer entre las mujeres mexicanas en 2011 (10,4%) [2 ]. CC es causada por una infección persistente con el virus del papiloma humano de alto riesgo (HR-HPV). Sin embargo, se considera una condición necesaria pero no una causa suficiente para el desarrollo CC una infección de VPH-AR [3]. Los factores mecánicos, como las duchas vaginales o relaciones sexuales, y los factores biológicos, como la vaginosis bacteriana (VB) [4, 5], o infecciones de transmisión sexual (ITS) [6] alteran el microambiente vaginal y se han identificado como cofactores en la persistencia de una infección por VPH [7].

la gran mayoría de las mujeres infectadas HR-HPV nunca desarrollan CC porque una respuesta inmune adecuada es capaz de controlar la infección y prevenir su progresión a lesión precancerosa [8]. Esto sugiere que los factores adicionales actúan en conjunto con el HPV de influir en el riesgo de desarrollo de CC. Hasta el momento, los siguientes co-factores determinantes se han asociado a la aparición de la CC: factores socio-ambientales (barreras culturales, la pobreza extrema, las áreas de saneamiento deficientes, y el acceso limitado a la atención médica) [9], factores epidemiológicos (multiparidad, el uso de anticonceptivos orales durante más de cinco años, múltiples parejas sexuales y el tabaquismo) [10, 11], y los factores genéticos relacionados con el huésped (polimorfismos en genes de respuesta inmune, que determinan una respuesta inmune deficiente y la inmunosupresión local) [12- 14] . Por lo tanto, CC es una enfermedad compleja y multifactorial, y se necesita más investigación para mejorar nuestra comprensión de su etiología
.
Recientemente se ha propuesto que la microbiota vaginal anormal juega un papel importante en el desarrollo de neoplasia cervical [15] . Un estudio epidemiológico identificado
Chlamydia trachomatis
como un co-factor para el desarrollo de CC [16]. De manera similar, otros estudios muestran que algunas especies bacterianas parecen estar asociados con el desarrollo de otros tipos de cáncer, como el cáncer de colon; estos estudios también sugieren que varias especies bacterianas habitan preferentemente los sitios del tumor [17, 18].

Todavía hay varias lagunas en el conocimiento sobre la asociación entre microbioma vaginal y cervical y desarrollo CC [19]. evidencia basada en el cultivo bacteriano indica que algunos patógenos potenciales pro-oncogénicos, que pueden ser miembros de la microbiota comensal, contribuir a la iniciación del tumor y el desarrollo [20, 21].

CC es una enfermedad de larga evolución, y hay son etapas previas al mismo durante el cual se modifican las condiciones del entorno vaginal y cervical, vaginal incluyendo acidez y citoquinas patrón que conducen a un estado de inmunosupresión local. La presencia de Lactobacilli, un pH vaginal bajo (& lt; 4,5) y péptidos antimicrobianos son parte de los mecanismos de defensa presentes en el microambiente vaginal [22]. Cuando se produce un desequilibrio del sistema de defensa, surgen cambios fisicoquímicos y producen alteraciones histológicas de la mucosa vaginal y el epitelio cervical, todos los cuales las condiciones de una presión selectiva sobre la microbiota [23]. En un microambiente CC, la presencia de citoquinas inmunosupresoras (TGF-SS1, IL-10) favorece la persistenceof la infección por VPH [24, 25, 26, 27]. La mayoría de los estudios sobre el microbioma tracto genital femenino se han llevado a cabo a nivel vaginal y pocos estudios involucrar a los perfiles de citoquinas y la microbiota del cuello del útero. Un análisis genómico comparativo del microbioma vaginal ha identificado cambios en la diversidad de la microbiota entre las mujeres con infección genital por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), con o sin la vaginosis bacteriana (VB) [28] y en las mujeres embarazadas [29]. Además, se ha propuesto que el ecosistema microbiano vaginal y el perfil de citoquinas juegan un papel en la promoción de la displasia cervical [30], dado que una microbiota vaginal anormal se ha relacionado con la adquisición de una infección por VPH [31]. Sin embargo, pocos estudios se han llevado a cabo en el microbioma de cuello uterino como un modificador de la historia natural del VPH con respecto al desarrollo de lesiones cervicales y neoplasia cervical [32].

Teniendo en cuenta que se ha demostrado que las especies específicas de la microbiota cervicovaginales modulan la respuesta inmune inflamatoria en el tracto genital de la mujer de las mujeres negras de Sudáfrica sanos [33], es posible que el microbioma de cuello uterino está involucrado en la promoción de la expresión de citoquinas inmunosupresoras [34] .Hemos la hipótesis de que la infección por VPH y el desarrollo de SIL y CC se asocian con cambios en la diversidad microbiota y con patrones de expresión de citoquinas a nivel cervical. Nuestro estudio examinó la asociación entre la diversidad microbiota cervical y la composición, de acuerdo con un diagnóstico histopatológico de cada etapa de la historia natural de CC, y las cervicales niveles de expresión de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF -α e IFN-γ mRNA.

material y Métodos

diseño del estudio y población

un estudio transversal se llevó a cabo, a partir de muestras de un banco biológico construido entre 2008 y 2011 de los nuevos casos diagnosticados de lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) (n = 268 muestras positivas para el VPH); las mujeres con un Papanicolaou negativo y una colposcopia normal, como los controles (n = 205, 81 muestras positivas para el VPH VPH-negativas y 124), reclutados de Centro de Salud de la Mujer en el Estado de Morelos (
Centro de Atención para la Salud de la Mujer del Estado de Morelos
) en México entre junio de 2008 y noviembre de 2011, ya partir de los casos de carcinoma de células escamosas del cuello uterino (n = 171 muestras positivas para el VPH), reclutados del Servicio de Ginecología del Instituto Nacional del cáncer (INCan) en la Ciudad de México, entre septiembre de 2010 y diciembre de 2011. los comités de bioética y la investigación en INCan (número de referencia. INCan /CC /326 /10CB /609) y en el Instituto Nacional de Salud Pública (
Instituto Nacional de Salud Pública
-INSP; número de referencia: CI814) aprobó el estudio de línea de base durante el cual se construyó el banco biológico. Además, todos los participantes dieron su consentimiento informado para utilizar sus muestras biológicas para estudios adicionales de investigación. Cada sujeto fue entrevistado para el estilo de vida, factores socio-demográficos y reproductivos conocidos por estar asociados con un mayor riesgo de CC [12].

Por conveniencia metodológica, se seleccionaron 32 casos de este estudio, las lesiones no cervicales (NCL : n = 10 HPV-negativos; n = 10 HPV-positiva), lesiones intraepiteliales escamosas (n = 4 VPH-positivo) y CC (n = 8 VPH-positivo). Los criterios de inclusión para la selección sub-muestra relacionada con la historia clínica fueron: el reclutamiento del paciente en el mismo día de la menstruación (siete días posteriores al retiro menstruales período), el no uso de duchas vaginales y ninguna actividad sexual en los días anteriores de la toma de muestras. Además, no tener registros de uso de antibióticos o antifúngicos en los últimos 30 días anteriores a la toma de muestras. Otros criterios de inclusión fueron: VPH molecular + diagnóstico; ADN y ARN pureza e integridad adecuada para la secuenciación y la cuantificación de ARNm de QRT-PCR, y ser mexicano con los padres y abuelos mexicanos para asegurar la ascendencia similar. El único criterio de exclusión fue no tener suficientes lecturas. "Consideramos 1 000 como el umbral, después de realizar el análisis de la secuencia de la bioinformática. características socio-demográficas y reproductiva-sexuales de la población estudiada se presentan en la Tabla 1. Todos los sujetos del estudio eran mujeres mexicanas cuya edad oscilaba entre 22 y 61 años. Hubo una diferencia significativa entre los grupos en relación con el método anticonceptivo y la prueba de VPH positiva. CC pacientes no informaron el uso de métodos anticonceptivos con mayor frecuencia que los pacientes NCL. En cuanto a los casos de SIL, los genotipos de VPH más prevalentes fueron HR-HPV (VPH 16 o no 18), mientras que entre los pacientes CC genotipo más frecuente fue VPH 16.

Características del banco de muestras biológicas

se tomaron muestras de cuello del útero de la mujer siete días después de la retirada de las reglas. El banco biológico utilizado para este estudio se compone de muestras de ADN y ADNc extraído de epitelio cervical raspado hisopos de mujeres diagnosticadas con NCL y a partir de biopsias de células frescas de mujeres con diagnóstico de SIL y CC. ADN genómico fue extraído de los raspados epiteliales cervicales y biopsias previamente digerido con proteinasa K, utilizando el kit de purificación de ADN genómico (Fermentas Ciencias de la Vida, Vilnius, Lituania). Se tomaron todas las medidas posibles para evitar la contaminación cruzada de las muestras durante la extracción de ADN. la concentración de ADN y la pureza se evaluó por Thermo Scientific NanoDropTM 1000 espectrofotómetro (260/280) y la integridad del ADN se determinó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%. ARN total fue aislado de muestras cervicales utilizando el reactivo Trizol de Invitrogen. la síntesis de ADNc se llevó a cabo en presencia de 200 U de M-MLV transcriptasa inversa y 2,5 ug de RNA total usando condiciones estándar. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de reacción de 25 l que contenía 1 l de cDNA, 0,2 mM de dNTPs, 15 pmol de cada cebador, 2,5 l de tampón de reacción and1U de ADN Taq recombinante de la polimerasa. Los cebadores para la limpieza humano GAPDH gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (450 pb) se utiliza para verificar la integridad de ADNc.

especímenes cervicales se probaron previamente para el VPH. fragmentos de ADN viral de las muestras se amplificaron por PCR usando cebadores consenso MY09 /MY11 [35], LIC1 /LIC2 [36], y GP5 /GP6 [37], que flanquean la región L1 de la cápside de HPV. amplificación por PCR de GAPDH (556pb) se utilizó como un control interno para la calidad del ADN. Las líneas celulares que expresan el VPH-16 (SiHa) y HPV-18 (HeLa) se utilizaron como controles positivos. Desionizada H
2O sirvió como control negativo. Todos los productos fueron analizados por electroforesis en geles de acrilamida al 6%. Las muestras positivas se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5%. La banda de ADN obtenido se extrajo y se purificó con el MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y se secuenció utilizando el método de Sanger. Las secuencias de HPV fueron analizados por BLAST. VPH se clasifican de acuerdo a sus patrones filogenéticos en tipos de riesgo bajo y alto: HPV16 y HPV18. estado del VPH se confirmó con el VPH II ensayo de detección de HR Anyplex
TM de Seegene
®, basado en multiplex PCR en tiempo real, TOCE y DPO tecnología de pares de cebadores, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. [38]

Ética declaración

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados ​​en la Declaración de Helsinki. Fue aprobado por la Investigación, Ética y Comités de Bioseguridad en el INSP (IC: 1143). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes

Análisis de la expresión de ARNm de citoquinas cervical

Una amplificación de QRT-PCR se realizó por duplicado para el análisis de la expresión génica con las siguientes sondas TaqMan:. GAPDH (ID -Hs99999905_mL), IL-4 (ID-Hs00174122_mL), IL-6 (ID-Hs00174131_mL), IL-10 (ID-Hs00961622_mL), TGF-β1 (ID-Hs00961622_mL), TNF-α (ID-Hs00174128_mL) y IFN -γ (ID-Hs00174143_mL). La mezcla de amplificación se preparó añadiendo 100 ng de cada muestra de cDNA a una mezcla de reacción final de 10 l que contenía 5μl de TaqMan PCR Master Mix para la expresión, 0,5 l de sonda y 3,5 l de agua de grado molecular libre de DNasa. Los ciclos de amplificación (realizados en un StepOnePlus ™ de Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) fueron las siguientes: 94 ° C durante 10 minutos, 40 ciclos a 94 ° C durante un minuto, 54 ° C durante un minuto, 72 ° C durante un minuto y 30 segundos, seguido de 72 ° C durante 15 minutos. GAPDH se utilizó para normalizar la cantidad de IL-4, IL-6, IL-10, ARNm de TGF-beta 1, TNF-a e IFN-gamma presentes en cada muestra [39]. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica estimuladas con fitohemaglutinina durante 72 horas para determinar las curvas de rango dinámico de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α y la expresión de IFN-γ; todas las curvas de calibración se realizaron por triplicado. El nivel de expresión de ARNm para cada citoquina planteamos estudiar se calculó utilizando la cuantificación relativa con el método comparativo Ct (2-Ct), teniendo GAPDH como el gen endógeno. Las muestras se analizaron por duplicado.

secuenciación de alto rendimiento de 16S rDNA amplicones

amplicones de ~ 456 pb que contiene regiones variables V3-V4 de 16S rRNA genes se obtuvieron para el ADN Bibliotecas de preparación. Cebadores 347F adelante 5'-GGAGGCAGCAGTRRGGAAT-3 'y 5'-803R inversa CTACCRGGGTATCTAATCC-3', descrito por Nossa, se utilizaron [40]. Una primera, la PCR se realizó con las siguientes condiciones: se añadieron 50 ng de plantilla a partir de cada muestra de ADN a una mezcla de reacción final de 30 l que contenía tampón de reacción 1X, mM MgSO 2.5
4, 1 mM de dNTP, 0,2 DNA Taq Platinum U la polimerasa de alta fidelidad (Invitrogen) y 5 pmol /l de los cebadores. El programa de amplificación fue el siguiente: 94 ° C durante 3 minutos, luego 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 68 ° C durante 30 segundos, seguido de 68 ° C durante 5 minutos. Los amplicones se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Las bandas de ADN obtenidos se purificaron por MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania).

amplicones fueron re-amplifican y procesan con los mismos cebadores vinculados a un adaptador de protocolo de secuenciación 454 seguido de un 6- identificador múltiplex mer y por el cebador 347F. El cebador inverso fue el mismo para todas las reacciones vinculadas al adaptador B del protocolo 454 secuenciación. Las condiciones de reacción fueron como sigue: 0,0625 ng de cada muestra de ADN a una mezcla de reacción final de 30 l que contenía 1X tampón de reacción, MgSO 2,5 mM
4, 1 mM de dNTP, 0,2 U Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad (Invitrogen) y 5 pmol /l de cebadores 347F y 803R. ciclos de amplificación fueron las siguientes: 94 ° C durante 3 minutos, luego 15 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 68 ° C durante 30 segundos, seguido de 68 ° C durante 5 minutos. La electroforesis en gel se realizó en gel de agarosa al 1,5% para visualizar la integridad de los productos amplificados. Los fragmentos de ADN se purificaron por MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y después cuantificados y evaluados. Los amplicones se agruparon en ocho bibliotecas y se mezclan de manera equimolar. Posteriormente, las bibliotecas fueron purificados con Ampurebeads XP (Beckman Coulter, Inc). Se realizaron entonces la titulación y el rendimiento de cálculo Emulsión PCR para determinar el volumen de perlas de cargar en placas de secuenciación. Posteriormente, se llevó a cabo la secuenciación masiva en la plataforma Genome Sequencer titanio Roche-454 (AppliedScience).

Bioinformática análisis

Las secuencias en bruto de la región V3-V4 del gen 16SrRNA generados para cada uno de amplificación fueron procesados ​​con el software complementario Roche-454, y * se generaron archivos .sff. Alta calidad lee fueron seleccionados con los siguientes criterios: lee con más de cinco bases consecutivas con puntajes menores de 20 en la escala Qphred en un 30 bases ventana en movimiento fueron descartados. El control de calidad (QC) fue supervisada con la escritura de Thomas R Girke que utiliza una biblioteca Quality.R FASTQ para trazar la distribución de la calificación asignada a cada base de acuerdo con su posición en la escala logarítmica Qphred [41]. Una vez que se obtuvieron los archivos de calidad y secuencias por separado de los archivos * .sff primas, demultiplexación se llevó a cabo en QIIME para identificar las secuencias que pertenecen a cada muestra de acuerdo con su identificador molecular (MID) [42].

Las secuencias fueron agrupados en unidades taxonómicas operacionales (Otus) utilizando el algoritmo de alineamiento de secuencias para PyNAST. Todas las secuencias que tenían una similitud de 99% o más se consideraron una sola OTU [43]. Una secuencia representativa de cada OTU fue elegido para la identificación taxonómica más tarde. Taxa fueron asignados con el algoritmo Uclust [44], utilizando la base de datos Genes Green (liberación 99% en mayo de 2013) como referencia, de modo que cualquier secuencia representativa alineada con una similitud del 99% a una secuencia de referencia se le asigna el nombre misma especie [ ,,,0],45].

secuencias que no se alinean con la referencia se extrajeron a otro archivo para
de novo
montaje y para ser considerado en el cálculo de la diversidad. Para determinar si la composición de la microbiota era capaz de agrupar las muestras de diagnóstico, una agrupación jerárquica sin supervisión basado en la disimilitud de Bray Curtis entre OTU abundancia de cada muestra (Tabla S1) se realizó con R paquetes y se representa como un mapa de calor. La diversidad alfa se describe el uso de una diversidad filogenética (PD) árbol entero y cálculo de un índice de diversidad de Shannon (H ') y su rarefacción. Una matriz de distancia y de componentes principales (PC) se calcularon con UniFrac para definir la diversidad beta [46]. Por otra parte, un análisis de coordenadas (PCoA) se representa gráficamente con guiones QIIME y se visualizó en emperador [47].

clasificado composición de la microbiota de acuerdo al tipo de comunidad del estado (CST) en base a los taxones predominante que se encuentra en las muestras. Un CST cervical es un grupo de estados de la comunidad (la composición y abundancia de una comunidad de cuello uterino) que son similares en cuanto a los tipos y las abundancias relativas de los filotipos observados [48]. La agrupación de los estados de la comunidad se llevó a cabo por medio de un agrupamiento jerárquico basado en la disimilitud de Bray Curtis entre todos los pares de estados de la comunidad y un promedio de vinculación.

El análisis estadístico

Las variables relevantes fueron comparados entre NCL vs SIL y NCL vs CC, utilizando
χ

2 y Kruskal-Wallis para las variables categóricas y continuas, respectivamente. pruebas t de Student se llevaron a cabo para determinar la diferencia media entre el índice de diversidad de Shannon o toda la diversidad de árboles filogenéticos y el diagnóstico histopatológico. Se utilizaron modelos de regresión logística para determinar la asociación entre el diagnóstico histopatológico y el índice de diversidad de Shannon y el diagnóstico histopatológico (NCL independientemente del estado del VPH y SIL /CC) y todo PD árbol, ajustando por edad, paridad, método anticonceptivo y el VPH-genotipo .

Se estimó el riesgo diversidad alfa como odds ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95% (IC). La diferencia media estimada de unidades perforadoras (Shannon índice de diversidad) en el cuello uterino entre SIL o CC y NCL independientemente del estado del VPH se evaluó mediante un análisis de regresión lineal ajustando por edad, método anticonceptivo y el VPH-genotipo. Se evaluó la variación de las distancias UniFrac ponderados utilizando una prueba de Kruskal-Wallis para comprobar la diversidad beta dentro de cada grupo de diagnóstico histopatológico. Una prueba de Wilcoxon Mann-Whitney se llevó a cabo para evaluar la significación estadística de las distancias ponderadas UniFrac entre SIL /CC vs NCL-VPH negativo.

cervical expresión de IL-4, IL-6, IL-10, TGF -β1, TNF-α y el ARNm de IFN-γ se analizó por diagnóstico histopatológico (NCL vs SIL y NCL vs CC) mediante el test de Wilcoxon Mann-Whitney. expresión de cuello del útero de la IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α y IFN-γ mRNA se analizó a través de grupos de CST por medio de la prueba de Kruskall Wallis. Por último, se realizó un análisis de correlación directa entre el índice de diversidad de Shannon y la expresión cervical de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α y el ARNm de IFN-γ. Hemos realizado todos los análisis estadísticos utilizando el software estadístico Stata, versión 13.0 (StataCorp, Collage de la estación, TX, EE.UU.).

Resultados

patrón general de las comunidades en la muestra cervical

después del control de calidad, hubo 311.863 lecturas de alta calidad distribuidos de forma desigual a través de las muestras. Para abordar esta cuestión, 1000 submuestras aleatorias se obtuvieron de los datos en bruto de cada muestra, y se utilizaron para el análisis adicional de la bioinformática. curvas de rarefacción diversidad alfa (Figura A en S1 Archivo) muestran que después de calcular H'in más de 400 lecturas, la diversidad submuestra no aumentó; Por lo tanto, las secuencias de 1000 tenían la suficiente profundidad secuenciación para este estudio. En el mapa de calor sin supervisión (figura 1), las muestras de la agrupación NCL juntos y con independencia de la condición de VPH, mostró que las mujeres VPH-negativos tenían una mayor proporción de
Lactobacillus crispatus gratis (46%) y una más pequeña de
Iners Lactobacillus
(14,9%), mientras que las mujeres VPH-positivas tenían proporciones de 13,3% y 2,1%, respectivamente. Curiosamente, estas proporciones parecían cambiar con la presencia de HPV. Por otra parte,
L
.
Crispatus
se encontró en proporciones más pequeñas en el SIL (14,4%) y CC (1,3%), mientras que
L
.
Iners
se redujo a 2.1% en el SIL y no se detectó en CC.

mapa de calor sin supervisión de la abundancia relativa de los taxones microbiano que se encuentra en las comunidades microbianas del cuello uterino de 29 sujetos, basado en la Bray Curtis disimilitud métrica. Las especies presentes en la abundancia relativa de 1% en al menos una muestra se indican en el eje X. La primera barra en el lado izquierdo representa el tratamiento de la siguiente manera: rojo-VPH-negativo sin lesión; azul-VPH-positivo sin lesión; naranja-lesión escamosa intraepitelial de cuello uterino; cáncer verde-cervical. CST se representan en la segunda Barside izquierda; rosa-CST III, dominado por
Pseudomonas oleovorans
; cian-CCT II dominado por
L
.
Iners
; naranja-CST I dominado por
L
.
Crispatus
; verde-CST IV dominado por
Sneathia
; azul-CCT V dominado por
G
.
vaginalis
; amarillo-CST VIII dominado por
Fusobacterium spp
.; rojo-CST VI dominado por
S
.
agalactiae
, y púrpura-CST VII dominado por
Fusobacterium necrophorum
. nombres de las muestras aparecen en el lado derecho de la gráfica. Los cladogramas en la parte superior de los nombres de las especies indican las relaciones evolutivas entre las especies aproximadas. CST: Comunitaria Tipo de Estado. Dx:. El diagnóstico histopatológico

Otras especies de
Lactobacillus
,
L
.
Jensenii
y
L
.
vaginalis
sólo se encontraron en las muestras de mujeres con NCL.
Gardnerella vaginalis
se encuentra principalmente en mujeres VPH negativa con NCL (11,5%), y disminuyó gradualmente a través de los grupos de VPH-positivo (6,9%), SIL (8,1%) y CC (3,3%).
S
.
agalactiae
representaba más del 90% de la composición de la microbiota de dos de las muestras.
Pseudomonas oleovorans
se observó en una abundancia relativa de 19% sólo entre las mujeres VPH positivas con NCL. Las bacterias de la
Fusobacteriales
fin se encontraron sólo en los grupos SIL y CC. En el grupo SIL,
Fusobacterium spp
. muestra una abundancia relativa de 6,3%;
Sneathia spp
, 26,6%.;
Shuttleworhia satelles
, 8,7%; y
Megasphaera elsdenii
, 10,4%; mientras que la abundancia relativa de los mismos microorganismos en el grupo de CC era la siguiente: 14%, 12.9%, 0% y 2,2%, respectivamente.
Fusobacterium necrophorum
sólo se observó en el grupo de CC (14,2%). Esto apunta al hecho de que la diversidad microbiota y la composición son diferentes entre los grupos analizados. Para confirmar esto, se analizaron diversidad alfa y beta.

Las comunidades cervicales se clasificaron en ocho equipos de apoyo de acuerdo con las bacterias dominantes, como se muestra en la Tabla 2. CST I isdominated por
L
.
Crispatus gratis (21%), CCT II por
L
.
Iners gratis (17%), CST III de
Pseudomonas oleovorans gratis (10%), CST IV por
Sneathia spp
. (17%), CCT V por
G
.
vaginalis gratis (7%), CST VI por
Streptococcus agalactiae gratis (7%), CST VII por
F
.
necrophorum gratis (7%), y el CST VIII por
Fusobacterium spp
. (14%). A excepción de CST VI, todas las muestras se agruparon de acuerdo con el diagnóstico histopatológico. CST estaba compuesto principalmente de mujeres VPH-negativas con NCL; CST II y III fueron compuestos predominantemente de mujeres VPH positivas con NCL; CST IV se compone predominantemente de los casos SIL; CST V se compone principalmente de las mujeres con NCL, independientemente de su condición de VPH; CST VIII estaba compuesta en su mayor parte de los casos de CC, y el CST VII incluyó sólo casos de CC (figura 2).

Gráfico de barras de la abundancia relativa de las especies por grupo.

Comparación de la diversidad microbiota cervical a través de etapas CC

diversidad alfa.

a pesar de que las curvas de rarefacción para el índice de Shannon (Fig a en S1 File) mostraron una diversidad mayor en los grupos CC y SIL que entre las mujeres VPH-negativas y positivas a los barcos de NCL, se encontró que la diversidad en sí misma, lo que representa sólo por la riqueza y la abundancia relativa, no es suficiente para determinar el grado de CC developmentof. Sin embargo, cuando se trata de índices que tienen en cuenta las métricas filogenéticos como un árbol entero PD, se observó una diferencia significativa en cuanto a la diversidad filogenética entre el VPH-negativas NCL y SIL y entre el VPH-negativas NCL y CC (valores de p: 0,006 y 0,036, respectivamente) (Tabla 3). En otras palabras, la composición de la microbiota cervical es diferente entre los grupos. Los diagramas de caja de la figura 3 se muestra la distribución del índice de diversidad de Shannon y todo el árbol PD a través de grupos de diagnósticos histopatológicos. El índice de diversidad de Shannon muestra una tendencia creciente, pero no es significativo. El árbol entero PD muestra una diferencia significativa entre NCL VPH-negativas y SIL y entre NCL y CC VPH-negativas. grupos SIL y CC Visualización de la más diversa microbiota cervical. No se encontró una asociación entre el diagnóstico histopatológico y el índice de diversidad de Shannon (NCL independientemente de la condición de VPH y SIL /CC), ni entre el árbol entero PD y el diagnóstico histopatológico de acuerdo con el análisis de regresión logística (Tabla 4). Al evaluar la asociación entre el índice de Shannon la diversidad de las muestras cervicales microbioma y el diagnóstico histopatológico, la diferencia media estimada de unidades de bit entre CC y NCL fue de 1,11 (IC del 95%, 0,057-2,165, (p = 0,04) (Tabla 5) . Esto confirma que la diversidad microbiota en los casos de CC es más alta que en el grupo NCL.

los diagramas de caja muestran la distribución de la H '(unidades de bit) y los valores de PD a través de todas las muestras.


β-diversidad.

el PCoA repercute de manera consistente mostró que el microbioma de cuello uterino es notablemente diferente en cada etapa de la historia natural de CC (figura 4A). los tres PC donde trazan en 2D para la comparación por pares; PC1 representaron el 33,44% de la varianza entre las muestras; PC2 de 26,85% y 10,38% para el PC3 la presencia de
Fusobacterium spp
,
Sneathia spp
. y
Megasphaera spp
. estaba relacionado con la PC1. La presencia de
Las bifidobacterias spp
. y
Pseudomonas spp
. estaba relacionado con PC2. La ausencia de
Pseudomonas spp
.,
Fusobacterium spp
. y la presencia de las bacterias de la Red

Bifidobacteriaceae
familia estaban relacionados con PC3, de acuerdo con la matriz de factor de carga calculada (Tabla A en S1 Archivo).. PCoA perfil del diagnóstico histopatológico muestra con UniFrac distancias ponderadas. Cada cifra representa el color de acuerdo a su diagnóstico histopatológico de una muestra. Los círculos rojos representan muestras NCL VPH-negativas; cuadrados azules representan muestras NCL VPH-positivo; triángulos de color naranja representan SIL y triángulos verdes representan CC. A1. de componentes principales (PC) -1 representó el 33,44% de la variación en la composición de la microbiota debido a la presencia de
Sneathia spp
. y
Fusobacterium spp
. A2. PC-2 representó el 26,85% de la variación enla composición de la microbiota debido a la presencia de
Bifidobacteria spp
. y
Pseudomonas spp
. A3. PC-3 representó el 10,38% de la variación en la composición de la microbiota debido a la presencia de
Lactobacillus spp
. y
Streptococcus spp
. B. B1. La variación de las distancias UniFrac ponderados dentro de cada grupo diagnóstico histológico. B2.

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